慢性冷熱應(yīng)激對(duì)繁殖母牛血清指標(biāo)的影響

施 安， 王建東 ， 侯鵬霞， 陳志龍， 孫文陽(yáng)， 梁小軍， 王瑞剛， 姜 武

（1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏銀川 750002；2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院固原分院，寧夏固原 756099；3.寧夏犇旺生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，寧夏永寧 750100）

寧夏屬典型的溫帶大陸性氣候， 冬夏兩季氣候迥異， 冬季嚴(yán)寒夏季酷暑， 冬夏溫差最高可達(dá)32 ℃左右，秋冬交節(jié)之際，晝夜溫差可達(dá)17 ℃左右（姜鑫等，2021）。寧夏冬夏交替的氣候特征容易引發(fā)反芻動(dòng)物的慢性冷熱應(yīng)激癥， 較大的溫差導(dǎo)致機(jī)體長(zhǎng)時(shí)間處于高溫或低溫環(huán)境， 機(jī)體已經(jīng)暫時(shí)適應(yīng)環(huán)境之后的冷熱應(yīng)激狀態(tài)（Cui 等，2016），尤其是繁殖母牛受到冷熱應(yīng)激所產(chǎn)生的一系列非特異性反應(yīng)使母牛產(chǎn)生應(yīng)激綜合征， 從而導(dǎo)致繁殖功能障礙等 （Hagiya 等，2017；Wheelock 等，2010）。受冷熱應(yīng)激的自適應(yīng)代謝損失給肉牛養(yǎng)殖帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失， 是潛在的風(fēng)險(xiǎn)管控重點(diǎn)。通常將溫濕指數(shù)（THI）作為評(píng)價(jià)動(dòng)物冷熱應(yīng)激狀態(tài)的重要參考指標(biāo)，THI 不同的閾值范圍代表冷熱應(yīng)激程度， 其中38≤THI≤72 為舒適區(qū)間，72≤THI≤78 為輕度熱應(yīng)激，78≤THI≤89 為中度熱應(yīng)激，THI ＞89 為重度熱應(yīng)激；25≤THI≤38為輕度冷應(yīng)激，8≤THI≤25 為中度冷應(yīng)激，THI ＜8 為重度冷應(yīng)激。 目前關(guān)于寧夏地區(qū)反芻動(dòng)物冷熱應(yīng)激研究多集中在奶牛方面， 鮮有繁殖母牛冷熱應(yīng)激的相關(guān)研究。 因此本試驗(yàn)以寧夏地區(qū)規(guī)?；馀ｐB(yǎng)殖場(chǎng)的全年THI 監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)為參考依據(jù)，研究慢性冷熱應(yīng)激對(duì)繁殖母牛的生理生化以及繁殖激素的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)規(guī)律， 篩選出判別冷熱應(yīng)激的關(guān)鍵指示物， 為集約化條件下母牛生產(chǎn)環(huán)境的精準(zhǔn)控制提供理論和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和樣品采集 試驗(yàn)在寧夏銀川市犇旺生態(tài)養(yǎng)殖公司進(jìn)行， 采用單因素水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇體重[（680±58）kg]和胎次[（1 ～3）胎]相近的繁殖母牛10 頭為試驗(yàn)動(dòng)物， 參考肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn) （NY/T 815-2004） 保證試驗(yàn)組的全混合日糧（TMR）營(yíng)養(yǎng)水平一致，自由采食和飲水，試驗(yàn)設(shè)對(duì)照組（秋季）、冷應(yīng)激組（冬季）和熱應(yīng)激組（夏季）3個(gè)階段進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇肉牛場(chǎng)生產(chǎn)區(qū)的西邊和東邊為測(cè)定點(diǎn)， 距地面1.8 m 窗臺(tái)處放置溫濕儀GPS-600（浙江精創(chuàng)科技有限公司），選取放置點(diǎn)有效通風(fēng)，防止陽(yáng)光直接照射和雨淋，并避免母牛觸及。 每3 h 自動(dòng)記錄溫度和濕度， 計(jì)算THI。THI=0.8×AT（溫度）+[RH（濕度）×（AT-14.4）]+46.4（McDowell 等，1976）。

