基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的頭花蓼中槲皮素、沒食子酸和槲皮苷對幽門螺桿菌胃炎以及胃癌治療機制研究

宋孝晗，張姝，，黃健，莫非，

作者單位：1貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院臨床檢驗學(xué)教研室，貴州 貴陽550004；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床檢驗中心，貴州 貴陽550004

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）是一種革蘭陰性微需氧的螺旋形細菌，通常定植于胃和十二指腸黏膜［1］。研究表明，H.pylori與慢性胃炎密切相關(guān)，其引起的胃黏膜組織炎癥損傷經(jīng)久不愈，可引起胃癌的發(fā)生［2］?，F(xiàn)如今，胃癌已成為威脅人類健康的重要疾病之一，全球胃癌數(shù)據(jù)顯示，其發(fā)病率排名第五，死亡率排名第三［3］。幽門螺桿菌相關(guān)性疾病的治療一直是臨床上的一大難題，尤其是胃癌，西醫(yī)治療主要以外科手術(shù)為主，結(jié)合輔助放化療等綜合措施，但存在明顯不良反應(yīng)［4］。針對幽門螺桿菌相關(guān)性疾病，首要任務(wù)是抑菌，現(xiàn)階段臨床上應(yīng)用較廣的治療方案是質(zhì)子泵抑制劑（和鉍劑）聯(lián)合兩種抗生素構(gòu)成的三聯(lián)或四聯(lián)療法，然而，抗生素的廣泛使用使H.pylori耐藥率增強，導(dǎo)致其根除率逐年下降。因此，尋求安全有效且注重整體調(diào)節(jié)的新型藥物對幽門螺桿菌胃炎以及胃癌的臨床防治具有重大意義。

頭花蓼作為中藥現(xiàn)代化重點培育發(fā)展的“十大中藥產(chǎn)業(yè)鏈”和“十大苗藥”品種之一，具有清熱利濕、解毒止痛、活血化瘀等獨特療效［5］。我們前期的研究表明頭花蓼能夠顯著抑制H.pylori在胃黏膜的定植率，可有效改善H.pylori引起的胃黏膜的炎癥反應(yīng)，并能顯著抑制胃癌相關(guān)因子的表達情況［6-7］。然而由于多成分組合的作用機制研究較為復(fù)雜，頭花蓼發(fā)揮藥理作用的機制研究較少，因此需進一步深入研究并完善。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種融合了系統(tǒng)生物學(xué)和藥理學(xué)的思想，從整體的角度去探索藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)性，同時運用計算機技術(shù)對藥物、蛋白、基因等生物化學(xué)信息進行構(gòu)架、模擬和分析，從傳統(tǒng)尋找單一靶點轉(zhuǎn)向綜合網(wǎng)絡(luò)分析的新興學(xué)科。目前，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已被廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方優(yōu)化、新藥開發(fā)、中藥活性成分篩選等方面，為復(fù)雜的中藥研究提供了新的方法［8］。因此，本課題通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法，分析中藥成分-靶點-疾病之間的相互作用關(guān)系，進一步闡釋頭花蓼的藥理學(xué)機制，為頭花蓼對幽門螺桿菌胃炎以及胃癌的治療提供一定的理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析及工作流程 本研究使用了一種基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法來研究頭花蓼中槲皮素、沒食子酸和槲皮苷對幽門螺桿菌胃炎以及胃癌治療機制（圖1）。具體而言，首先對頭花蓼中3種化合物的預(yù)測靶點及幽門螺桿菌胃炎以及胃癌相關(guān)的疾病差異表達基因進行收集，緊接著通過交集分析獲取關(guān)鍵靶點。利用DAVID數(shù)據(jù)庫對相關(guān)靶點進行GO和KEGG的富集分析，并應(yīng)用AutoDock軟件進行分子對接，以分析hub基因與其對應(yīng)小分子的結(jié)合能。從而展示頭花蓼中槲皮素、沒食子酸和槲皮苷對幽門螺桿菌胃炎以及胃癌治療機制。

