馬鈴薯與致病疫霉互作研究進(jìn)展與展望

田峰奇, 王路遙,2, 董莎萌*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，卵菌與真菌分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所，深圳 518120)

馬鈴薯是關(guān)涉我國糧食安全和脫貧攻堅(jiān)重大戰(zhàn)略的農(nóng)作物之一,兼具主糧、菜用和飼用等重要功能。我國于2009年啟動(dòng)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè),依托技術(shù)研發(fā)中心和各地試驗(yàn)站,推動(dòng)馬鈴薯育種、病蟲害防控、土肥栽培、機(jī)械、貯藏加工、產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)等相關(guān)領(lǐng)域的研究[1]。2013年,國家馬鈴薯主糧化項(xiàng)目組成立并著手開展馬鈴薯主糧化關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)與示范工作,初步驗(yàn)證了馬鈴薯主糧化的可行性[2]。2015年1月,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院、國家食物與營養(yǎng)咨詢委員會(huì)、中國種子協(xié)會(huì)共同召開馬鈴薯主糧化發(fā)展戰(zhàn)略研討會(huì),會(huì)議強(qiáng)調(diào)了推進(jìn)馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的必要性,提出了馬鈴薯主糧化的目標(biāo)和基本原則,標(biāo)志著我國馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略正式啟動(dòng)[3-4];2015年6月,農(nóng)業(yè)部辦公廳印發(fā)《農(nóng)業(yè)部貫徹落實(shí)黨中央國務(wù)院有關(guān)“三農(nóng)”重點(diǎn)工作實(shí)施方案》,將馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略作為工作重點(diǎn)[5]。隨著主糧化戰(zhàn)略的推進(jìn),我國馬鈴薯相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速,2021年栽培面積達(dá)578萬hm2(FAO數(shù)據(jù))[6],目前已成為全世界馬鈴薯種植面積最大的國家,且馬鈴薯消費(fèi)潛力仍未得到充分挖掘[7]。保障我國馬鈴薯安全生產(chǎn)已成為當(dāng)前確保我國糧食安全的重要路徑之一。

作物疫病是全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重大病害之一,給全球的糧食和生態(tài)安全帶來嚴(yán)重威脅,每年造成我國馬鈴薯、番茄等蔬菜作物及大豆等經(jīng)濟(jì)作物的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)百億元[8]。其中,晚疫病(late blight)是由致病疫霉Phytophthorainfestans侵染馬鈴薯造成的毀滅性病害,也是目前馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要障礙之一,因其歷史上直接引發(fā)了19世紀(jì)40年代的愛爾蘭大饑饉而備受關(guān)注,100多年來,科學(xué)家持續(xù)不斷地與迅速變異的晚疫病菌作斗爭。目前,我國大量栽培中感、高感晚疫病的馬鈴薯品種,感病品種種植面積達(dá)50%,受晚疫病威脅大[9-12]。近年來,我國晚疫病發(fā)生范圍廣、危害大,年平均發(fā)病面積近200萬hm2,可達(dá)馬鈴薯平均種植面積的40%;2012年,我國北方馬鈴薯產(chǎn)區(qū)6月-8月降水量高于往年同期,較高的濕度為晚疫病發(fā)生創(chuàng)造了條件,全國多個(gè)產(chǎn)區(qū)發(fā)生晚疫病大流行,甘肅、湖北等省份晚疫病發(fā)生面積超過種植面積的80%,病株率一般60%～100%,部分地區(qū)甚至絕收;2008年-2017年全國馬鈴薯晚疫病年平均造成損失37.67萬t,占所有馬鈴薯病害造成損失的63.54%;2017年-2021年間,云南紅河州東馬鈴薯產(chǎn)區(qū)晚疫病發(fā)病面積占種植面積的近30%,使當(dāng)?shù)伛R鈴薯產(chǎn)業(yè)嚴(yán)重受損[13-15]。2023年,預(yù)測我國馬鈴薯晚疫病發(fā)病面積可達(dá)166.67 hm2[12],為晚疫病防治提出了高要求。晚疫病也同樣威脅全球馬鈴薯生產(chǎn),例如愛沙尼亞持續(xù)受到多變的晚疫病菌株的威脅,2012年當(dāng)?shù)赝硪卟“l(fā)生較重,一些地區(qū)感病品種的馬鈴薯葉片在12～15 d內(nèi)被完全破壞[16-17];在印度,馬鈴薯和番茄晚疫病每隔2～3年會(huì)發(fā)生大流行,造成高達(dá)75%的產(chǎn)量損失[18-19]。Savary等調(diào)查2010年-2014年全球作物生產(chǎn)情況,分析病蟲害對(duì)主要作物造成的產(chǎn)量損失,發(fā)現(xiàn)病蟲害引起全球馬鈴薯產(chǎn)量損失約17.2%,其主要損失來自馬鈴薯晚疫病,在全球引起損失超過7%,個(gè)別地區(qū)超過10%,遠(yuǎn)超其他馬鈴薯病蟲害[20]。

歐洲于2009年啟動(dòng)了EuroBlight項(xiàng)目,該項(xiàng)目前身來自1996年-2000年的歐洲馬鈴薯晚疫病綜合防治戰(zhàn)略發(fā)展網(wǎng)絡(luò)(European network for development of an integrated control strategy of potato late blight),以及2003年-2006年的歐洲馬鈴薯晚疫病網(wǎng)絡(luò)(a potato late blight network for Europe),旨在統(tǒng)合晚疫病的監(jiān)測和研究結(jié)果,開展全面、高效的晚疫病防控[21]。2022年,EuroBlight收集了來自22個(gè)國家和地區(qū)的1 100余份致病疫霉菌株,發(fā)現(xiàn)含有EU43基因型的晚疫病樣本比例正在增加,而這一菌株已被證實(shí)對(duì)雙炔酰菌胺(mandipropamid)等殺菌劑表現(xiàn)出抗藥性[22],這為后續(xù)晚疫病的防治策略提供了重要參考。與之類似,美國于2011年啟動(dòng)了USABlight項(xiàng)目,開展晚疫病的監(jiān)測與分析工作[23]。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2023年頒布的《一類農(nóng)作物病蟲害名錄》中包含10種蟲害和8種病害,馬鈴薯晚疫病位列其中[24],明確了晚疫病防治為我國重要的植保工作之一。近年來,我國開展了一系列馬鈴薯抗晚疫病育種專項(xiàng)研究,同時(shí)國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃也對(duì)相關(guān)研究起到了重要推動(dòng)作用[25-26];農(nóng)業(yè)農(nóng)村部多次公布馬鈴薯晚疫病防控技術(shù)方案、馬鈴薯重大病蟲害防控技術(shù)方案、糧食作物重大病蟲害防控技術(shù)方案,建立防控體系,為我國晚疫病防治工作提供保障[27-29]。在這樣的背景下,進(jìn)一步解析馬鈴薯晚疫病致病機(jī)制和分子互作機(jī)理,為推動(dòng)晚疫病防治提供理論基礎(chǔ),已成為當(dāng)下植物病理學(xué)研究的重要目標(biāo)。本文主要綜述致病疫霉致病機(jī)制和寄主抗病機(jī)理領(lǐng)域的研究進(jìn)展,以期對(duì)未來研究和防治晚疫病提供參考。