1.3 指標(biāo)測(cè)定 參照牛場(chǎng)THI 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果，分別把秋季、冬季和夏季的極端THI 數(shù)值依次作為對(duì)照組、冷應(yīng)激組和熱應(yīng)激組的對(duì)應(yīng)采樣時(shí)間，從尾根部采集血樣并分離血清保存。

1.3.1 血清生化指標(biāo) 用比色法試劑盒（中生北控股份有限公司） 測(cè)定總蛋白 （TP）、 白蛋白（ALB、）球蛋白（GLB）、尿素氮（BUN）、葡萄糖（GLU）和甘油三酯（TG）。

1.3.2 血清免疫指標(biāo) 用比色法試劑盒（中生北控股份有限公司）測(cè)定免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）；酶免法（北京華英生物技術(shù)公司）測(cè)定白細(xì)胞介素-2（IL-2）白細(xì)胞介素-4（IL-4）。

1.3.3 抗氧化能力指標(biāo) 用酶免法（北京華英生物技術(shù)公司）測(cè)定總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）。

1.3.4 繁殖相關(guān)激素指標(biāo) 用放免法測(cè)定雌二醇（E2）、孕酮（P）、三碘甲狀腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均采用Excel 軟件進(jìn)行處理， 使用SPSS 軟件進(jìn)行ANOVA 方差分析和Duncan 多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 全年THI 指數(shù)測(cè)定結(jié)果 根據(jù)THI 指數(shù)全年監(jiān)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖1），牛場(chǎng)在夏季六、七、八月份屬于輕度熱應(yīng)激（72≤THI≤78）；冬季一、二月份屬于輕度冷應(yīng)激（25≤THI≤38），其余月份處于舒適區(qū)（38≤THI≤72）。 其中，一月份THI 指數(shù)最低，七月份THI 指數(shù)最高， 十月份最接近全年THI 平均值， 分別對(duì)應(yīng)冷應(yīng)激組 （THI=31.68）， 熱應(yīng)激組（THI=75.22）和對(duì)照組（THI=53.78）3 個(gè)試驗(yàn)期。

圖1 全年溫濕度指數(shù)THI 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)曲線圖

2.2 血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 由表1 可知，冷應(yīng)激組的各項(xiàng)生化指標(biāo)最高，除TG 外，均呈現(xiàn)冷應(yīng)激組＞對(duì)照組＞熱應(yīng)激組的規(guī)律， 冷應(yīng)激組的TP、ALB 和TG 相比熱應(yīng)激組分別提高了79.28%（P ＜0.01）、62.63%（P ＜0.01）和516.67%（P ＜0.01），其中BUN 冷應(yīng)激組比對(duì)照組提高了34.28%（P ＜0.01）； 對(duì)照組比熱應(yīng)激組提高了159.63%（P ＜0.01），GLB 和GLU 差異不顯著（P ＞0.05）。

2.3 血清免疫指標(biāo)測(cè)定結(jié)果 由表2 可知，IL-2熱應(yīng)激組比對(duì)照組提高了15.75%（P ＜0.01）、對(duì)照組比冷應(yīng)激組提高了34.20%（P ＜0.01）， 其他指標(biāo)均呈現(xiàn)冷應(yīng)激組＞對(duì)照組＞熱應(yīng)激組的規(guī)律，其中IgG、IgM、IL-4 和IgA 冷應(yīng)激組比熱應(yīng)激組分別提高了50.40% （P ＜ 0.01）、36.52% （P ＜0.01）、21.36%（P ＜0.01）和19.48%（P ＜0.05）。

2.4 血清抗氧化指標(biāo)測(cè)定 由表3 可知，冷應(yīng)激組的MDA 比對(duì)照組和熱應(yīng)激組分別降低了51.72%（P ＜0.01） 和47.34%（P ＜0.01），SOD、TAOC 和GSH-PX均呈現(xiàn)冷應(yīng)激組＞對(duì)照組＞熱應(yīng)激組的規(guī)律， 且冷應(yīng)激組相比熱應(yīng)激組分別提高了116.64% （P ＜ 0.01）、58.38% （P ＜ 0.01） 和38.33%（P ＜0.01）。

