基于宏基因組測序的檢測技術(shù)診斷呼吸道感染性疾病92例

李加雄，李丹，金曉菲，刁振華，盧惠倫，游世倫

作者單位：深圳市龍崗區(qū)第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 深圳518000

感染性疾病是導致人類死亡的關(guān)鍵原因之一，其中呼吸道感染具有發(fā)病迅速、病情較重以及并發(fā)癥較多等特點，是導致感染性疾病病人死亡的首要原因［1］。有研究報道顯示，早期準確、快速地識別病原微生物種類是合理應用抗感染藥物的重要依據(jù)，亦是改善病人預后的重中之重［2］。然而，受病原微生物種類多樣性的影響，呼吸道感染性疾病病人的病原體往往不明確，現(xiàn)有的病原學檢測手段仍相對有限［3］。傳統(tǒng)的病原體檢測技術(shù)存在一定的局限性，加之重癥病人往往合并多重感染以及臨床抗菌藥物的濫用，在一定程度上增加了病原體鑒定難度［4］。臨床微生物培養(yǎng)以及核酸擴增技術(shù)是目前臨床上用以診斷呼吸道感染性疾病病人病原微生物的重要手段，但上述兩種方式均存在一定的局限性。故此，尋求一種更為高效、準確的診斷方式顯得尤為重要，亦是目前臨床研究的熱點。基于宏基因組測序的檢測技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種快速、準確獲取核酸序列信息的技術(shù)，且具有靈敏度高、檢測周期快以及不受人類基因組DNA影響等優(yōu)勢，已成為重要的病原學診斷技術(shù)之一，有成為快速、普適的感染性疾病病原體鑒別手段的潛在價值［5-6］。鑒于此，本研究通過研究基于宏基因組測序的檢測技術(shù)對呼吸道感染性疾病的診斷作用，旨在為臨床檢測提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年6月至2021年7月深圳市龍崗區(qū)第二人民醫(yī)院收治的呼吸道感染性疾病病人92例。其中男性57例，女性35例；年齡（41.29±6.63）歲。入組標準［7］：（1）所有受試者年齡范圍為6～77歲，男女不限；（2）均為臨床可疑呼吸道感染，且經(jīng)醫(yī)生判斷需行支氣管肺泡灌洗（BALF）病原學診斷；（3）所有受試者均可耐受支氣管鏡檢查；（4）入組前并未接受任何抗感染治療。剔除標準：（1）病原學診斷明確或通過經(jīng)驗性治療獲益者；（2）臨床高度懷疑RNA病毒所致感染；（3）意識障礙或合并精神疾病者；（4）正參與其他研究者。

本研究獲深圳市龍崗區(qū)第二人民醫(yī)院倫理委員會批準（批號19261），病人或其近親屬對研究方案簽署知情同意書。

1.2 研究方法 （1）傳統(tǒng)病原學檢查：即由臨床醫(yī)生綜合評估病人具體情況，選用目前已有的診斷方式。如針對細菌、真菌采用培養(yǎng)、涂片鏡檢法以及抗原檢測試驗；針對結(jié)核或肺結(jié)核分枝桿菌采用抗酸染色、培養(yǎng)及結(jié)核的基因檢測；針對病毒和非典型病原體實施核酸檢測。（2）基于宏基因組測序的檢測：采用高通量測序技術(shù)（美國iIIumina公司），由醫(yī)院同一名經(jīng)驗豐富的醫(yī)師對樣本中的微生物DNA序列開展宏基因組分析，并將其和數(shù)據(jù)庫中的微生物核酸序列實施比對，綜合受試者臨床表現(xiàn)和實際情況，完成病原微生物的鑒定。該檢測技術(shù)最低檢測限為5～50 copies/mL，檢測范圍涵蓋當前已知的病原體包括細菌6 047種，病毒7 098種，真菌812種，寄生蟲138種，支原體96種，衣原體85種，立克次氏體90種，分枝桿菌94種。

1.3 評價指標 最終診斷的判定：以所有受試者出院時診斷結(jié)果作為“金標準”，最終診斷在所有受試者出院時由所在科室充分討論后明確，并參考臨床表現(xiàn)特點、傳統(tǒng)微生物檢測結(jié)果、基于宏基因組測序的檢測結(jié)果、組織病理學結(jié)果以及治療效果等確定。

1.4 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)處理選擇SPSS 22.0軟件。計量資料以表示，采用正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布，行t檢驗。計數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同檢測方式檢出病原體情況對比 宏基因組測序檢測共檢出45例病原體陽性，傳統(tǒng)檢測方式共檢出40例病原體陽性，兩種檢測方式對細菌、真菌、巨細胞病毒、結(jié)核分枝桿菌以及非結(jié)核分枝桿菌的檢出率對比均差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；宏基因組測序檢測的復數(shù)病原檢出率為19.57%（18/92），高于傳統(tǒng)檢測方式的8.70%（8/92），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同檢測方式檢出病原體情況對比/例（%）