1 我國晚疫病研究狀況概要

我國對(duì)馬鈴薯晚疫病的研究可追溯到20世紀(jì)中葉。1952年,楊昌壽等報(bào)道重慶近郊的巴縣新發(fā)鄉(xiāng)連年受晚疫病為害,造成產(chǎn)量損失超過80%,并通過建立示范田、宣傳預(yù)防性噴施波爾多液,取得了一定的防治效果;楊昌壽等明確提出,徹底解決馬鈴薯晚疫病需要選育良種、合理栽培等多種手段結(jié)合[30]。關(guān)益周報(bào)道山西省雁北地區(qū)馬鈴薯晚疫病危害嚴(yán)重,部分田塊引發(fā)絕收,對(duì)抗性品種需求迫切,并在田間通過改良栽培措施提高晚疫病抗性[31]。1953年-1954年,林傳光等在河北省張家口地區(qū)的農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站開展了晚疫病田間觀察與試驗(yàn),其結(jié)果于1955年發(fā)表于《植物病理學(xué)報(bào)》,這是我國第一篇系統(tǒng)性研究晚疫病致病規(guī)律和防治方法的研究論文,對(duì)晚疫病發(fā)病時(shí)間、中心病株特征、每一代傳播距離、病害蔓延速度、平均病程時(shí)長等特征進(jìn)行了觀測與描述,并檢驗(yàn)了銅離子殺菌劑的防治效果,測試了最優(yōu)的施用方法[32]。之后,林傳光等繼續(xù)開展晚疫病田間研究,通過接菌試驗(yàn)和田間觀察,認(rèn)為當(dāng)?shù)伛R鈴薯晚疫病主要初侵染源是帶菌薯塊;對(duì)中心病株的產(chǎn)生和病原菌傳播規(guī)律進(jìn)行了分析和解讀,強(qiáng)調(diào)氣象環(huán)境對(duì)晚疫病發(fā)病情況影響極大,可以根據(jù)天氣情況預(yù)測中心病株的出現(xiàn)時(shí)間;并提議在各地開展試驗(yàn),記錄晚疫病發(fā)展情況,為預(yù)測預(yù)報(bào)提供支持[33-35]。此后,全國各地展開了對(duì)馬鈴薯晚疫病預(yù)測預(yù)報(bào)和防治方法的研究。有機(jī)汞制劑、植物源農(nóng)藥開始被應(yīng)用于晚疫病防治,改變了當(dāng)時(shí)完全依賴銅離子制劑的局面[36-37];新栽培措施得到推廣,例如湖北宣恩縣勞動(dòng)模范徐樹民開發(fā)的催苗方法和配套栽培措施有助于馬鈴薯苗提前出土、更早成熟,減輕晚疫病的危害[38];同期,對(duì)不同品種的抗病性評(píng)估和抗性育種研究逐漸展開,篩選出一系列對(duì)晚疫病抗性顯著的馬鈴薯品種[39-40]。1999年,四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院何衛(wèi)博士和河北農(nóng)業(yè)大學(xué)張志銘教授應(yīng)邀在全球馬鈴薯晚疫病防治行動(dòng)組織(Global Initiative on Late Blight,GILB)開展的世界馬鈴薯晚疫病學(xué)術(shù)大會(huì)上發(fā)言,介紹我國晚疫病綜合防治研究成果[41]。近年來,我國研究人員在相關(guān)應(yīng)用領(lǐng)域內(nèi)的研究不斷獲得突破,對(duì)現(xiàn)有抗病資源的解析和利用為新抗病資源的發(fā)掘帶來了一系列抗病基因儲(chǔ)備[42-43],新型生防制劑、生物源農(nóng)藥和新型RNA農(nóng)藥表現(xiàn)出良好的防效,有助于進(jìn)一步減少化學(xué)農(nóng)藥的施用量[44-46];基于物聯(lián)網(wǎng)技術(shù)的晚疫病監(jiān)測手段結(jié)合預(yù)測預(yù)報(bào)技術(shù),能夠有效預(yù)測晚疫病流行情況[47]。各方面應(yīng)用技術(shù)的發(fā)展一定程度上有效地指導(dǎo)晚疫病的田間防治。

我國在致病疫霉生物學(xué)特性和病理學(xué)基礎(chǔ)理論層面也取得重要進(jìn)展。1962年,張明厚等注意到,分離自不同抗性水平馬鈴薯品種上的致病疫霉菌株致病性存在差異,抗病品種上分離的菌株可以侵染感病品種,而感病品種分離菌株則難以侵染抗病品種[48]。周茂繁也記錄了類似的現(xiàn)象,且證明感病品種分離的弱毒力菌株在中抗品種上連續(xù)多代接種、適應(yīng)后,致病性增強(qiáng),可以侵染抗病品種。盡管受限于理論局限,但基于這些現(xiàn)象,研究者已意識(shí)到監(jiān)測致病疫霉生理小種演變的重要性[49]。在這之后,越來越多研究針對(duì)馬鈴薯晚疫病發(fā)病特點(diǎn)、致病機(jī)制、抗性品種選育、化學(xué)防治手段和預(yù)測預(yù)報(bào)方法開展,為我國馬鈴薯晚疫病防治提供了扎實(shí)的理論基礎(chǔ)[50-53]。研究者于2003年和2010年分別對(duì)我國多地的致病疫霉菌株進(jìn)行了整理和分析,歸納了生理小種分布,并鑒定到能克服大量抗病基因的超級(jí)毒力小種[54-55];2019年,又對(duì)我國馬鈴薯病蟲害發(fā)生情況和防治現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)[56]。2002年,Ballvora 等克隆了馬鈴薯抗病基因R1,這是第一個(gè)被成功克隆的抗晚疫病基因[57]。隨后,我國學(xué)者黃三文克隆到馬鈴薯抗晚疫病基因R3a,并參與篩選與R3a相對(duì)應(yīng)的馬鈴薯晚疫病無毒基因Avr3a[58-60],驗(yàn)證了馬鈴薯-晚疫病菌互作過程中的基因?qū)驅(qū)W說。近年來,我國科研人員在晚疫病菌與病原物互作機(jī)制領(lǐng)域取得了許多成果,例如董莎萌教授課題組發(fā)現(xiàn)致病疫霉效應(yīng)分子調(diào)控寄主選擇性剪接的新機(jī)制[61];詹家綏教授課題組發(fā)現(xiàn)致病疫霉調(diào)控寄主氣孔張開的新毒力機(jī)制以及效應(yīng)分子逃避寄主免疫的新原理[62-63];田振東教授課題組鑒定了一系列在馬鈴薯-晚疫病菌互作過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的信號(hào)分子[64-66],大大豐富了基礎(chǔ)理論。相關(guān)理論的迅速發(fā)展將為晚疫病的防治提供新的思路。

2 致病疫霉侵染機(jī)制研究進(jìn)展

2.1 致病疫霉的侵染與致病過程

致病疫霉具有發(fā)達(dá)的無隔菌絲,可以在寄主植物或植物殘?bào)w表面生長,并形成不同類型的孢子用于擴(kuò)散或抵抗不良環(huán)境。一部分菌絲頂端會(huì)生長出多核的孢子囊(sporangium)[67],在較高的溫度下,孢子囊可以直接萌發(fā),從孢子囊壁上產(chǎn)生新生菌絲;而在低溫、潮濕的環(huán)境下,孢子囊將會(huì)發(fā)生細(xì)胞質(zhì)分裂,形成游動(dòng)孢子(zoospore)并將其釋放,這一誘導(dǎo)過程被稱為“冷休克”(cold shock);游動(dòng)孢子活動(dòng)一段時(shí)間后休止,并萌發(fā)出芽管,侵染寄主植物(圖1,圖2)。孢子囊和游動(dòng)孢子都不能耐受長時(shí)間的惡劣環(huán)境[67-68]。

圖1 致病疫霉的侵染循環(huán)Fig.1 Infection cycle of Phytophthora infestans

圖2 致病疫霉的侵入、侵染和產(chǎn)孢過程Fig.2 Entry, infection and sporulation of Phytophthora infestans

致病疫霉通過有性生殖可以產(chǎn)生卵孢子(oospore),卵孢子能在土壤中長期存活,抵抗較惡劣的環(huán)境,作為下一個(gè)生長季節(jié)的初侵染來源,為晚疫病防治帶來更多的壓力(圖1)[68-69]。有性生殖過程依賴于A1、A2兩種交配型(mating type)菌株之間交配激素(mating hormones)的交流,而交配激素在疫霉屬內(nèi)是相對(duì)保守的,暗示種間雜交的可能性;此外,一些菌株可以同時(shí)分泌不同類型的交配激素[70-71]。A2交配型的菌株曾只在墨西哥被發(fā)現(xiàn),直至1984年于瑞士被鑒定到[72];1996年,我國內(nèi)蒙古自治區(qū)和山西省首次采集到A2交配型菌株[73]。近年來,我國致病疫霉種群結(jié)構(gòu)處于快速變化中,各地菌株的種群結(jié)構(gòu)差異極大;且在部分地區(qū),能夠自發(fā)產(chǎn)生卵孢子的自育型菌株已占據(jù)優(yōu)勢,這可能是由于自育型菌株具有更強(qiáng)的生活力和侵染能力[74-76]。未來,有必要持續(xù)關(guān)注各地致病疫霉種群結(jié)構(gòu)變化,檢測新型變異菌株的產(chǎn)生和流行,并對(duì)土壤中可能存在的卵孢子做預(yù)防處理。

致病疫霉的產(chǎn)孢過程涉及一系列信號(hào)通路的調(diào)節(jié),G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor, GPCR)通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號(hào)通路參與到疫霉不同類型孢子的產(chǎn)生過程中[77-80],近年研究還發(fā)現(xiàn)特定效應(yīng)分子與致病疫霉產(chǎn)孢調(diào)節(jié)有關(guān),例如4個(gè)RxLR效應(yīng)分子基因在有性生殖過程中被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá);而利用發(fā)夾結(jié)構(gòu)敲低效應(yīng)分子Avrblb2基因的表達(dá)量后,卵孢子的產(chǎn)生量隨之顯著下降[81]。一類在真核生物中非常重要的轉(zhuǎn)錄因子——MADS-box家族轉(zhuǎn)錄因子,也被發(fā)現(xiàn)是致病疫霉產(chǎn)孢所必需的,該研究為解析疫霉產(chǎn)孢調(diào)控機(jī)制和演化過程提出了新的思路[82-83]。進(jìn)一步解析致病疫霉的生長調(diào)控機(jī)制,開展針對(duì)性的研究和管理,對(duì)于晚疫病防治具有積極意義。