表3 血清抗氧化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.5 血清內(nèi)分泌激素測(cè)定 由表4 可知，冷應(yīng)激組E2 比熱應(yīng)激組提高了89.23%（P ＜0.01）；P 組間差異均極顯著，冷應(yīng)激組比熱應(yīng)激組提高了118.51%（P ＜0.01），熱應(yīng)激組比對(duì)照組又提高了136.38%（P ＜0.01）；T3 和T4 各組間差異不顯著（P ＞0.05）。

表4 血清內(nèi)分泌激素測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 冷熱應(yīng)激對(duì)生化指標(biāo)的影響 動(dòng)物生化水平是反映健康狀況和營(yíng)養(yǎng)水平的重要指標(biāo)（張建剛等，2012）， 動(dòng)物在環(huán)境應(yīng)激脅迫下發(fā)生免疫應(yīng)答，通過(guò)糖、能量和蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)再分配以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定 （Srikandakumar 等，2004）。在冷熱應(yīng)激條件下， 由于動(dòng)物采食量發(fā)生變化導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)攝入不均直接影響生化指標(biāo)的差異。 熱應(yīng)激時(shí)，繁殖母牛營(yíng)養(yǎng)攝入水平降低，免疫與代謝功能弱化，而總蛋白（TP）含量是免疫力和代謝水平（高艷霞等，2014） 的準(zhǔn)確反映，TP 含量也因此降低， 其中ALB 和GLB 是組成總蛋白的2 個(gè)關(guān)鍵蛋白，前者調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓后者參與免疫代謝，所以ALB 和GLB 含量也都呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。 而冷應(yīng)激時(shí)這3 個(gè)指標(biāo)隨著繁殖母牛采食量的升高而升高。 這就解釋了試驗(yàn)中冷應(yīng)激的TP、ALB 和GLB 極顯著或顯著高于熱應(yīng)激組的變化趨勢(shì)（P ＜0.01）。 其次，繁殖母牛處于嚴(yán)重?zé)釕?yīng)激時(shí)，動(dòng)物無(wú)法通過(guò)糖、脂肪代謝滿足能量需要，只能加速蛋白質(zhì)分解代謝來(lái)維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)， 表現(xiàn)為T(mén)P 的降低。 尿素氮（BUN）含量可以反映繁殖母牛氨基酸平衡和蛋白質(zhì)代謝狀態(tài)（趙拴平等，2012），當(dāng)母牛需要分解蛋白質(zhì)來(lái)維持能量需要時(shí)， 相應(yīng)的BUN 含量降低，試驗(yàn)中熱應(yīng)激組極顯著低于對(duì)照組和冷應(yīng)激組（P ＜0.01）也印證了這一結(jié)論。GLU含量是衡量肝臟功能的一個(gè)重要指標(biāo) （王蘭等，2007）， 試驗(yàn)中不同應(yīng)激條件下差異不顯著 （P ＞0.05），這與馬毅（2020）不同季節(jié)GLU 無(wú)顯著變化的研究結(jié)果一致， 但試驗(yàn)組表現(xiàn)為冷應(yīng)激組＞對(duì)照組＞熱應(yīng)激組，說(shuō)明當(dāng)母牛營(yíng)養(yǎng)攝入不足時(shí)，能量出現(xiàn)負(fù)平衡，糖代謝異常增加葡萄糖分解，表現(xiàn)為葡萄糖濃度降低（O’brien 等，2010）。 甘油三酯（TG）是血脂的主要成分，起到供給與儲(chǔ)存能源的作用 （馬毅等，2020）。 試驗(yàn)中冷應(yīng)激組的TG含量顯著高于對(duì)照組和熱應(yīng)激組（P ＜0.05），說(shuō)明母牛處于熱應(yīng)激時(shí)， 不僅采食量下降攝入的脂肪類物質(zhì)降低， 還會(huì)引起干物質(zhì)分化受阻導(dǎo)致脂肪吸收率降低， 其次當(dāng)體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)偏低時(shí)會(huì)分解儲(chǔ)存的甘油三酯供能，因此甘油三酯含量便會(huì)下降（馮亞杰等，2016）。

