重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)角蛋白酶的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化

利剛慧， 劉俊杰， 彭帥英 ， 梁穎茵， 鄢陸琪， 李昆太

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江 524088；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌 330045）

角蛋白是動物毛發(fā)和甲角的主要成分， 其是自然界中繼纖維素類和甲殼素類之后產(chǎn)量第三大的蛋白質(zhì)類有機(jī)聚合物（Bealer 等，2020）。角蛋白富含各類氨基酸，除高達(dá)10% ～14%的半胱氨酸外，還含有精氨酸、絲氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸等必需氨基酸（Hassan 等，2020）。 國外將來自家禽加工廠和屠宰場的羽毛、毛發(fā)和其他角化副產(chǎn)品歸類為第三類動物副產(chǎn)品，這意味著它們屬于對人體和動物健康風(fēng)險程度較低的原材料（Verma，2017）。 因此，角蛋白被視為潛在的優(yōu)良蛋白質(zhì)或氨基酸資源，可資源化應(yīng)用于飼料、肥料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)。

由于角蛋白分子富含相互交聯(lián)的二硫鍵、氫鍵以及疏水氨基酸，致使其結(jié)構(gòu)極為致密，不僅不溶于水、弱酸、有機(jī)溶劑，而且不易被胰蛋白酶或胃蛋白酶等常規(guī)蛋白水解酶水解， 給其資源化利用帶來極大困難（De Oliveira 等，2020）。目前工業(yè)降解角蛋白的方式主要有高溫高壓水解法、 酸堿水解法和物理膨化法，但這些方法存在能耗高、氨基酸營養(yǎng)損失大和環(huán)境二次污染等諸多缺點(diǎn)（Lazarus 等，2021）。 角蛋白酶系一種可特異性降解角蛋白的酶類，不僅綠色環(huán)保、經(jīng)濟(jì)實(shí)用，而且不會破壞氨基酸的天然結(jié)構(gòu)， 在角蛋白降解領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力和生態(tài)價值（Srivastava等，2020）。 角蛋白酶產(chǎn)生菌的來源與分布十分廣泛，在細(xì)菌、放線菌和真菌中均發(fā)現(xiàn)有角蛋白酶的產(chǎn)生（Gupta 等，2006）。 目前發(fā)現(xiàn)的角蛋白酶大多產(chǎn)于細(xì)菌，其中以芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）為主，如地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、短小芽孢桿菌（B.pumilus）、解淀粉芽胞桿菌（B.amyloliquefaciens）和蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）等（Su 等，2020；Li 等，2019）。

然而，產(chǎn)量低、活性差、性質(zhì)弱一直是制約角蛋白酶工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的問題 （蔣少龍等，2019）。 尤其是野生型產(chǎn)角蛋白酶菌株的酶表達(dá)量不高（胡洪，2013），難以滿足工業(yè)化所需。近年來， 隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，研究學(xué)者們對角蛋白酶的分子研究主要集中在角蛋白酶的異源表達(dá)和角蛋白酶分子改造兩個方面，極大促進(jìn)了角蛋白酶穩(wěn)定性和產(chǎn)量的提高（Su 等，2020）。 目前已報道的用于角蛋白酶異源表達(dá)的宿主菌主要有大腸桿菌、芽孢桿菌和畢赤酵母等。 其中，枯草芽孢桿菌因其具有完整的蛋白質(zhì)折疊分泌機(jī)制，且在表達(dá)來源于芽孢桿菌屬的角蛋白酶基因時不存在密碼子偏好性問題，在異源表達(dá)角蛋白酶方面有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢（Liu 等，2014）。 例如，Peng 等（2020）將來源于地衣芽孢桿菌BBE11-1 （B.licheniformis BBE11-1)的角蛋白酶基因KerZ1 在枯草芽孢桿菌WB600中分泌表達(dá)， 并通過優(yōu)化工程菌在15-L 罐上發(fā)酵產(chǎn)酶的溫度、pH、溶氧、補(bǔ)料等過程參數(shù)，使得重組角蛋白酶KerZ1 的酶活達(dá)到426.60 KU/mL，較原始菌株的角蛋白酶酶活（120.1 U/mL）提高了3552 倍。 Yang 等（2015）將來源于解淀粉芽孢桿菌K11（B.amyloliquefaciens K11）的角蛋白酶基因KerK 在不能降解羽毛的枯草芽孢桿菌SCK6 中進(jìn)行表達(dá)， 重組表達(dá)角蛋白酶基因的枯草芽孢桿菌能在24 h 內(nèi)完全降解羽毛。 Gong 等（2020） 采用aprE 啟動子將角蛋白酶基因kerBv在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，其酶活性提高了15 倍左右。 本研究以自主構(gòu)建的角蛋白酶kerJY-23 分泌表達(dá)工程菌枯草芽孢桿菌WB600為研究對象，對其產(chǎn)酶的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為該重組角蛋白酶工業(yè)化降解角蛋白提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1.1 菌株 重組角蛋白酶工程菌枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏。