2.2 致病疫霉的穿透與侵入

致病疫霉穿透寄主表面的過程涉及多種酶的作用,例如使用致病疫霉培養(yǎng)液中的半乳糖酶處理馬鈴薯細(xì)胞壁,可以分解高達(dá)23%的細(xì)胞壁組分[84],導(dǎo)致細(xì)胞壁強(qiáng)度下降;新的研究發(fā)現(xiàn),一系列銅依賴的裂解多糖單加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenase, LPMO)參與分解植物細(xì)胞壁中的果膠,沉默致病疫霉中的一個(gè)LPMO基因PiAA17C將導(dǎo)致幾乎無法侵染,證明了化學(xué)機(jī)制在疫霉侵入過程中的重要性[85]。

近年來一系列研究逐步闡明了疫霉侵入植物表面的機(jī)械性機(jī)制。研究者注意到,致病疫霉菌絲侵入時(shí)總是傾斜的,而非真菌那樣垂直侵入;隨后他們使用透明的聚二甲基硅氧烷(psolydimethylsiloxane, PDMS)材質(zhì)代替葉片以方便進(jìn)一步觀察。致病疫霉的游動(dòng)孢子在PDMS表面表現(xiàn)出與在寄主植物上類似的生長特點(diǎn),游動(dòng)孢子休止后,萌發(fā)出芽管并黏附在基質(zhì)表面,最終以約(49±10)°的傾角斜向突破基質(zhì)表面。研究者觀察到,芽管前部的基質(zhì)材料出現(xiàn)延伸的裂縫,確認(rèn)侵入過程中施加的力是斜向的;進(jìn)一步的試驗(yàn)結(jié)果表明,這種斜向壓力依賴于細(xì)胞骨架的重組。研究者把這種有別于真菌的傾斜侵入方式命名為“naifu”——這來源于日語中的“刀”一詞,用以描述菌絲傾斜切入基質(zhì)表面的過程[86]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),接觸位置的菌絲中出現(xiàn)了放射狀分布的肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu),其中心指向侵入凹痕,這種放射狀結(jié)構(gòu)來源于細(xì)胞骨架的重組,雖然其強(qiáng)度并不足以支撐侵入過程,但它充當(dāng)了侵入過程中的自適應(yīng)機(jī)械骨架,有助于平衡、調(diào)整侵入過程中的機(jī)械應(yīng)力,從而維持侵入菌絲尖端的形狀,避免侵入過程中尖端鈍化,確保壓力集中[87]。

致病疫霉侵入植物內(nèi)部后,沿細(xì)胞間隙擴(kuò)展并于菌絲上形成指狀吸器(haustoria),深入附近植物細(xì)胞內(nèi)部,有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。近年的研究發(fā)現(xiàn),吸器作為分泌的主要部位,通過常規(guī)與非常規(guī)的分泌手段,將一系列與侵染過程相關(guān)的蛋白質(zhì)分泌到致病疫霉與植物的互作界面上,這些蛋白質(zhì)包括PAMPs、胞壁降解酶、轉(zhuǎn)化酶、效應(yīng)分子等等,這一過程對(duì)于成功侵染是必需的[88-90]。吸器外側(cè)包裹著一層植物細(xì)胞質(zhì)膜衍生而來的膜,稱為吸器外膜(extrahaustorial membrane,EHM),二者之間是被稱為吸器外基質(zhì)(extrahaustorial matrix)的狹窄空間。EHM上的膜蛋白與常規(guī)的細(xì)胞質(zhì)膜上的蛋白存在很大差異,一部分質(zhì)膜定位的蛋白質(zhì)被排除在EHM之外,而另一些特殊蛋白質(zhì)則被定向運(yùn)輸至EHM上,這一過程涉及植物囊泡運(yùn)輸系統(tǒng)的大規(guī)模重編程,并有可能同時(shí)受到病原菌的影響[91]。

疫霉侵染植物的根本目的在于吸收營養(yǎng)物質(zhì),在此過程中,吸器發(fā)揮著重要的作用。疫霉吸收營養(yǎng)的過程涉及到一系列營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)體,包括負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)糖、氨基酸、膽堿等小分子、硝酸鹽和磷酸鹽等離子的蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)錄組分析顯示,侵染過程中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)表現(xiàn)出時(shí)間與空間上的特異性,例如一部分轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在侵染前期(葉片或薯塊上)被強(qiáng)烈地誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),并在4～6 d后快速下調(diào);而另一個(gè)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因PITG_13011在馬鈴薯葉片中發(fā)生大幅度上調(diào)表達(dá),然而在塊莖中接種時(shí),這個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)量則變化較小,表現(xiàn)出了空間上、器官上的表達(dá)特異性。沉默硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因?qū)?dǎo)致致病疫霉幾乎無法侵染葉片,但對(duì)塊莖的毒力僅僅受到很小的影響,而且在培養(yǎng)基上的生長模式不受影響,這證明硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)量變化的這種空間特征是其對(duì)特定侵染狀況的適應(yīng)。進(jìn)一步的分析表明,環(huán)境中硝酸鹽離子的濃度、光照條件都可能影響硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的表達(dá)[92]?？傮w而言,全基因組范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)錄情況分析顯示轉(zhuǎn)運(yùn)體基因受到復(fù)雜的表達(dá)調(diào)控。

2.3 致病疫霉的效應(yīng)蛋白功能研究進(jìn)展

基因組、轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)研究大大推動(dòng)了致病疫霉效應(yīng)分子的發(fā)掘和機(jī)制解析。第一個(gè)完整的致病疫霉基因組于2009年公布,該基因組大小約240 Mb,遠(yuǎn)超大豆疫霉Phytophthorasojae(95 Mb)和櫟樹猝死病菌Phytophthoraramorum(65 Mb)[93]。研究者從致病疫霉基因組中預(yù)測了17 797個(gè)蛋白,數(shù)量超過大豆疫霉的16 988個(gè)和櫟樹猝死病菌的14 451個(gè)。基因組學(xué)研究開啟了效應(yīng)分子研究的新階段,研究者注意到致病疫霉的基因組是不均勻的,一部分區(qū)域密集編碼保守基因,且重復(fù)序列含量很低;而在高密度區(qū)域之間存在基因密度較低、保守性差、重復(fù)序列豐富的稀疏區(qū)[93]。進(jìn)一步研究表明,大量效應(yīng)分子定位于基因組的稀疏區(qū)域,數(shù)量也遠(yuǎn)超大豆疫霉和櫟樹猝死病菌[93]。值得注意的是,這種基因組結(jié)構(gòu)和基因密度分化引出了被稱為雙速基因組(two-speed genomes)的概念,該模型認(rèn)為致病疫霉基因組中重復(fù)序列豐富、基因稀疏的區(qū)域通過更快的演化,形成龐大而多變的效應(yīng)分子庫,幫助病原菌侵染;此外,更快的演化速度有助于病原物逃避寄主植物的免疫反應(yīng)[94]。目前,類似的基因組結(jié)構(gòu)和演化情況已被證實(shí)存在于其他病原微生物中,例如大麗輪枝菌Verticilliumdahliae[95]和禾谷鐮孢Fusariumgraminearum[96]。

2005年,一個(gè)重要的蛋白質(zhì)基序——RxLR(精氨酸-任意氨基酸-亮氨酸-精氨酸)被發(fā)現(xiàn),該基序廣泛存在于包括致病疫霉在內(nèi)的多種卵菌病原物的分泌蛋白中,通常位于蛋白質(zhì)N端附近[97]。致病疫霉的完整基因組序列被公布后,研究人員根據(jù)保守基序和其他特征,在致病疫霉菌株T30-4全基因組范圍內(nèi)預(yù)測到563個(gè)RxLR效應(yīng)分子[93]。RxLR基序廣泛存在于卵菌病原物中,曾被認(rèn)為介導(dǎo)效應(yīng)分子向寄主植物細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)[98],然而近年研究發(fā)現(xiàn),致病疫霉效應(yīng)分子AVR3a的RxLR基序可能在分泌前被切除,且這不影響它轉(zhuǎn)運(yùn)至植物細(xì)胞中,說明我們對(duì)RxLR基序的功能、對(duì)效應(yīng)分子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的認(rèn)知仍有不足[99]。另一類重要的效應(yīng)分子被稱為CRN效應(yīng)分子,這一名稱源自“Crinkling”和“Necrosis”,用于描述最早一批被鑒定的CRN效應(yīng)分子,具有引起本氏煙Nicotianabenthamiana葉片萎縮、褶皺和壞死的能力[100]。CRN效應(yīng)分子在N端50個(gè)氨基酸附近具有保守的LxLFLAK(亮氨酸-任意氨基酸-亮氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸-賴氨酸)基序,這一基序同樣被認(rèn)為介導(dǎo)效應(yīng)分子向植物細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)[101]。致病疫霉T30-4基因組中已預(yù)測到196個(gè)CRN效應(yīng)分子[93],這些成果開啟了致病疫霉的效應(yīng)分子組學(xué)研究,在此后致病機(jī)制和互作研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