2.2 不同檢測方式診斷呼吸道感染性疾病的結(jié)果分析 宏基因組測序檢測技術(shù)共檢出呼吸道感染性疾病47例，其中2例誤診，1例漏診，傳統(tǒng)檢測方式共檢出呼吸道感染性疾病48例，其中8例誤診，6例漏診。見表2。

表2 不同檢測方式診斷呼吸道感染性疾病結(jié)果分析/例（%）

2.3 不同檢測方式診斷呼吸道感染性疾病靈敏度、特異度及準確度對比 宏基因組測序檢測診斷呼吸道感染性疾病靈敏度、特異度及準確度分別為97.83%（45/46）、95.65%（44/46）、96.74%（89/92），均高于傳統(tǒng)檢測方式的86.96%（40/46）、82.61%（38/46）、84.78%（78/92），均差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表3。

表3 不同檢測方式診斷呼吸道感染性疾病靈敏度、特異度及準確度對比/%

3 討論

呼吸道感染性疾病一直以來均是全球范圍內(nèi)重要致死性疾病之一，世界衛(wèi)生組織（WHO）相關(guān)統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，2016年全世界死于感染性疾病的病人突破5 600萬，其中呼吸道感染性疾病死亡人數(shù)占據(jù)一定比例［8-10］。呼吸道感染性疾病的病原體相對復雜，涵蓋細菌、病毒、真菌以及寄生蟲等，而當前的臨床微生物檢測手段仍以培養(yǎng)、染色鏡檢等傳統(tǒng)方式為主，盡管近年來核酸擴增檢測以及分子免疫學檢查等檢測手段應運而生，但存在樣本處理過程較為復雜、檢查費用較為昂貴以及可檢測病原體種類不多等不足之處，從而可能增加了感染性疾病的病原學診斷、病情判斷以及治療方案制定等的難度［11-13］。相關(guān)研究報道顯示，臨床上仍有部分感染性疾病病人病原體較難明確［13］。宏基因組測序技術(shù)主要是指將高通量測序技術(shù)應用于臨床微生物檢測中，其可通過直接從檢測樣本中提取所有微生物核酸，從而實施無差別、無選擇性的大規(guī)模測序，并將測序信息和已知微生物數(shù)據(jù)庫進行比對，繼而為臨床病原體的鑒別診斷提供可靠依據(jù)［14-16］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，宏基因組測序檢測診斷呼吸道感染性疾病靈敏度、特異度及準確度均高于傳統(tǒng)檢測方式，差異有統(tǒng)計學意義。這在既往相關(guān)研究報道中得以佐證［17-18］，相較于傳統(tǒng)檢測方法而言，宏基因組測序檢測技術(shù)診斷呼吸道感染性疾病的效能較佳?？紤]原因，宏基因組測序檢測技術(shù)不依賴病原體培養(yǎng)結(jié)果，同時無須對可疑病原體標志核酸序列實施靶向擴增，從而可在最大限度上保證檢測結(jié)果的客觀性以及全面性，是對傳統(tǒng)實驗室檢測手段的有效補充。另有研究報道指出［19-21］，宏基因組測序相較于傳統(tǒng)檢測方式的優(yōu)勢之一是檢測時間較短，目前宏基因組測序獲取病原體遺傳信息的時間往往在48 h內(nèi)，平均時間在24 h左右，明確病原體最短時間僅需9 h，而傳統(tǒng)病原體檢測方式的時間普遍需要3～5 d。較短的檢查時間提示了臨床醫(yī)生可更快地評估病原體，繼而為臨床治療方案的制定提供參考依據(jù)，這對減少廣譜抗菌藥物的應用以及改善病人預后均有極大益處。另外，宏基因組測序檢測共檢出45例病原體陽性，傳統(tǒng)檢測方式共檢出40例病原體陽性，兩種檢測方式對細菌、真菌、巨細胞病毒、結(jié)核分枝桿菌以及非結(jié)核分枝桿菌的檢出率對比均不明顯；宏基因組測序檢測的復數(shù)病原檢出率高于傳統(tǒng)檢測方式。這提示了宏基因組測序檢測呼吸道感染性疾病病原體的價值較高，尤其是在檢測復數(shù)病原中的效果更佳。究其原因，可能和該檢測方式診斷病原體的非培養(yǎng)依賴性以及無偏移性密切相關(guān)。然而，將宏基因組測序技術(shù)推廣普及至常規(guī)實驗室檢測工作中，尚且存在幾點亟待解決的問題：（1）檢測流程標準化，包括標本采集和保存、核酸序列提取和污染物處理、高效且準確的生物信息學分析；（2）如何降低硬件設(shè)施配置要求，縮短周轉(zhuǎn)時間，提高檢測靈敏度；（3）減少檢測費用，加強人工操作的針對性培訓；（4）結(jié)果判定指導等；（5）宏基因組測序結(jié)果無法直接實現(xiàn)感染病原體的確診，仍需臨床醫(yī)師結(jié)合病人實際情況進行最終診斷，從而可能存在誤診的風險。

綜上所述，基于宏基因組測序的檢測技術(shù)應用于呼吸道感染性疾病的診斷中可獲得較為理想的效果，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)檢測方式，具有較高的臨床推廣應用價值。