1.1.2 主要試劑和儀器 5%可溶性角蛋白購自東京化成工業(yè)株式會社；LB 肉湯購自北京陸橋技術(shù)有限公司； 酵母浸膏購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司； 福林酚試劑購自上海源葉生物科技有限公司；卡那霉素購自北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、氯化鈉等化學(xué)試劑均購自上海麥克林生化科技有限公司。

立式壓力蒸汽滅菌鍋（YXQ-100A）：上海云泰儀器儀表有限公司；電熱恒溫水槽（SSW-420-2S）：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；上海雷磁pH 計（PHS-3C）：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；恒溫振蕩器（HZQ-X500C）：上海一恒科技有限公司；紫外可見分光光度計（UV-5500PC）：上海元析儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)（KDC-160HR）：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水定容至1 L，pH（7.0±0.2）。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g，蛋白胨20 g，K2HPO41.5 g，NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.025 g，CaCl20.025 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.015 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.4 ～7.6，121 ℃濕熱滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

然而，用哺乳動物瘦素處理銀大馬哈魚(Oncorhynchus kisutch)[39]、鯰(Ictalurus punctatus)[40]和綠海魴(Lepomis cyanellus)[27]，卻不改變它們的攝食行為或能量代謝。

1.2.1 培養(yǎng)方法 種子制備： 取出于甘油中-80 ℃凍存的枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 菌液，先后于-20 ℃和4 ℃解凍，吸取200 μL 接種于50 mL LB 液體培養(yǎng)基 （含50 μg/mL 卡那霉素）中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)12 h 獲得種子液。

初始發(fā)酵條件： 以2% 接種量接種重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 種子液于裝量為50 mL 初始發(fā)酵培養(yǎng)基 （含50 μg/mL 卡那霉素） 的250 mL 三角瓶中，37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h。

1.2.2 角蛋白酶活性的測定 參考Yamamura 等（2002）的測定方法并進(jìn)行適當(dāng)修改，使用1% 的可溶性角蛋白 （在50 mmol pH 8.0 的Tris-HCl中稀釋）作為底物來測定角蛋白酶活性。向1 mL底物中加入1 mL 適當(dāng)稀釋的粗酶液， 在60 ℃下孵育20 min。 加入2 mL 0.4 mol/L 的三氯乙酸終止反應(yīng)，以12000 r/min 離心5 min，收集上清液1 mL 至試管中，加入1 mL 福林酚試劑和5 mL 0.4 mol/L Na2CO3，混勻后置于60 ℃水浴中孵育20 min，測定660 nm 處的吸光度。 對于空白對照的測定，1 mL 菌液先加入2 mL 0.4 mol/L TCA使酶失活，再加入1 mL 1%可溶性角蛋白。 試驗(yàn)結(jié)果為多組試驗(yàn)的平均值。 酶活定義：在上述反應(yīng)條件下，660 nm 下吸光度值每增加0.01 定義為一個酶活力單位（U/mL）。