效應(yīng)分子的分泌過程主要發(fā)生于吸器,且不同效應(yīng)分子涉及不同的分泌機(jī)制,例如利用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑布雷非德菌素A(Brefeldin A, BFA)處理菌絲,抑制從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的運(yùn)輸過程,將會(huì)導(dǎo)致胞間效應(yīng)分子PiEPIC1的分泌被完全阻斷,然而胞內(nèi)效應(yīng)分子Pi04314的分泌不受影響,表明在致病疫霉中,胞內(nèi)效應(yīng)分子可能遵循非傳統(tǒng)的分泌方式[88],這一點(diǎn)與先前在稻瘟病菌Pyriculariaoryzae上的相關(guān)研究結(jié)論一致[102]。進(jìn)一步闡明效應(yīng)分子的分泌機(jī)制,對(duì)于解析致病疫霉致病機(jī)理、篩選用于監(jiān)測和防治的關(guān)鍵位點(diǎn),將具有重要意義。

來源于致病疫霉88069菌株的CRN效應(yīng)分子CRN8在侵染期間被轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞核中,在本氏煙葉片上表達(dá)CRN8,可以導(dǎo)致葉片在5 d后壞死;然而瞬時(shí)表達(dá)CRN8 1 d后接種致病疫霉,則發(fā)現(xiàn)CRN8對(duì)致病疫霉的侵染有促進(jìn)作用;并且CRN8促進(jìn)侵染和引發(fā)壞死的能力都依賴于它的激酶結(jié)構(gòu)域[103]。此外,對(duì)辣椒疫霉Phytophthoracapsici的研究顯示,相當(dāng)一部分CRN效應(yīng)分子并不會(huì)引發(fā)壞死,且促進(jìn)了病原物對(duì)本氏煙的侵染[104];對(duì)大豆疫霉上的研究同樣證實(shí)了CRN效應(yīng)分子使病原菌毒力增強(qiáng),且發(fā)現(xiàn)一個(gè)CRN效應(yīng)分子CRN78靶向植物細(xì)胞質(zhì)膜上的水通道蛋白[105]。目前,針對(duì)致病疫霉中CRN效應(yīng)分子功能的研究相對(duì)較少,作用靶標(biāo)和機(jī)制有待進(jìn)一步發(fā)掘。

效應(yīng)分子的后續(xù)作用機(jī)制多樣而復(fù)雜,最顯而易見的證據(jù)在于不同效應(yīng)分子進(jìn)入植物細(xì)胞后亞細(xì)胞定位存在很大差異,例如對(duì)52個(gè)致病疫霉RxLR效應(yīng)分子的檢驗(yàn)顯示,其中41%存在于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì),25%僅定位于細(xì)胞核中,18%靶向細(xì)胞質(zhì)膜[106]。利用coIP/MS分析RxLR效應(yīng)分子靶向的互作蛋白,發(fā)現(xiàn)這些效應(yīng)分子可能涉及復(fù)雜的功能,包括蛋白質(zhì)翻譯、代謝調(diào)控、光合作用、囊泡運(yùn)輸?shù)萚107]。在這里,我們匯總了近年研究比較清楚的致病疫霉效應(yīng)分子及它們的作用靶標(biāo)和功能(表1)[61-62,64,66,108-127]。

表1 主要已知致病疫霉效應(yīng)分子及其功能Table 1 Main effectors of Phytophthora infestans and their functions

許多效應(yīng)分子作用于寄主免疫相關(guān)聯(lián)的靶標(biāo)和信號(hào)通路。MAPK信號(hào)通路作為調(diào)節(jié)真核細(xì)胞生理過程的重要信號(hào)通路,受到Pi13628、Pi17316、Pi21422、Pi22926等一系列效應(yīng)分子的影響[66,119,122,125],有趣的是Pi21422和Pi22926分別靶向StMAP3Kε和StMAP3Kβ2,而這二者在MAPK信號(hào)通路中的作用是平行的,致病疫霉通過兩個(gè)效應(yīng)分子分別靶向這兩個(gè)位點(diǎn)。蛋白質(zhì)的合成過程也受到大量效應(yīng)分子的直接或間接調(diào)控,其中Pi23226通過直接抑制寄主核糖體的生物合成影響全局水平的蛋白質(zhì)翻譯[126];蛋白質(zhì)合成過程中,mRNA前體發(fā)生選擇性剪接(alternative splicing)以產(chǎn)生多樣的轉(zhuǎn)錄本,剪接因子(splicing factors)參與這一過程,而一些致病疫霉效應(yīng)分子靶向剪接因子,影響植物細(xì)胞大量選擇性剪接事件的發(fā)生[61];另一個(gè)效應(yīng)分子Pi03192特異性定位于寄主的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜,其靶標(biāo)為NAC轉(zhuǎn)錄因子,這些轉(zhuǎn)錄因子在特定刺激下會(huì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上釋放,并重定位至細(xì)胞核內(nèi),調(diào)控后續(xù)轉(zhuǎn)錄;Pi03192通過阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的NAC轉(zhuǎn)錄因子釋放,影響它們后續(xù)的重定位,來干擾相關(guān)信號(hào)通路、影響特定蛋白質(zhì)合成[110-111]?？梢?病原菌的“攻擊”是多層次、大范圍的,從轉(zhuǎn)錄調(diào)控、選擇性剪接、翻譯等多個(gè)水平上影響蛋白質(zhì)的合成。

利用新分析方法和試驗(yàn)手段,從不同的思路發(fā)掘新型效應(yīng)分子,已成為病原物研究的重要方向。Huang 等設(shè)計(jì)了一個(gè)選擇性剪接報(bào)告系統(tǒng),該系統(tǒng)基于一個(gè)番茄的類受體蛋白激酶(receptor-like protein kinase, RLPK),后者經(jīng)歷選擇性剪接事件,且在免疫過程中發(fā)揮重要功能。研究者將RLPK基因序列與熒光素酶報(bào)告基因(luciferase, LUC)串聯(lián)后,使用35S啟動(dòng)子在本氏煙中表達(dá),在通常情況下,該重組序列產(chǎn)生RLPK-LUC全長轉(zhuǎn)錄本,然而一些效應(yīng)分子將會(huì)導(dǎo)致RLPK在剪接中發(fā)生內(nèi)含子保留,在新轉(zhuǎn)錄本中保留一個(gè)提前終止密碼子,無法正確表達(dá)LUC,經(jīng)熒光素底物處理后,表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度下降[61]。研究者利用該報(bào)告系統(tǒng)篩選了9個(gè)影響選擇性剪接的RxLR效應(yīng)分子,大大推動(dòng)了相關(guān)研究,這一思路值得我們學(xué)習(xí)與借鑒,可以根據(jù)可能的效應(yīng)分子功能,選取新的靶標(biāo)蛋白,設(shè)計(jì)其他報(bào)告系統(tǒng)用于篩選影響特定功能的效應(yīng)分子。2019年,Thilliez等將基因富集測序技術(shù)應(yīng)用于致病疫霉分泌蛋白分析,提出了病原富集測序(pathogen enrichment sequencing, PenSeq),證明該技術(shù)在分析效應(yīng)分子的多態(tài)性和變異情況、檢測特定基因的等位基因或同源基因、預(yù)測新的效應(yīng)分子等方面大有可為[128];2020年,Lin等利用cDNA病原富集測序,結(jié)合長讀長測序(long-read sequencing)技術(shù),分析不同致病疫霉菌株之間的效應(yīng)分子表達(dá)差異,并鑒定了被少花龍葵Solanumamericanum抗病基因Rpi-amr1識(shí)別的致病疫霉效應(yīng)分子Avramr1(Pi07569)[129]。可以預(yù)見,新技術(shù)和新分析方法的應(yīng)用將大大加速致病疫霉的研究,鑒定更多的關(guān)鍵位點(diǎn),加深我們對(duì)疫霉-植物互作機(jī)制的理解。