1.2 確定頭花蓼中主要活性化合物可能的靶點在本課題組前期的研究中，通過高效液相色譜（HPLC）檢測，從中分離出3個主要成分：槲皮素、沒食子酸和槲皮苷［6］。從PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲得頭花蓼這三種化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，之后使用STITCH（http：//stitch.embl.de/）、SEA（http：//sea.bkslab.org）、SwissTarget-Prediction（http：//swisstargetprediction.ch/）、SymMap（http：//www.symmap.org/）數(shù)據(jù)庫檢索各化合物靶點，并用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫分別分析這三種化合物靶點的功能。

1.3 疾病差異表達基因的分析 利用Gene Cards（http：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫檢索獲取由H.pylori引起的胃炎及胃癌相關(guān)差異表達基因，篩選其中得分較高的部分。同時從GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下載微陣列數(shù)據(jù)集GSE581，獲取健康人和H.pylori感染病人，以及健康人和H.pylori感染導(dǎo)致的胃癌病人的差異表達基因。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析 使用Veen圖分析頭花蓼的預(yù)測靶點與H.pylori相關(guān)性胃炎及胃癌差異表達基因之間的相互作用。利用STRING（https：//string-db.org/）分析頭花蓼潛在作用靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）關(guān)系，隨后應(yīng)用Cytoscape進行網(wǎng)絡(luò)可視化，并用R腳本計算hub基因。

1.5 GO和KEGG富集分析 將目標基因上傳至DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫中，以Homo Sapiens為研究對象，對潛在作用靶點進行 GO（gene ontology）和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析，以確定所涉及的靶基因的生物學(xué)過程（biological process，BP）、細胞成分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和KEGG富集通路。

1.6 分子對接 從PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載三種化合物的XML格式文件，通過OpenBable軟件將其轉(zhuǎn)換成PDB格式文件。使用PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）下載頭花蓼對幽門螺桿菌胃炎以及胃癌治療過程中核心靶點的PDB格式文件。利用分子對接模擬軟件AutoDock對三種化合物和蛋白靶點進行對接模擬計算，結(jié)合能小于0說明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol證明分子與靶點對接較好。

2 結(jié)果

2.1 頭花蓼主要化學(xué)成分的靶點預(yù)測 從Pub-Chem數(shù)據(jù)庫中獲得這三種化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。使用STITCH、SEA、SwissTargetPrediction、SymMap數(shù)據(jù)庫來預(yù)測靶點，分別獲取224、109、61個預(yù)測靶點。SwissTargetPrediction根據(jù)其生化指標對靶基因的功能進行分類，這些靶基因主要包括激酶、酶、裂解酶等，見圖2。

2.2 幽門螺桿菌胃炎及胃癌差異表達基因的鑒定 在基因表達數(shù)據(jù)集GSE581中，根據(jù)P＜0.05和|log FC|＞1作為篩選疾病基因的截止值，分別獲取98、225個胃炎和胃癌的差異表達基因。之后從Gene Cards數(shù)據(jù)庫中根據(jù)relevance score＞10為篩選標準，分別獲取83、809個胃炎和胃癌的差異表達基因。綜合上述兩個數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果，去除重復(fù)值，共獲取178、974個胃炎和胃癌的差異表達基因。

2.3 頭花蓼對幽門螺桿菌胃炎及胃癌作用靶點的預(yù)測及相互作用分析 將頭花蓼主要活性化合物對應(yīng)的310個預(yù)測靶點和178、974個胃炎和胃癌的差異表達基因進行分析，并以Venn圖形式進行可視化處理，共獲得27個頭花蓼和胃炎的交集靶點及107個頭花蓼和胃癌的交集靶點。其中TP53、MET、EGFR、ERBB2、BCL2L1等27個基因可能在幽門螺桿菌胃炎以及胃癌的整個過程中均起作用，見圖3。