1.2.3 單因素試驗(yàn)優(yōu)化產(chǎn)酶條件 培養(yǎng)基組分的單因素優(yōu)化： 通過改變發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的單一組分， 研究不同組分對菌株發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的影響。其中，碳源種類的優(yōu)化分別采用濃度為50 g/L的葡萄糖、蔗糖、葡萄糖：蔗糖（25：25 g/L）、麥芽糖、可溶性淀粉；有機(jī)氮源種類的優(yōu)化分別采用濃度為20 g/L 的酵母浸膏、牛肉膏、蛋白胨、玉米漿粉、 黃豆餅粉； 硫酸銨添加濃度的優(yōu)化分別采用0、2.5、5、7.5、10、12.5 g/L；金屬離子的優(yōu)化分別采用添加濃度為0.05 g/L 的K+、Mn2+、Cu2+、Fe3+、Zn2+。

發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化： 分別考察不同發(fā)酵溫度 （29、33、37、41、45 ℃）、 培養(yǎng)基初始pH（6、6.5、7、7.5、8 和8.5）、裝液量（250 mL 三角瓶中分別裝有40、45、50、55、60、65 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基）、接種量（2%、4%、6%、8%和10%）、搖床轉(zhuǎn)速（140、160、180、200、220 r/min）、發(fā)酵周期（12、24、36、48 h）對菌株發(fā)酵產(chǎn)角蛋白的影響。

1.2.4 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗(yàn) 以發(fā)酵培養(yǎng)基單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，對葡萄糖：蔗糖（X1）、酵母浸膏（X2）、硫酸銨（X3）、MnCl2（X4）四個因素進(jìn)行4 因素5 水平的二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗(yàn)， 用以優(yōu)化菌株產(chǎn)角蛋白酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方。 試驗(yàn)因素水平及編碼如表1 所示。

表1 二次通用旋轉(zhuǎn)組合的試驗(yàn)設(shè)計因素與水平 g/L

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 軟件進(jìn)行處理，Origin 2021 軟件進(jìn)行作圖分析， 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計的試驗(yàn)結(jié)果分析均在DPS 數(shù)據(jù)處理軟件上運(yùn)行， 試驗(yàn)中各產(chǎn)酶條件的優(yōu)化均為3次平行試驗(yàn)， 結(jié)果以3 次試驗(yàn)的 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基組分的單因素優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 碳源對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響 由圖1 可知，當(dāng)葡萄糖和蔗糖復(fù)配時對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶促進(jìn)作用最大。 根據(jù)不同碳源的酶活力差異性分析， 對其大小進(jìn)行排序?yàn)槠咸烟牵赫崽牵酒咸烟牵究扇苄缘矸郏菊崽牵钧溠刻恰?單一的蔗糖和麥芽糖作碳源時產(chǎn)酶酶活相對較小，不適合作培養(yǎng)基中的碳源，因而選擇葡萄糖和蔗糖復(fù)配作為該菌發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的碳源。

圖1 碳源種類對枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響

2.1.2 有機(jī)氮源對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響 由圖2 可見， 酵母浸膏作為氮源時， 重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶酶活最高。根據(jù)不同氮源的酶活力差異性分析， 對其大小進(jìn)行排序?yàn)榻湍附啵居衩诐{粉＞蛋白胨＞牛肉膏＞黃豆餅粉。 其中，黃豆餅粉作為氮源時角蛋白酶的表達(dá)量最低， 這可能是由于黃豆餅粉為遲效氮源，導(dǎo)致菌株生長代謝較緩慢，從而使得產(chǎn)酶較低。 因而， 選取酵母浸膏作為重組枯草芽孢桿菌WB600 發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的有機(jī)氮源。

圖2 有機(jī)氮源種類對枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響

2.1.3 硫酸銨添加量對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響 由圖3 可見，隨著硫酸銨添加量的提高，發(fā)酵所產(chǎn)的角蛋白酶酶活逐漸增加，當(dāng)硫酸銨添加量為10 g/L時，角蛋白酶產(chǎn)酶量最大。 當(dāng)硫酸銨添加量進(jìn)一步增大至12.5 g/L，角蛋白酶的酶活出現(xiàn)明顯下降。因此，重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的最佳硫酸銨添加量為10 g/L。