值得注意的是,許多效應(yīng)分子的毒性功能仍有待解析,這方面體現(xiàn)在信號(hào)通路的上下游仍不完全清楚,一方面則在于一些基于本氏煙的研究成果缺乏在野生寄主(馬鈴薯和番茄)上的驗(yàn)證。深入發(fā)掘更多效應(yīng)分子的毒力機(jī)制,還原田間侵染過程中的互作情況,將是后續(xù)研究的重要方向。

2.4 新型毒力因子的發(fā)掘工作

一些新興的病原物-植物互作機(jī)制引發(fā)了學(xué)界關(guān)注?？缃缧NA能通過靶向其他物種的特定mRNA,引起基因沉默,其在病原物-植物互作過程中也發(fā)揮了一定的作用。一個(gè)來自致病疫霉的小RNA——miR8788,已被證明誘導(dǎo)馬鈴薯水解酶基因StABH1沉默,該基因?qū)τ隈R鈴薯抗晚疫病有重要作用[130]。類似的機(jī)制在其他病原物中早已被發(fā)現(xiàn)[131-132]。相對(duì)應(yīng)的,植物也利用小RNA沉默病原菌中與毒力相關(guān)的基因,從而對(duì)抗病害[133]。Luo等從馬鈴薯全基因組范圍內(nèi)預(yù)測了53個(gè)可能靶向致病疫霉的miRNA,其預(yù)測靶標(biāo)包括轉(zhuǎn)錄因子、跨膜蛋白、激酶等,其中一部分,例如miR394的瞬時(shí)表達(dá)可以抑制致病疫霉的侵染,然而一部分預(yù)測的miRNA例如novel133、novel166和miR396過表達(dá)后對(duì)致病疫霉的侵染表現(xiàn)為促進(jìn)作用,它們在互作過程中所處的地位還有待更多研究[134]。有趣的是,一部分miRNA同時(shí)靶向馬鈴薯和致病疫霉的基因[134]。2022年,Chi 等開發(fā)了一套算法用于預(yù)測可能在植物和病原物互作過程中發(fā)揮了跨界調(diào)節(jié)作用的小RNA,目前尚未被應(yīng)用于致病疫霉相關(guān)研究[135],我們期待未來的進(jìn)一步研究。

磷脂也可能作為毒力因子參與疫霉的侵染過程。大豆疫霉的效應(yīng)分子Avh5 向寄主細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)依賴于其與磷脂酰肌醇3-磷酸的結(jié)合[136],而Lu等的研究表明,大豆疫霉在侵染過程中會(huì)分泌額外的磷脂酰肌醇3-磷酸,這些磷脂對(duì)于效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)運(yùn)和疫霉侵染有促進(jìn)作用;而植物的磷脂酰肌醇3-磷酸結(jié)合蛋白可以增強(qiáng)抗病性[137]。這一互作機(jī)制可以應(yīng)用于抗性育種,通過將磷脂酰肌醇3-磷酸結(jié)合蛋白與外源抗真菌蛋白融合,可以培育出具有持久廣譜抗病性的轉(zhuǎn)基因植物,具有廣闊的應(yīng)用前景[138]。

近年來,多組學(xué)分析大大推進(jìn)了毒力因子的發(fā)掘工作。2010年,Raffaele等根據(jù)基因的N端信號(hào)肽、跨膜序列等特征,預(yù)測致病疫霉全基因組范圍內(nèi)的分泌蛋白,形成預(yù)測的分泌蛋白質(zhì)組,并根據(jù)保守基序和基因本體(gene ontology, GO)分析的功能預(yù)測結(jié)果,對(duì)分泌組蛋白進(jìn)行了歸類和注釋;隨后,根據(jù)基因在致病疫霉基因組上的位置(位于基因密集區(qū)域或稀疏區(qū)域),結(jié)合不同侵染階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及不同疫霉的基因組比較結(jié)果,在致病疫霉全基因組范圍內(nèi)預(yù)測了一系列候選的毒力基因,包括編碼一系列外泌酶、富含半胱氨酸的小分子分泌蛋白、含重復(fù)序列的分泌蛋白等的基因[139]。Seidl等結(jié)合基因結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),對(duì)致病疫霉的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了系統(tǒng)分析,預(yù)測了4個(gè)在致病疫霉侵染過程中參與調(diào)控基因上調(diào)表達(dá)的特殊DNA基序[140],有助于后續(xù)毒力基因的預(yù)測和篩選。

Chen 等鑒定到大豆疫霉和致病疫霉中的一類重要的表觀修飾酶——6mA甲基轉(zhuǎn)移酶,隨后發(fā)現(xiàn)DNA的6mA甲基化修飾廣泛存在于這兩種疫霉的基因組中,致病疫霉和大豆疫霉分別有1 805和1 343個(gè)基因存在6mA標(biāo)記;6mA修飾與相應(yīng)基因的表達(dá)量表現(xiàn)為負(fù)相關(guān);敲除大豆疫霉中的6mA甲基轉(zhuǎn)移酶基因引起超過3 000個(gè)基因的表達(dá)量發(fā)生變化,涉及代謝和侵染過程中的重要基因,并且導(dǎo)致大豆疫霉的毒力下降,暗示疫霉毒力因子受到表觀遺傳調(diào)控[141]。隨后,研究者在疫霉中鑒定到更多的表觀修飾,并繪制了疫霉組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化(H3K27me3)和第36位賴氨酸三甲基化(H3K36me3)在基因組范圍內(nèi)的分布圖,發(fā)現(xiàn)表觀遺傳修飾對(duì)于調(diào)控基因組范圍內(nèi)的基因表達(dá),調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)座子活動(dòng)和維持基因組的穩(wěn)定性有重要意義[142-143]。Miao等發(fā)現(xiàn),6mA修飾對(duì)于灰霉病菌Botrytiscinerea的致病能力同樣具有重要意義[144],也印證了從表觀基因組學(xué)層面開展致病疫霉毒力機(jī)制研究的重要性。

2018年,Rodenburg等將致病疫霉全基因組內(nèi)的預(yù)測蛋白質(zhì)與已有數(shù)據(jù)庫比對(duì),并根據(jù)保守的催化結(jié)構(gòu)域等特征進(jìn)行功能預(yù)測和模型訓(xùn)練,預(yù)測可能發(fā)生的代謝反應(yīng)。共1 408個(gè)基因被預(yù)測參與1 569種不同的生化反應(yīng),其中涉及1 663種代謝物;隨后,通過計(jì)算每個(gè)生化反應(yīng)的通量,結(jié)合涉及的酶的亞細(xì)胞定位預(yù)測數(shù)據(jù),經(jīng)過糾錯(cuò)、整合得到了第一個(gè)致病疫霉全基因組水平的代謝模型(genome-scale metabolic models,GEM),這一模型包含2 394個(gè)生化反應(yīng),可以對(duì)致病疫霉不同階段的代謝情況進(jìn)行定性預(yù)測,為后續(xù)研究不同階段的代謝調(diào)控狀況提供了便利[145]。Botero等也建立了類似的代謝模型,并從侵染的角度進(jìn)行分析,根據(jù)不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),建立了寄主組(在培養(yǎng)基上不活躍,在接種早期活躍的代謝反應(yīng))、活體營養(yǎng)組(在侵染后2～3 d活躍、在4 d后下調(diào)的代謝反應(yīng))、死體營養(yǎng)組(在侵染后2～3 d不活躍、在4～5 d上調(diào)的代謝反應(yīng))以及過渡組(活體營養(yǎng)階段向死體營養(yǎng)階段過渡過程中發(fā)生顯著變化的代謝反應(yīng))4個(gè)特異性代謝組,并以此分析每個(gè)階段的代謝模式和特征反應(yīng),鑒定了一系列在侵染過程中受到關(guān)鍵調(diào)控的基因[146],進(jìn)一步的分子互作和機(jī)制研究有待進(jìn)一步展開。

新型的致病疫霉毒力因子大大豐富了我們的認(rèn)知,而在此過程中,多組學(xué)方法的廣泛應(yīng)用有助于發(fā)掘以前未知的作用機(jī)制。我們期待利用新的試驗(yàn)與分析手段,鑒定到更多新型致病因子,并對(duì)后續(xù)信號(hào)通路和分子機(jī)制進(jìn)行更深層次的研究,完善我們對(duì)互作體系的認(rèn)知,最終指導(dǎo)晚疫病防治。

