新疆豆制品生產(chǎn)環(huán)境中肉毒梭菌的分離鑒定*

劉凱，盧士玲，李開雄

(石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子，832000)

肉毒梭菌(Clostridium botulinum)屬于厭氧性梭狀芽孢桿菌屬，是具有厭氧性的桿狀菌，能形成芽孢，芽孢比繁殖體寬，呈梭狀，革蘭氏染色為陽性［1］。肉毒梭菌被證實(shí)能在厭氧環(huán)境中生長(zhǎng)，即使侵入胃腸道內(nèi)也不發(fā)芽增殖，而是隨糞便排出［2］。當(dāng)在營(yíng)養(yǎng)豐富，高度厭氧的條件下芽孢即轉(zhuǎn)變?yōu)榫w且可產(chǎn)生強(qiáng)烈外毒素-肉毒毒素(Botulinum neurotoxin)［3］。肉毒毒素是1種特殊的蛋白質(zhì)，性質(zhì)穩(wěn)定，毒力比氰化鉀毒力高1萬多倍，小鼠LD50為1.0ng/kg，對(duì)人的致死量為1.0pg/kg，是現(xiàn)今已知化學(xué)毒物和細(xì)菌毒素中毒性最強(qiáng)的一種［4］。自“911”恐怖襲擊事件后，美英等西方國家便把其列為最有可能被使用的生物恐怖劑之一［5］。

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，1949～2001年，我國已有20個(gè)省、區(qū)先后發(fā)生肉毒中毒908起，其中新疆718起，占中毒次數(shù)的79.07%，全國中毒人數(shù)3 903人，其中新疆2 259人，占57.88%［6］。新疆為肉毒毒素中毒高發(fā)區(qū)，豆制品中肉毒毒素中毒屢見報(bào)端，在一定程度上制約了新疆豆制品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)從豆制品加工廠附近土壤中分離出一株肉毒梭菌，應(yīng)用病原形態(tài)學(xué)鑒定、細(xì)菌生理生化分析、凝膠電泳成像及16SrDNA測(cè)序分析相結(jié)合的方法對(duì)分離出的肉毒梭菌進(jìn)行鑒定。為今后豆制品中肉毒梭菌的檢測(cè)，及控制技術(shù)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品與儀器

采集豆制品生產(chǎn)環(huán)境附近的土壤樣品，其中菜市場(chǎng)20份，豆制品加工廠附近15份，污水溝旁草地15份，食品廠污水淤泥:10份，共計(jì)60份。以上樣品均采自伊寧市察布查爾縣。

細(xì)菌DNA試劑盒購自北京諾維森生物科技有限公司，PCR擴(kuò)增所需引物為3種:通用引物，上游引物為 U968:5’－AACGCG AAG AACCTT AC－3’，下游引物為 L1401:5’-GCGTGTGTACAA GACCC-3’;A上:5＇GTGATACAACCAGATGGTAGTTATAG3＇，A 下:5＇AAAAAACAAGTCCCAATTATTAACTTT3＇;B 上:5＇GAGATGTTTGTGAATATTATGATCCAG3＇，B 下:5＇GTTCATGCATTAATA TCAAGGCTGG3＇。由上海生工生物工程有限公司合成。表1和表2為其反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)。

表1 PCR反應(yīng)體系

表2 PCR反應(yīng)參數(shù)

1.0 %葡萄糖庖肉培養(yǎng)基:

蛋白胨12 g，牛肉浸液400 mL，酵母浸膏2 g，葡萄糖1.2 g，NaHPO42 g，碎肉渣適量，調(diào)節(jié)pH為7.4～7.6。

制法:牛肉浸液制法:取新鮮(除脂肪和筋膜)牛肉200 g，加蒸餾水400 mL和1 mol/L NaOH 10 mL，攪拌煮沸15 min，充分冷卻，除去表層脂肪，澄清過濾，加水補(bǔ)足至400 mL。將牛肉碎塊裝于試管，每管約15 mm高。然后加入pH 7.4～7.6的牛肉浸液及其他成分，再于121℃滅菌20 min備用。

卵黃瓊脂(EYA)培養(yǎng)基:

胰蛋白胨12 g，蛋白胨8 g，NaCl 2 g，瓊脂粉8 g，牛肉浸膏20 g，蒸餾水400 mL，50%蛋黃鹽水40 mL。

制法:取新鮮雞蛋，經(jīng)75%乙醇浸泡1h后，再于無菌操作下取出卵黃放入量筒，再加入等量無菌生理鹽水混勻即得蛋黃鹽水，除蛋黃鹽水外其余成分混合，加熱溶解調(diào)節(jié)至pH值7.3～7.4，121℃滅菌20 min，冷至60℃加入50%的蛋黃鹽水，混勻傾注平板。

發(fā)酵培養(yǎng)基:

0.04 %溴甲酚紫水溶液5 mL，蛋白胨4 g，乳糖(葡萄糖或蔗糖或麥芽糖)2 g，蒸餾水200 mL。

制法:將蛋白胨和乳糖(葡萄糖或蔗糖或麥芽糖)溶于水中，校正pH，加入指示劑，115℃高壓滅菌15 min。

石蕊牛奶培養(yǎng)基:

10% ～15%脫脂奶粉溶液100 mL，石蕊乙醇液2.5 mL

石蕊乙醇液的制法:8g石蕊在34 mL 40%乙醇中研磨，取上清液，重復(fù)操作2次。加40%乙醇到總量為100 mL，并煮沸1 min，取用上清液。上述成分混勻分裝試管，每管5～10 mL 115℃滅菌20 min。

明膠培養(yǎng)基:

牛肉浸膏0.6g，蒸餾水200 mL，蛋白胨1 g，明膠24 g。

制法:各成分加入蒸餾水中，浸泡約20 min，隨時(shí)攪拌，加熱溶解，調(diào)節(jié)至pH 7.5，分裝小試管，115℃滅菌20 min。

EL3002電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SW-CJ-超凈臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;GMSX-280型壓力蒸汽消毒器，北京市永光明醫(yī)療儀器廠;GRX20型干熱消毒箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;電子萬用爐，北京市永光明醫(yī)療儀器廠;MCL-3型微波爐，微波化學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器廠;DMI4000B置熒光顯微鏡，Leica公司;BIO-RAD凝膠成像儀，美國BIO-RAD公司;BIO-RAD電泳儀，美國BIO-RAD公司;高速冷凍離心機(jī)，德國eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

1.2.1.1 熱處理法

樣品預(yù)處理采用乙醇處理法［7］。以50%乙醇與樣品混合作用1h，然后稀釋、均質(zhì)備用。

1.2.2 富集培養(yǎng)

預(yù)處理過的樣品液吸取0.2 mL，加入到裝有20 mL庖肉培養(yǎng)基的試管中，30℃培養(yǎng)5 d，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況。庖肉培養(yǎng)基用液體石蠟封液面，在使用前于沸水中煮沸15 min后急速冷卻，再接種待檢物，厭氧培養(yǎng)。

1.2.3 分離培養(yǎng)

于卵黃瓊脂培養(yǎng)基(EYA)上進(jìn)行劃線分離，用焦性沒食子酸除氧法35℃厭氧培養(yǎng)48h［8］，同時(shí)設(shè)有氧環(huán)境對(duì)照。挑選菌落形態(tài)與C．botulinum相似的菌落革蘭氏染色觀察，多次分離，直至得到形態(tài)單一的菌落并將類似菌落進(jìn)行菌株保存。

1.2.4 目標(biāo)菌的形態(tài)觀察及生理生化測(cè)定

仔細(xì)觀察細(xì)菌在庖肉培養(yǎng)基和EYA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況和菌落形態(tài)，同時(shí)通過革蘭氏染色觀察細(xì)菌形態(tài)。將在EYA培養(yǎng)基上培養(yǎng)了48 h的細(xì)菌接種到不同的生理生化鑒定培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)48h。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［9］鑒定反應(yīng)結(jié)果。

1.2.5 目的基因的PCR及16SrDNA V6-V8片段的序列測(cè)定

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)期的新鮮菌液，依細(xì)菌DNA試劑盒的操作說明提取基因組DNA。PCR反應(yīng)體系及參數(shù)如表1和表2所示。通用引物擴(kuò)增目標(biāo)片段為430bp左右，A型肉毒毒素基因擴(kuò)增目標(biāo)片段為980bp左右，B型肉毒毒素基因擴(kuò)增目標(biāo)片段為490 bp左右。用BioRad凝膠成像系統(tǒng)照相，通用引物所擴(kuò)增PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因公司測(cè)序。

1.2.6 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

將所測(cè)得的16SrRNA基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，用BLAST進(jìn)行相關(guān)序列的搜索，與Gen-Bank中現(xiàn)有的近緣菌株的序列比較，并從數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)屬、相關(guān)種的16SrRNA序列，建立系統(tǒng)發(fā)育樹［10］。序列用CLUSTAL X program軟件對(duì)齊，進(jìn)化距離的計(jì)算應(yīng)用鄰接法neighbor-joining method，采用p-distances法和Kimura-2parameter雙參數(shù)法進(jìn)行，進(jìn)化樹分支模式的穩(wěn)定性用MEGA v．3.1軟件分析，采用bootstrap法，重復(fù)次數(shù)為1 000，構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)菌的富集培養(yǎng)和分離純化結(jié)果

2.1.1 目標(biāo)菌的富集培養(yǎng)結(jié)果

60份樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)的結(jié)果見表3。

表3 富集培養(yǎng)結(jié)果

在初步鑒定出的7份50%乙醇處理液的樣品庖肉培養(yǎng)管中，牛肉渣部分表面變黑，肉塊呈暗紅色，培養(yǎng)液黏稠渾濁，產(chǎn)生氣泡且伴有惡臭。

其余的樣品中有38份培養(yǎng)液黏稠渾濁，但有白色絮狀物沉積在管底，肉渣無明顯變色。另有15份無明顯現(xiàn)象。

培養(yǎng)結(jié)果表明，其中7種樣品的培養(yǎng)特征與肉毒梭菌的培養(yǎng)特征相似，因此將這7種樣品的庖肉培養(yǎng)液接種到分離培養(yǎng)基上進(jìn)行初步分離。