圖3 硫酸銨添加量對枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響

2.1.4 金屬離子對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響 由圖4 可見，當(dāng)培養(yǎng)基添加氯化錳時，發(fā)酵所產(chǎn)的角蛋白酶酶活最高。 根據(jù)不同金屬離子的酶活力差異性分析，對其大小進(jìn)行排序?yàn)镸n2+＞K+＞Fe3+＞Zn2+＞Cu2+，而添加硫酸銅則會對菌株產(chǎn)酶有抑制作用。 金屬離子一般作為輔酶成分或充當(dāng)輔酶功能（丁莉莉，2017），添加氯化錳顯著提高了重組枯草芽孢桿菌WB600 發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的酶活，但是額外添加硫酸鋅會抑制角蛋白酶產(chǎn)酶， 這與Arokiyaraj 等（2019）的報道相似。

圖4 金屬離子對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 接種量對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響 圖5 表明，接種量為2% ～6%時，菌株所產(chǎn)的角蛋白酶與接種量呈正相關(guān)， 繼續(xù)增大接種量則導(dǎo)致角蛋白酶產(chǎn)量明顯下降。 當(dāng)接種量為6%時，重組角蛋白酶的酶活達(dá)到最大值。 接種量太少，細(xì)胞生長延滯，酶的合成受到影響；而接種量過高時，前期細(xì)胞生長迅速，營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，后期供需不足從而會影響酶的合成（Lu 等，2020）。因此，重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的最佳接種量確定為6%。

圖5 接種量對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響

2.2.2 裝液量對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響 由圖6 可知，在發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為45 mL/250 mL 時，重組角蛋白酶的酶活達(dá)到最高值。裝液量會影響到搖瓶發(fā)酵的供氧狀況， 在重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的過程中， 隨著裝液量不斷增大，通氣和溶氧隨之減小，從而導(dǎo)致角蛋白酶的合成因氧供應(yīng)不足而受到抑制。

圖6 裝液量對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響

2.2.3 發(fā)酵時間對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響 由圖7 可見， 隨著發(fā)酵時間的延長， 重組枯草芽孢桿菌WB600 所產(chǎn)角蛋白酶的酶活先升高而后降低，在第36 h 時所產(chǎn)酶活最高。 發(fā)酵時間過長，由于發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)耗竭，導(dǎo)致菌體產(chǎn)生自溶并且累積有害代謝產(chǎn)物，反而使得角蛋白酶酶活有所下降。

圖7 發(fā)酵時間對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響

2.2.4 發(fā)酵溫度對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響 由圖8 可知，溫度在37 ℃以下時，隨溫度上升酶活逐漸提高，在37 ℃時酶活達(dá)到最大。 但是當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，由于超過了重組枯草芽孢桿菌WB600 的最適生長溫度，菌株生長代謝受阻，導(dǎo)致角蛋白酶的酶活力迅速下降。 因此， 重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的最適溫度為37 ℃。

圖8 發(fā)酵溫度對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響

2.2.5 初始pH 對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響 由圖9 可知，pH 從6 ～8 的過程中，酶活隨著pH 的升高而逐漸增大，pH 繼續(xù)升高， 菌株產(chǎn)酶活力有所下降。 在pH 8 時，菌株產(chǎn)酶量達(dá)到最高酶活。 大多數(shù)細(xì)菌產(chǎn)角蛋白酶的最適pH 在中性或者略偏堿性，這與之前報道的Pseudomonas sp.LM19 在pH 8 時產(chǎn)酶最高相似（Mohamad 等，2017）。

圖9 初始pH 對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響

2.2.6 搖床轉(zhuǎn)速對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響 由圖10 可知，在搖床轉(zhuǎn)速為140 ～200 r/min 時，重組枯草芽孢桿菌WB600 產(chǎn)酶酶活隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高而增大。 在200 r/min 的搖床轉(zhuǎn)速下，角蛋白酶的酶活達(dá)到最高，繼續(xù)加大轉(zhuǎn)速至220 r/min，酶活反而有所下降。在發(fā)酵過程中，轉(zhuǎn)速會影響物質(zhì)和溶解氧的交換， 在轉(zhuǎn)速為140 ～200 r/min 時，轉(zhuǎn)速不斷增大使發(fā)酵溶氧和物質(zhì)交換增加， 菌株產(chǎn)酶能力增強(qiáng)；當(dāng)轉(zhuǎn)速增大至220 r/min 后，剪切力也隨轉(zhuǎn)速的增加而增大， 制約了菌株生長和產(chǎn)酶（劉婕，2013）。 因此，重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的最佳轉(zhuǎn)速為200 r/min。