3 寄主識(shí)別致病疫霉的機(jī)理研究

3.1 致病疫霉的PAMPs及寄主PTI反應(yīng)研究進(jìn)展

植物的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRRs)識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)后會(huì)引發(fā)一系列生理反應(yīng)。包括但不限于活性氧(reactive oxygen species,ROS)迸發(fā)[147],細(xì)胞膜電位變化[148],GPCR信號(hào)傳遞[149],以及后續(xù)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和免疫激活,這些反應(yīng)共同構(gòu)成了植物的病原相關(guān)分子模式觸發(fā)免疫(pathogen-associated molecular patterns-triggered immunity,PTI)。值得注意的是,前期在研究擬南芥ArabidopsisthalianaPTI反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn),一個(gè)類受體激酶SERK3/BAK1是擬南芥PTI反應(yīng)的中樞核心,本氏煙中的同源蛋白NbSerk3/Bak1對(duì)于本氏煙響應(yīng)一系列不同來源的PAMPs觸發(fā)的免疫反應(yīng)也是必需的[150]。

INF1是一個(gè)經(jīng)典的PAMP激發(fā)蛋白,在致病疫霉的菌絲階段表達(dá),但在侵染階段,尤其是侵染早期的活體營養(yǎng)階段下調(diào)[151]。早期研究證明,本氏煙通過識(shí)別INF1介導(dǎo)對(duì)致病疫霉的抗病性[152],且這種識(shí)別同樣依賴于NbSerk3/BAK1[153],與擬南芥中的PTI反應(yīng)類似。馬鈴薯的激發(fā)素類受體蛋白ELR也參與了對(duì)INF1的識(shí)別和對(duì)致病疫霉的免疫反應(yīng)。ELR屬于類受體蛋白(receptor-like protein,RLP),可以與SERK3/BAK1發(fā)生分子間互作,且這種互作會(huì)隨INF1處理而增強(qiáng)[154]。

另一個(gè)著名的疫霉PAMP分子是XEG1,該蛋白質(zhì)最早在大豆疫霉中被發(fā)現(xiàn)。XEG1屬于糖苷水解酶12(glycoside hydrolase family 12,GH12)家族,具有木葡聚糖酶和β-葡聚糖酶活性,且靶向質(zhì)外體,這提示它參與對(duì)寄主植物細(xì)胞壁的降解;沉默XEG1導(dǎo)致大豆疫霉的毒力下降,證明了XEG1對(duì)侵染的促進(jìn)作用,但與此同時(shí),過表達(dá)XEG1的大豆疫霉侵染能力也受到了損害,且植物組織中ROS迸發(fā)和胼胝質(zhì)積累遠(yuǎn)超對(duì)照菌株,說明這種侵染能力的下降可能源自植物免疫反應(yīng)的加強(qiáng)。XEG1觸發(fā)的PTI同樣依賴于SERK3/BAK1。此外,致病疫霉中預(yù)測到6個(gè)XEG1同源基因,但其中只有一個(gè)能在本氏煙上引起細(xì)胞死亡[155]。有趣的是,大豆分泌的抑制因子GmGIP1可以特異性結(jié)合大豆疫霉XEG1,從而抑制后者的糖苷酶活性;然而大豆疫霉基因組中存在一個(gè)截短的XEG1旁系同源蛋白XLP1,該蛋白不具有糖苷酶活性,但與GmGIP1結(jié)合能力遠(yuǎn)超XEG1,這使得XLP1可以通過消耗植物分泌的GmGIP1來保護(hù)XEG1不被抑制,從而維持大豆疫霉的毒力水平。在這個(gè)模型中,XLP1作為誘餌,捕獲植物分泌的抑制蛋白并將其中和[156]。在寄生疫霉中,研究者發(fā)現(xiàn)PsXEG1的同源蛋白PpXEG1,以及另一個(gè)全長GH-12家族糖苷水解酶PpXLP1,以相似的機(jī)制對(duì)抗本氏煙分泌的抑制因子NbGIP2,盡管NbGIP2與GmGIP1并非同源,這說明這種互作模式可能是廣泛存在的,并在不同物種中表現(xiàn)出趨同演化傾向[156]。

煙草中的一個(gè)富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)的類受體蛋白(leucine-rich repeat-receptor like protein, LRR-RLP)可以識(shí)別大豆疫霉的XEG1,并因而被命名為RXEG1。RXEG1介導(dǎo)的抗病性依賴于BAK1和SOBIR1兩個(gè)類受體激酶(receptor-like protein kinase, RLK)的參與,證明RLK在植物PTI反應(yīng)中占據(jù)特殊地位[157-158]。NbRXEG1甚至可以識(shí)別小麥上的禾谷鐮孢F.graminearum編碼的GH12糖苷水解酶,盡管本氏煙并非禾谷鐮孢的天然寄主,顯示這類PAMPs在遠(yuǎn)緣植物病原物中分布廣泛,且結(jié)構(gòu)和功能上具有一定的保守性[159]。

致病疫霉基因組編碼65個(gè)富含半胱氨酸的小蛋白(small cysteine-rich, SCR),其中一個(gè)SCR蛋白,PITG_14439(被命名為PC2),已被證明可以作為PAMP被植物識(shí)別,引發(fā)后續(xù)的ROS迸發(fā)和細(xì)胞死亡。植物對(duì)PC2的識(shí)別依賴于質(zhì)外體絲氨酸蛋白酶(例如番茄絲氨酸蛋白酶P69B)對(duì)其進(jìn)行切割,而一個(gè)致病疫霉分泌的蛋白酶抑制劑EPI1可以抑制這種切割,從而抑制相關(guān)免疫反應(yīng)的發(fā)生。這一研究提示,植物對(duì)PAMPs的識(shí)別存在復(fù)雜的機(jī)制,包括識(shí)別前對(duì)PAMPs的“預(yù)處理”步驟,而病原體可能針對(duì)這些步驟進(jìn)行干擾和阻礙[160]。

Pep-13是一個(gè)在卵菌中高度保守的基序,最早從大豆疫霉的一個(gè)具有谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminases, TGase)活性的糖蛋白GP42中被鑒定到,且可以作為PAMP被馬鈴薯識(shí)別,觸發(fā)PTI反應(yīng)[161]。Pep-13引發(fā)的PTI反應(yīng)不依賴SERK3/BAK1[162];參與識(shí)別Pep-13的PRR基因定位于馬鈴薯3號(hào)染色體頂端附近,該區(qū)域中曾被注釋到5個(gè)候選LRR-RLKs,然而進(jìn)一步的試驗(yàn)表明這5個(gè)RLKs都不能單獨(dú)介導(dǎo)針對(duì)Pep-13的PTI反應(yīng)[163],這可能是因?yàn)橄嚓P(guān)基因的開放讀碼框尚未被注釋到,也可能由于針對(duì)Pep-13的PTI反應(yīng)并非由單一RLK介導(dǎo)。

需要注意的是,以上幾種PAMPs均屬于蛋白質(zhì)或肽類,而病原菌的其他分子也可以作為PAMPs被植物識(shí)別。一些脂肪酸,例如來自致病疫霉的二十碳五烯酸和花生四烯酸可以激發(fā)馬鈴薯的免疫反應(yīng),引起倍半萜等次生代謝產(chǎn)物的積累[164],引發(fā)馬鈴薯對(duì)致病疫霉的抗性增強(qiáng)[165]。此外,真菌細(xì)胞壁中的多糖組分,例如幾丁質(zhì)(chitin),也可以作為PAMPs觸發(fā)植物的PTI反應(yīng)[166-167],但目前尚無證據(jù)證明卵菌細(xì)胞壁對(duì)植物PTI的激發(fā)作用。非蛋白質(zhì)類PAMPs分子在卵菌-植物互作過程中所處的地位,仍有待進(jìn)一步研究。

3.2 抗病基因介導(dǎo)的ETI

抗病基因(resistance gene,Rgene)表達(dá)后識(shí)別病原菌的效應(yīng)分子,引發(fā)后續(xù)包括過敏反應(yīng)(hypersensitive response,HR)在內(nèi)的一系列免疫應(yīng)答,稱為效應(yīng)分子觸發(fā)免疫(effector-triggered immunity,ETI);在此過程中,被識(shí)別的效應(yīng)分子也被稱為無毒基因(avirulence gene,Avr)。在早期的晚疫病抗病育種研究中,最初的抗病基因主要來自于墨西哥六倍體野生種馬鈴薯Solanumdemissum,其所含的11個(gè)(R1-R11)抗晚疫病基因,均為小種?；偷闹餍Э共』騕168-169]。但隨著致病疫霉各生理小種的不斷變異,早期的抗病基因已全部失去抗病功能[170]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)與高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展,利用抗病基因圖位克隆結(jié)合比較基因組學(xué),抗性基因富集測序(resistance gene enrichment sequencing, RenSeq)以及病原菌效應(yīng)子組學(xué)等方法,抗病育種學(xué)家不斷從各類野生馬鈴薯資源中克隆到全新的抗病基因,最著名的廣譜抗性基因包括Rpi-vnt1.1、Rpi-blb1、R8、Rpi-amr1等[171-174],但能夠克服這些抗病基因的致病疫霉生理小種也隨之涌現(xiàn)[175]。此前,Paluchowska等[176]已對(duì)茄屬Solanumspp.植物中的抗晚疫病基因進(jìn)行了系統(tǒng)的整理,我們不再重復(fù)羅列。在這里,我們把目光移向近年來新發(fā)現(xiàn)的抗病基因識(shí)別與作用機(jī)制,關(guān)注這一領(lǐng)域的理論進(jìn)展。