2.1.2 分離培養(yǎng)結(jié)果

將富集培養(yǎng)的7種樣品培養(yǎng)液稀釋涂布到EYA平板上，分做2份，30℃的恒溫培養(yǎng)箱中分別進(jìn)行有氧和厭氧的培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h，觀察生長(zhǎng)情況及菌落形狀，如表4所示。

表4 七種樣品EYA平板上的菌落形態(tài)

由表4可知，菜市場(chǎng)16號(hào)、豆制品加工廠3號(hào)、食品廠污水淤泥8號(hào)的培養(yǎng)液在EYA平板上生長(zhǎng)出的菌落形態(tài)與所要篩選的肉毒梭菌的菌落形態(tài)相似。

將這3種樣品，在EYA平板上反復(fù)劃線分離，直至鏡檢觀察中未發(fā)現(xiàn)雜菌，同時(shí)挑取新鮮培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)。根據(jù)菌體形態(tài)觀察初步斷定食品加工廠3號(hào)樣品為肉毒梭菌，此待檢菌暫命名為JGC－3。

挑取JGC-3菌在EYA平板上的菌落，如圖1所示，做革蘭氏染色。鏡檢結(jié)果見圖2，待檢菌JGC-3為粗大桿菌，兩側(cè)平行，兩端鈍園，直桿狀或稍彎曲，芽孢為卵圓形，位于次極端，呈網(wǎng)球拍形，革蘭氏染色陽性，呈現(xiàn)肉毒梭菌的個(gè)體形態(tài)特征。

圖1 EYA平板上JGC-3菌的菌落形態(tài)

圖2 JGC-3菌革蘭氏染色油鏡鏡檢結(jié)果

2.2 生理生化特性

JGC-3菌的生理生化特性與A型肉毒梭菌一致，即可分解葡萄糖、麥芽糖、果糖、蔗糖，不發(fā)酵半乳糖、甘露醇、甘露糖。石蕊牛乳培養(yǎng)基變藍(lán)色，說明該菌株分解酪蛋白，產(chǎn)生堿性物質(zhì)，使石蕊變藍(lán)色，在培養(yǎng)后期，產(chǎn)生大量氣體。明膠液化試驗(yàn)中，明膠最后呈液體狀態(tài)，屬陽性反應(yīng)，說明JGC-3菌含膠原酶(蛋白分解酶)，將明膠分解為氨基酸，使明膠低于20℃時(shí)不再凝固，呈液化狀態(tài)。

2.3 凝膠電泳與系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.3.1 肉毒毒素基因和16SrDNA V6-V8片段的擴(kuò)增

由分離菌株JGC-3的電泳圖譜(圖3)可以看到，采用A型肉毒毒素基因引物所擴(kuò)增出的條帶在目標(biāo)條帶附近，所得到的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度與實(shí)際相符。采用B型肉毒毒素基因引物為陰性，同時(shí)空白樣反應(yīng)也為陰性。

2.3.2 16SrDNA V6-V8的序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

圖3 分離菌株JGC-3的肉毒毒素基因和16S rDNA V6-V8片段的PCR產(chǎn)物的電泳圖譜

將獲得的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast分析，結(jié)果表明菌株 JGC-3的16SrDNA V6-V8序列(GenBank登錄號(hào):JN248616)與GenBank基因庫中同源性最為接近的菌株均為梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)，表明該菌屬于所均屬的細(xì)菌。下載同源性較高的細(xì)菌序列，用CLUSTAL X program軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明:JGC-3與GenBank報(bào)道的其他A型肉毒梭菌株形成一個(gè)簇群，與GenBank中登錄號(hào)為X73844.1的A型肉毒梭菌的親緣關(guān)系最近，結(jié)合該菌的形態(tài)學(xué)和生理生化特性，將其鑒定為A型肉毒梭菌，序列比對(duì)的同源性分析和進(jìn)化樹構(gòu)建如圖4所示。

圖4 JGC-3及相關(guān)梭菌屬菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從新疆察布查爾錫伯族自治縣的土壤中分離出一株細(xì)菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和生理生化特征分析，結(jié)合16SrDNA序列分析對(duì)其進(jìn)行研究，主要結(jié)論如下:

(1)在生理生化鑒定中，目標(biāo)菌可分解葡萄糖、麥芽糖、果糖、蔗糖，不發(fā)酵半乳糖、甘露醇、甘露糖。石蕊牛乳培養(yǎng)基變藍(lán)色，在培養(yǎng)后期，產(chǎn)生大量氣體。明膠液化試驗(yàn)中，明膠最后呈液體狀態(tài)，反應(yīng)呈陽性。

(2)采用通用引物和特異性引物對(duì)目標(biāo)菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)有清晰條帶。所得PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析后，其與GenBank中A型肉毒梭菌序列相似度高達(dá)97%，將其確定為A型肉毒梭菌。

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