圖10 搖床轉(zhuǎn)速對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 產(chǎn)角蛋白酶的影響

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的二次通用旋轉(zhuǎn)正交組合優(yōu)化與驗(yàn)證 重組枯草芽孢桿菌WB600 發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖：蔗糖（X1）、酵母浸膏（X2）、硫酸銨（X3）、MnCl2（X4）等組分的二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗(yàn)及其結(jié)果如表2 所示，方差分析結(jié)果如表3 所示。

表2 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗(yàn)方案及結(jié)果

表3 試驗(yàn)結(jié)果方差分析表

根據(jù)表2 所示的試驗(yàn)結(jié)果， 以角蛋白酶活為響應(yīng)值進(jìn)行多元回歸擬合， 得到回歸方程：Y=1392.51+73.42X1-124.81X2+86.59X3+100.92X4-141X12+12.21X22+115.80X32+12.15X42+203.96X1X2-174.46X1X3-36.63X1X4。

回歸方程中Y 表示角蛋白酶活（U/mL），X1、X2、X3、X4分別表示葡萄糖：蔗糖、酵母浸膏、硫酸銨、MnCl2在培養(yǎng)基中的濃度（g/L）。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析可知， 回歸方程失擬性檢驗(yàn)F1=3.20＜F0.05（5，3）=5.41，差異不顯著，而顯著性檢驗(yàn)F2=14.74＞F0.05（11，8）=2.95，回歸方程顯著。 這說明該模型擬合度較好； 在α=0.10 顯著水平剔除不顯著項(xiàng)后， 簡化后的回歸方程為：Y=1392.51+73.42X1-124.81X2+86.59X3+100.92X4-141X12+115.80X32+203.96X1X2-174.46X1X3。

2.4 數(shù)學(xué)模型的應(yīng)用分析

2.4.1 單因素分析 根據(jù)表4 和圖11 對單因子試驗(yàn)分析，碳源對酶活的影響最大，其次為硫酸銨添加量、酵母浸膏，氯化錳添加量影響最小。 隨著葡萄糖和蔗糖復(fù)配添加量的增加， 酶活呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。

圖11 各單因子與角蛋白酶酶活關(guān)系圖

表4 單因子效應(yīng)分析

2.4.2 產(chǎn)酶優(yōu)化與驗(yàn)證 根據(jù)上述分析，在95%置信區(qū)間的優(yōu)化方案為： 葡萄糖24.95 ～26.15 g/L，蔗糖24.95 ～26.15 g/L， 酵母浸膏18.3 ～20.35 g/L，硫酸銨9.78 ～10.53 g/L， 氯化錳0.05 ～0.06 g/L（表5）。 考慮到實(shí)際操作及試劑成本的情況下，將優(yōu)化方案定為葡萄糖25 g/L，蔗糖25 g/L，酵母浸膏20 g/L，氯化錳0.05 g/L。 對此方案進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，得到酶活為（2110.33±15.011）U/mL，較優(yōu)化前提高了5.10 倍。

表5 各變量取值頻率分布

3 結(jié)論

本研究對重組枯草芽孢桿菌WB600-pMA5-kerJY-23 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。 在優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基配方（葡萄糖25 g/L，蔗糖25 g/L，酵母浸膏20 g/L，硫酸銨10 g/L，磷酸氫二鉀1.5 g/L，氯化鈉0.3 g/L，氯化鈣0.025 g/L， 硫酸鎂0.025 g/L， 硫酸亞鐵0.015 g/L，氯化錳0.05 g/L）和發(fā)酵條件（培養(yǎng)基初始pH 8， 裝液量45 mL/250 mL 三角瓶， 接種量6%，培養(yǎng)溫度37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵周期36 h）下，重組枯草芽孢桿菌WB600 所產(chǎn)的角蛋白酶活性達(dá)到（2110.33±15.011）U/mL，較優(yōu)化前提高了5.10 倍。 本研究通過培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件的優(yōu)化，提高了重組枯草芽孢桿菌WB600 發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的酶活， 為該酶后續(xù)應(yīng)用于角蛋白資源的高值化利用提供了一定的理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)。