將交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)置置信度＞0.400，對這27個基因進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）分析。并進一步導(dǎo)入Cytoscape軟件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析，條形圖顯示了hub基因連接數(shù)（degree值），degree值最多的基因，如 TP53、CASP3、PTGS2、IL6、JUN和CXCL8，可能在頭花蓼處理過程中起到關(guān)鍵作用，見圖4。

2.4 GO功能富集分析及KEGG通路分析 利用David數(shù)據(jù)庫對頭花蓼有效作用靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路分析，共獲得43個生物過程（biological process，BP）、6個細胞組分（cellular component，CC）和16個分子功能（molecular function，MF）。這些基因富集顯著的GO功能主要為炎癥反應(yīng)（inflammatory response）、受體復(fù)合物（receptor complex）、蛋白質(zhì)異二聚體活性（protein heterodimerization activity）。另外，獲得55條KEGG富集通路，如細胞凋亡（Apoptosis）、TNF信號通路等（TNF signaling pathway），見圖5。

2.5 分子對接 使用Cytoscape構(gòu)建頭花蓼-三種活性化合物-靶基因的網(wǎng)絡(luò)圖，獲取各化合物和其預(yù)測靶點的相互對應(yīng)關(guān)系。其中槲皮素的預(yù)測靶點為TP53、CASP3、IL6、JUN、CXCL8；沒食子酸的預(yù)測靶點為TP53、CASP3、JUN；槲皮苷的預(yù)測靶點為CASP3、PTGS2。對degree值前6（degree值＞21）的核心靶點和其相對應(yīng)的化合物分子使用 AutoDock 軟件進行分子對接，分子與靶點蛋白的最低結(jié)合能均小于0，說明配體與受體均可以自發(fā)結(jié)合，80%結(jié)合能小于-5 kJ/mol，則意味著其對接較好，其中 TP53蛋白與槲皮素的對接結(jié)合能小于-5 kJ/mol，結(jié)合能為-6.75 kJ/mol；CASP3蛋白與槲皮素、沒食子酸、槲皮苷結(jié)合能均小于-5 kJ/mol，結(jié)合能分別為-6.36、-6.35、-9.36 kJ/mol；PTGS2蛋白與槲皮苷的對接結(jié)合能小于-5 kJ/mol，結(jié)合能為-10.66 kJ/mol；IL-6蛋白與槲皮素的對接結(jié)合能小于-5 kJ/mol，結(jié)合能為-7.31 kJ/mol；JUN蛋白與槲皮素結(jié)合能小于-5 kJ/mol，結(jié)合能為-6.35 kJ/mol；CXCL8蛋白與槲皮素的對接結(jié)合能小于-5 kJ/mol，結(jié)合能為-7.83 kJ/mol，見圖6，表1。

表1 頭花蓼中核心化合物的分子對接

圖6 頭花蓼-三種活性化合物-靶基因的網(wǎng)絡(luò)圖

使用pymol軟件對對接結(jié)果進行繪圖，由圖可見，TP53與槲皮素分別在PHE328，ASN345，GLU326處形成氫鍵，與沒食子酸分別在ILE332、ARG335、GLY334處形成氫鍵；CASP3與槲皮素分別在TYR276、MET39、ASP40處形成氫鍵，與沒食子酸分別在LYS271、LYS38、SER112、GLY153處形成氫鍵，與槲皮苷分別在SER205、SER63、ARG207、TQ81176處形成氫鍵，見圖7。