3.2 冷熱應(yīng)激對(duì)免疫指標(biāo)的影響 免疫球蛋白是評(píng)估動(dòng)物免疫狀況的重要指標(biāo)， 主要包括免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白M（IgM），其中IgA 是機(jī)體黏膜防御感染的主要物質(zhì)，可以與周?chē)?xì)胞組成局部免疫系統(tǒng)（高錦萍等，2006）；IgG 參與機(jī)體免疫防御反應(yīng)，是血清免疫球蛋白的主要成分； IgM 是特異性免疫反應(yīng)早期抗體（劉慶華，2009）。試驗(yàn)中IgG 和IgM 在冷應(yīng)激組的含量極顯著高于熱應(yīng)激組（P ＜0.01），IgA顯著高于熱應(yīng)激組（P ＜0.05），有研究表明熱應(yīng)激可顯著降低奶牛血清中IgA、IgG、IgM 含量（Safa等，2019；Schmautz 等，2018）， 表明繁殖母牛在熱應(yīng)激時(shí)， 高溫導(dǎo)致其機(jī)體的免疫組織和功能受到抑制，損害了體液免疫（彭孝坤等，2019；張燦等，2017）。但冷應(yīng)激時(shí)IgG 和IgM 與對(duì)照組的差異不顯著（P ＞0.05），說(shuō)明肉牛對(duì)環(huán)境溫度具有低溫適應(yīng)性強(qiáng)但高溫耐受性差的特點(diǎn) （湖南科技報(bào)，2020），所以低溫對(duì)繁殖母牛的免疫功能損傷遠(yuǎn)低于高溫的影響，因此要重視“三伏天”對(duì)肉牛嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)。 白細(xì)胞介素-2（IL-2）能促進(jìn)T 細(xì)胞增殖分化和活性，間接反映機(jī)體免疫應(yīng)答水平（李倜宇，2018）；白細(xì)胞介素-4（IL-4）可誘導(dǎo)B 細(xì)胞成熟并刺激其產(chǎn)生免疫球蛋白， 主要以調(diào)節(jié)體液免疫為主（蔡明成，2014）。 試驗(yàn)中IL-2 在熱應(yīng)激組極顯著高于冷應(yīng)激組， 而IL-4 極顯著變低。Sahin（2017）和Chance（1979）研究表明，熱應(yīng)激能抑制牛的免疫調(diào)節(jié)水平，表現(xiàn)為IL-2 升高和IL-4 降低，本試驗(yàn)結(jié)果與上述結(jié)果一致。

3.3 冷熱應(yīng)激對(duì)抗氧化指標(biāo)的影響 動(dòng)物正常代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生自由基， 其氧化不飽和脂類形成丙二醛（MDA），對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞有誘變作用，MDA 含量越多對(duì)細(xì)胞膜的侵蝕作用也越大。而酶促體系就是機(jī)體主要的抗氧化防疫機(jī)制， 包括SOD、T-AOC 和GSH-Px（陳雯雯等，2012a；崔恒敏等，2003） 。 當(dāng)動(dòng)物遭受應(yīng)激時(shí)，酶促體系的抗氧化水平被打破， 此時(shí)機(jī)體需要大量的抗氧化酶來(lái)消除自由基， 表現(xiàn)為SOD、T-AOC 和GSH-Px的活性數(shù)量變多，抑制MDA 升高。 試驗(yàn)中冷應(yīng)激組SOD、T-AOC 和GSH-Px 極顯著高于熱應(yīng)激組（P ＜0.01），而MDA 反之降低（P ＜0.01）。 胡煜等（2016）發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激時(shí)肉牛SOD、T-AOC 和GSHPx 有不同程度降低，而MDA 升高；同時(shí)肉牛在冷應(yīng)激時(shí)有相反的變化趨勢(shì)（么蕊，2021），本試驗(yàn)結(jié)果與其一致。 由于熱應(yīng)激導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)氧循環(huán)代謝紊亂進(jìn)而誘導(dǎo)自由基激增， 抗氧化酶系統(tǒng)平衡因此被打破， 應(yīng)激狀態(tài)下消耗的抗氧化酶多于新生成的，導(dǎo)致MDA 含量同樣顯著升高，試驗(yàn)中冷應(yīng)激組的MDA 極顯著低于熱應(yīng)激組， 表明繁殖母牛在冷應(yīng)激中的抗氧化性較好， 熱應(yīng)激對(duì)自身造成了一定的氧化損傷，鄧發(fā)清（2008）和陳雯雯（2012）對(duì)奶牛的報(bào)道中也證明了上述觀點(diǎn)，進(jìn)一步證實(shí)了肉牛耐寒不耐熱的特性。