NLR(nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat-containing)是最重要的抗病基因家族,一般認(rèn)為其LRR結(jié)構(gòu)域是決定識(shí)別特異性的關(guān)鍵,例如茄屬植物中抗病基因Rpi-chc1的一系列等位基因在LRR結(jié)構(gòu)域上存在分化,而這種分化使得它們能夠識(shí)別致病疫霉PexRD12/31超家族中的一系列效應(yīng)分子[177];又如馬鈴薯的兩個(gè)抗病基因Gpa2和Rx1分別可以識(shí)別馬鈴薯白線蟲Globoderapallida和馬鈴薯X病毒(potato virus X),人為重組它們的LRR結(jié)構(gòu)域可以使它們的識(shí)別功能發(fā)生交換,而二者的其他結(jié)構(gòu)域和內(nèi)源啟動(dòng)子的交換均不會(huì)影響識(shí)別功能[178]。然而,NLR對(duì)效應(yīng)分子的識(shí)別功能并不一定依賴于LRR結(jié)構(gòu)域,一個(gè)極端的案例是擬南芥中的RBA1,該抗病基因缺失了常規(guī)NLR中保守的NBS和LRR結(jié)構(gòu)域,僅有一個(gè)Toll/白介素1樣受體(Toll/interleukin-1 receptor, TIR)結(jié)構(gòu)域,然而RBA1可以完成對(duì)丁香假單胞菌Pseudomonassyringae效應(yīng)分子HopBA1的識(shí)別[179]。

值得注意的是,以上識(shí)別方式依賴于抗病蛋白和效應(yīng)分子的直接結(jié)合,但近年的一些研究顯示,某些效應(yīng)分子觸發(fā)的ETI反應(yīng)涉及間接識(shí)別。研究者們提出了一系列模型用于解釋這些間接識(shí)別過程?！笆匦l(wèi)(Guard)模式”最早被用于描述番茄對(duì)丁香假單胞菌效應(yīng)分子AvrPto的識(shí)別,在這個(gè)模型中,AvrPto靶向番茄防衛(wèi)蛋白PTO,而PTO與番茄NLR蛋白PRF存在組成型的分子間互作,AvrPto對(duì)PTO的識(shí)別“驚擾了”PTO,導(dǎo)致PTO與PRF解離,激活下游的ETI信號(hào)通路[180-181]。在這個(gè)模型中,抗病蛋白并未直接識(shí)別效應(yīng)分子,而是“監(jiān)控”效應(yīng)分子靶向的關(guān)鍵靶標(biāo),通過這些靶標(biāo)的變化發(fā)現(xiàn)前來入侵的效應(yīng)分子。這一模型的基本邏輯是,抗病蛋白所監(jiān)控的靶標(biāo)位點(diǎn)在植物免疫反應(yīng)中是存在特定功能的,并因此才會(huì)成為病原菌效應(yīng)分子靶向的目標(biāo),然而這種功能上的兩面性將導(dǎo)致這類靶標(biāo)位點(diǎn)受到相反的選擇壓力,并很可能表現(xiàn)出分裂選擇的演化模式:要么避免被效應(yīng)分子靶向,逃避病原菌的攻擊;要么增強(qiáng)與效應(yīng)分子的結(jié)合能力,確保后續(xù)ETI反應(yīng)足夠敏感。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn),病原菌效應(yīng)分子可能攻擊不止一個(gè)靶標(biāo),而并非所有的靶標(biāo)都有助于增強(qiáng)毒力,例如擬南芥RIN4受到丁香假單胞菌效應(yīng)分子AvrRpt2的直接靶向,并且參與后續(xù)ETI反應(yīng),然而RIN4的T-DNA插入失活突變體上AvrRpt2的毒力功能非但沒有減弱,反而有所增強(qiáng),這與“守衛(wèi)模式”的基本邏輯相違背[182]?；谶@些推理和試驗(yàn)結(jié)論,研究者于2008年推演了“守衛(wèi)模式”向“誘餌(decoy)模式”的轉(zhuǎn)變,在誘餌模式中,病原物效應(yīng)分子的靶標(biāo)并非唯一的,而真正參與后續(xù)ETI反應(yīng)的靶標(biāo)作為誘餌存在,攻擊誘餌對(duì)植物免疫的損害有限或根本沒有損害,卻可以激活后續(xù)抗病基因的識(shí)別[183]。在此基礎(chǔ)之上,Cesari等于2014年提出了新的“整合誘餌(integrated decoy)假說”,他們注意到一些抗病蛋白攜帶有額外的、非保守的結(jié)構(gòu)域,且這些結(jié)構(gòu)域往往涉及和效應(yīng)分子的互作,例如抗病蛋白R(shí)RS1帶有WRKY結(jié)構(gòu)域,可以與效應(yīng)分子AvrRps4 結(jié)合;而另一個(gè)抗病蛋白Pi5-2在C末端具有效應(yīng)分子AvrRpt2的識(shí)別位點(diǎn),基于這些證據(jù),研究者推測,一些“誘餌模式”中的誘餌關(guān)鍵識(shí)別位點(diǎn)已被整合到抗病蛋白上,作為“整合誘餌”,從而允許抗病基因直接識(shí)別效應(yīng)分子[184-185]。這一猜測提示我們,可以將效應(yīng)分子的作用靶標(biāo)與已知的NLR蛋白整合,來人工“定制”抗病基因、識(shí)別其他效應(yīng)分子。例如用能夠識(shí)別熒光蛋白的單結(jié)構(gòu)域抗體片段(single-domain antibody fragment)替換Pik-1的整合結(jié)構(gòu)域,使得重組后的Pik可以識(shí)別熒光蛋白、引發(fā)壞死,這無疑為抗病資源的發(fā)掘應(yīng)用提供了全新的思路[186]。

一組被稱為NRC(NLR required for cell death)的NLR抗病基因早就引起了研究者的關(guān)注。NRC1最早于番茄對(duì)葉霉Fulviafulva的免疫反應(yīng)中被發(fā)現(xiàn),它參與了番茄抗病基因Cf-4對(duì)葉霉無毒基因Avr4的識(shí)別,并且參與到Avr9、AvrPto(來自丁香假單胞菌P.syringae)、tvEIx(來自綠色木霉Trichodermaviride)等一系列效應(yīng)分子引發(fā)的HR反應(yīng)過程中[187-188],這種“一對(duì)多”的功能特點(diǎn)不同于傳統(tǒng)的基因?qū)驅(qū)W說。更多的研究證明,許多(但不是全部)互作案例中存在另一個(gè)不參與識(shí)別,但對(duì)壞死功能至關(guān)重要的NLR蛋白存在;這種情況下,參與識(shí)別無毒蛋白的NLR被稱為“Sensor NLR”,而不參與識(shí)別、輔助信號(hào)傳導(dǎo)的NLR被稱為“Helper NLR”[188-189]。隨后,NRC2、NRC3和NRC4被鑒定到,且研究發(fā)現(xiàn)這些Helper NLR在信號(hào)傳遞中的功能有時(shí)是可以互相替代的,例如馬鈴薯抗病基因Rx介導(dǎo)對(duì)馬鈴薯X病毒(PVX)的效應(yīng)分子CP的抗性,而這種抗性可以依賴NRC2、NRC3或NRC4中的任意一者實(shí)現(xiàn),只有當(dāng)這3個(gè)Helper NLR全部被沉默后,才會(huì)表現(xiàn)出抗性受損。這種“冗余性”機(jī)制確保了植物ETI反應(yīng)不會(huì)因少數(shù)Helper NLR出現(xiàn)異常而遭受破壞,大大提高了植物免疫的穩(wěn)定性[190-191]。當(dāng)然,并不是所有NLR都需要成對(duì)發(fā)揮作用,一個(gè)有趣的NLR,擬南芥中的ZAR1揭示了全新的機(jī)制。ZAR1能夠識(shí)別來自多種病原物的不同效應(yīng)分子,其識(shí)別過程涉及一系列RLKs參與,例如在識(shí)別野油菜黃單胞桿菌Xanthomonascampestris效應(yīng)分子AvrAC的過程中,AvrAC通過尿苷化PTI過程中的一個(gè)RLK——BIK1發(fā)揮毒性功能,但在此過程中被并不參與PTI的誘餌PBL2捕獲;尿苷化的PBL2與ZAR1和另一個(gè)假激酶RKS1形成復(fù)合體,并經(jīng)寡聚化形成一個(gè)五聚體,被稱為抗病小體(resistosome)[192-193]。該抗病小體呈漏斗形,可以嵌入細(xì)胞膜,成為鈣離子通道,帶來快速的鈣離子內(nèi)流,并最終觸發(fā)免疫反應(yīng)和細(xì)胞壞死[194]。在這個(gè)實(shí)例中,ZAR1同時(shí)起到了識(shí)別和信號(hào)傳遞的功能,且通過寡聚化、形成離子通道快速啟動(dòng)細(xì)胞壞死。