圖7 頭花蓼中核心化合物的分子對接模式圖

3 討論

H.pylori是一種高感染率且具有致病性的常見細菌，能夠破壞胃上皮細胞的完整性，突破胃黏膜屏障，黏附并定植于胃上皮細胞，引起機體免疫系統(tǒng)的失衡和炎癥反應(yīng)，并可通過釋放反應(yīng)性氧即氧化應(yīng)激進一步損傷胃黏膜，長期感染后可使胃黏膜出現(xiàn)腸上皮化生和不典型增生，最終引起癌變。我國是H.pylori感染的重災(zāi)區(qū)，其引起的胃癌是我國發(fā)病率和死亡率均居第二位的惡性腫瘤［9］，且抗生素的廣泛使用使H.pylori的耐藥率逐年攀升，這使得尋求新的抗H.pylori突破口成為一個亟待解決的問題。頭花蓼作為一種傳統(tǒng)的藥用植物，因其具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、降溫和抗氧化活性等療效而被廣泛使用［5］。我們前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)頭花蓼對于H.pylori感染性疾病具有良好的療效，其既可抑制細菌生長代謝，又能夠調(diào)整機體內(nèi)環(huán)境，提高機體對細菌的抵抗能力［6］。

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法系統(tǒng)性地對頭花蓼中3種有效化合物治療幽門螺桿菌胃炎以及胃癌的作用機制進行了探討。根據(jù)頭花蓼三種有效化合物對幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎及胃癌作用靶點的預(yù)測及相互作用分析的結(jié)果，篩選出頭花蓼在幽門螺桿菌胃炎以及胃癌的整個過程中均發(fā)揮作用的27個作用靶點。為了進一步了解這些基因的功能，對其進行了PPI分析和功能富集分析。結(jié)果表明在頭花蓼的作用過程中，一些hub基因，如TP53、CASP3、PTGS2、IL6、JUN和CXCL8發(fā)揮著重要作用。其中IL6、JUN和CXCL8是炎癥相關(guān)因子，是H.pylori引起的炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵基因［10-12］；TP53、CASP3和PTGS2則與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，對degree值前6的核心靶點和其相對應(yīng)的化合物分子使用 AutoDock 軟件進行分子對接，結(jié)果表明分子與靶點蛋白的最低結(jié)合能均小于0，說明配體與受體均可以自發(fā)結(jié)合，且80%的最低結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol，進一步證實了本研究前期預(yù)測的準確性。腫瘤抑制基因P53（TP53）位于17號染色體，是一種重要的抑癌基因，在細胞的衰老、凋亡、分化及代謝過程中具有重要作用。有研究稱TP53基因72號密碼子的多態(tài)性，與人類胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［13］。周展新等［14］發(fā)現(xiàn)TP53在胃癌及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中呈現(xiàn)高表達，其表達與胃癌的分化程度、腫瘤的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。CASP3在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，吳靜潔等［15］稱，柚皮素可以與CASP3結(jié)合，并阻滯細胞周期、誘發(fā)細胞程序性死亡，能發(fā)揮抗腫瘤以及抑制新生血管形成的作用。在本研究中，頭花蓼中的槲皮素、沒食子酸和槲皮苷均與CASP3對接較好，且槲皮素、沒食子酸也能夠和TP53自發(fā)結(jié)合，這些結(jié)果提示TP53和CASP3可能是頭花蓼作用于幽門螺桿菌胃炎以及胃癌的重要靶點。除此之外，炎癥反應(yīng)、受體復(fù)合物、蛋白質(zhì)異二聚體活性、細胞凋亡信號通路、TNF信號通路等也參與了頭花蓼的治療過程。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)證實了頭花蓼三種有效化合物在治療幽門螺桿菌胃炎以及胃癌過程中有顯著優(yōu)勢，具有多靶點、多途徑的特點，頭花蓼可能通過TP53和CASP3在治療幽門螺桿菌胃炎以及胃癌過程發(fā)揮作用。這些發(fā)現(xiàn)表明頭花蓼可能成為治療幽門螺桿菌胃炎以及胃癌的候選藥物，為幽門螺桿菌胃炎以及胃癌的治療和頭花蓼老藥新用提供了新的依據(jù)。