3.4 冷熱應(yīng)激對(duì)內(nèi)分泌激素的影響 三碘甲狀腺原氨酸（T3）和甲狀腺素（T4）同屬甲狀腺素成員， 對(duì)動(dòng)物的體溫調(diào)節(jié)起著重要作用。 本試驗(yàn)中T3 和T4 在不同應(yīng)激狀態(tài)下的差異不顯著 （P ＞0.05），但3 個(gè)試驗(yàn)組均表現(xiàn)為熱應(yīng)激組＞對(duì)照組＞冷應(yīng)激組，說(shuō)明熱應(yīng)激使下丘腦-垂體-甲狀腺軸（HPT）受阻，導(dǎo)致促甲狀腺激素（TSH）合成減少，甲狀腺功能減退，T3 和T4 合成量減少，動(dòng)物自適應(yīng)調(diào)節(jié)體溫以減緩熱應(yīng)激刺激。 冷應(yīng)激則激活下丘腦-垂體-甲狀腺（HPT）軸，TSH 合成增加，促進(jìn)T3 和T4 分泌，提高肝糖原合成，促進(jìn)動(dòng)物產(chǎn)熱提高對(duì)低溫天氣適應(yīng)性（白丹丹，2017）。這與朱建營(yíng)（2016）的研究結(jié)果也一致。 雌二醇（E2）主要由卵巢的卵泡細(xì)胞所分泌，生物活性最強(qiáng)，也是雌激素的重要參考指標(biāo)（楊瑩等，2017）。 孕酮（P）是動(dòng)物自身調(diào)節(jié)的雌性激素，其主要由卵巢分泌，與雌二醇激素公共維持雌性動(dòng)物的生殖周期， 促使乳腺發(fā)育成熟的作用（龍鳳宜等，2006）。本試驗(yàn)中冷應(yīng)激組的E2 和P 均極顯著高于對(duì)照組和熱應(yīng)激組（P ＜0.01）， 說(shuō)明高溫抑制了下丘腦-垂體-性腺軸的反應(yīng)，使垂體促性腺激素（FSH、LH）的分泌受到抑制， 同時(shí)使雌激素的分泌下降并抑制雌二醇的生成和孕酮的分泌。 而在低溫環(huán)境下機(jī)體自適應(yīng)調(diào)節(jié)促進(jìn)了性腺軸的分泌代謝，E2 和P 激素也隨之升高。

通過(guò)對(duì)極端環(huán)境條件下繁殖母牛的生化、免疫、抗氧化和激素指標(biāo)監(jiān)測(cè)，結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)4 種生理生化參數(shù)中BUN、IL-2、GSH-Px 和P 指標(biāo)在正常組、冷應(yīng)激組和熱應(yīng)激組之間均差異極顯著（P ＜0.01），且與對(duì)照組相比，冷應(yīng)激組和熱應(yīng)激組相差最多的是P，分別為416.52%和136.38%，說(shuō)明孕酮對(duì)冷熱環(huán)境的變化最敏感， 可作為判別繁殖母牛冷熱應(yīng)激反應(yīng)的潛在指示物， 用于早期監(jiān)測(cè)母牛的應(yīng)激程度， 降低冷熱應(yīng)激對(duì)繁殖性能造成的不利影響。

4 結(jié)論

冷熱應(yīng)激均能影響母牛的營(yíng)養(yǎng)代謝和繁殖性能，熱應(yīng)激對(duì)母牛生理生化參數(shù)的影響更大，而孕酮可作為判別繁殖母牛冷熱應(yīng)激反應(yīng)指示物，用于早期監(jiān)測(cè)母牛的應(yīng)激程度。