NLR的寡聚化和抗病小體的形成已被發(fā)現(xiàn)在多個(gè)抗病過程中發(fā)揮重要作用,例如在少花龍葵抗病基因Rpi-amr3對(duì)致病疫霉效應(yīng)分子AVRamr3的識(shí)別過程中,Rpi-amr3誘導(dǎo)輔助NLR蛋白NRC2與NRC4寡聚化形成抗病小體,介導(dǎo)下游的免疫反應(yīng);而在另一個(gè)抗病基因Rpi-amr1對(duì)無毒基因AVRamr1的識(shí)別過程中,僅有NRC2被誘導(dǎo)形成抗病小體[195],這一研究證明抗病小體在晚疫病抗病過程中發(fā)揮重要而復(fù)雜的作用。

另一個(gè)值得注意的問題是,盡管傳統(tǒng)的zig-zag模型將PTI與ETI描述為涇渭分明的兩個(gè)階段,然而實(shí)際的植物抗病過程中,二者的關(guān)系是復(fù)雜的。辛秀芳研究員團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn),阻斷PTI會(huì)嚴(yán)重?fù)p害ETI的強(qiáng)度,因?yàn)镻RR相關(guān)的信號(hào)傳遞是ETI所必需的,且ETI過程中的ROS產(chǎn)生依賴于來自RLK的信號(hào),這證明PTI是ETI的基礎(chǔ)[196];而與此同時(shí),ETI與PTI會(huì)相互增強(qiáng),這涉及一系列關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)和積累[197],提示我們不能將兩種免疫過程簡單拆分討論,我們期待未來致病疫霉與馬鈴薯的互作研究將帶來更多基礎(chǔ)理論更新,進(jìn)一步豐富我們對(duì)植物病理學(xué)的了解。

隨著長讀長三代測序技術(shù)的不斷進(jìn)步與抗病基因高精度注釋工具的開發(fā)完成[198],未來的抗病基因挖掘必將立足于針對(duì)高抗性馬鈴薯品系基因組數(shù)據(jù)的完善分析與對(duì)抗病基因進(jìn)化歷程的深入理解。此外,我國并非馬鈴薯的起源地,晚疫病抗性資源相對(duì)匱乏,廣泛種植的馬鈴薯品種背景狹窄,抗病資源庫匱乏,即使有少數(shù)高抗晚疫病的資源,但對(duì)其抗病遺傳背景和基因組信息知之甚少,極大限制了對(duì)抗性資源的有效利用與開發(fā),所以,廣泛地搜集世界各地高抗晚疫病馬鈴薯品種,進(jìn)行大規(guī)模的高通量測序,深入開展抗病基因組學(xué)分析是解決這一問題的關(guān)鍵。全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association studies,GWAS)允許研究者在全基因組范圍內(nèi)篩選與特定表型相關(guān)的遺傳位點(diǎn),Juyo Rojas 等利用該技術(shù)篩選了16個(gè)馬鈴薯中與晚疫病抗性有關(guān)的位點(diǎn)[199];Jupe等利用富集測序技術(shù)系統(tǒng)性地尋找茄屬植物中的NB-LRR基因,在馬鈴薯和番茄中鑒定到了大量此前未被注釋的NLR基因[200-201]。新技術(shù)的應(yīng)用,大大降低了抗病基因的發(fā)掘與鑒定難度,極大地推動(dòng)了相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

4 致病疫霉對(duì)寄主ETI的應(yīng)對(duì)

病原菌面對(duì)ETI反應(yīng)并不會(huì)“束手就擒”,而是采取多種手段應(yīng)對(duì)。最直接的應(yīng)對(duì)方式是,無毒基因可能發(fā)生序列突變以逃避抗病基因的識(shí)別,例如致病疫霉效應(yīng)分子Avr1的一個(gè)同源基因A-L逃避了抗病基因R1的識(shí)別,不會(huì)引發(fā)HR[202]。事實(shí)上,Avr1具有豐富的多態(tài)性,例如Shen等從來自全國的111個(gè)致病疫霉菌株中鑒定到了49個(gè)氨基酸序列存在差異的Avr1同源蛋白,且存在一個(gè)高頻突變T512G,該突變導(dǎo)致Avr1序列提前終止,末端的38個(gè)氨基酸被截?cái)?這種被截?cái)嗟腁vr1蛋白并不會(huì)引發(fā)HR,從而逃避R1的識(shí)別。然而,這種應(yīng)對(duì)是有代價(jià)的,截?cái)郥區(qū)后的Avr1同時(shí)也將失去靶向Sec-5、阻斷PR-1分泌的毒性功能,盡管如此,對(duì)于病原菌而言,這種突變總體上是值得的[121,203]。一系列其他致病疫霉效應(yīng)分子也存在類似的策略,包括Avr2[204]、Avr3a[205]、Avr4[63]等,均存在多樣的同源基因。致病疫霉特殊的基因組結(jié)構(gòu),以及“雙速基因組”假說,有助于解釋這種廣泛的效應(yīng)分子多態(tài)性的來源[94]。

另一種常用的策略是調(diào)控效應(yīng)分子的表達(dá)。Pais等的研究證明致病疫霉不同菌株間存在很高的基因表達(dá)多態(tài)性,而部分菌株中,一個(gè)重要的無毒基因Avrvnt1(Pi16294)受到沉默,使得這些菌株在攜帶抗病基因Rpi-vnt1的馬鈴薯上恢復(fù)了毒力[206];在其他病原菌的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)病原菌通過小RNA沉默、表觀遺傳調(diào)控等方式抑制效應(yīng)分子表達(dá),從而逃避抗病基因的識(shí)別[207]。事實(shí)上,效應(yīng)分子的表達(dá)受到復(fù)雜的調(diào)控,Ochola等的研究證明,效應(yīng)分子的表達(dá)調(diào)控,尤其是其在侵染不同階段的差異表達(dá),對(duì)于植物抗病基因識(shí)別和免疫反應(yīng)具有極大的影響,可能是病原菌對(duì)抗植物ETI反應(yīng)的重要方式之一[208]。

通常認(rèn)為,效應(yīng)分子靶向植物的基礎(chǔ)免疫過程,然而在其他植物病原物上的研究證明,效應(yīng)分子同樣可以靶向ETI,揭示了植物-病原物之間“軍備競賽”的進(jìn)一步發(fā)展。Nakano等發(fā)現(xiàn)4個(gè)來自青枯病菌Ralstoniasolanacearum的效應(yīng)分子RipI,RipAC,RipAP和RipAU可以抑制另一個(gè)效應(yīng)分子RipAA在本氏煙上引發(fā)的HR反應(yīng)。隨后,他們重點(diǎn)關(guān)注RipAC,并證明RipAC通過靶向煙草NbSGT1,抑制了ETI信號(hào)通路,而后者正是RipAA引發(fā)壞死所必需的。最后,研究者證明了RipAC有助于青枯病菌在抗性本氏煙上生長[209]。在該研究中,效應(yīng)分子靶向植物ETI途徑而非通常的PTI,類似的機(jī)制目前尚未在致病疫霉與寄主的互作過程中被證實(shí),有待學(xué)界進(jìn)一步關(guān)注。植物與病原物的“軍備競賽”對(duì)抗病基因的推廣利用提出了更高要求,發(fā)掘具有持久抗病能力的抗病基因、監(jiān)測田間菌株的毒力變化,是植物病理學(xué)研究的長遠(yuǎn)目標(biāo)。

5 總結(jié)與展望

馬鈴薯晚疫病嚴(yán)重威脅馬鈴薯生產(chǎn),挑戰(zhàn)我國馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略和糧食安全。當(dāng)前階段,我國馬鈴薯發(fā)病面積大,危害嚴(yán)重,防控晚疫病的需求緊迫[13-14]?；瘜W(xué)防治仍然是我國晚疫病防治的重要手段,然而大量施用化學(xué)農(nóng)藥與我國農(nóng)藥減量化行動(dòng)方案相悖,且近年來,田間抗藥性菌株頻發(fā),極大地挑戰(zhàn)了化學(xué)防治的效果[210]。開發(fā)、推廣新的晚疫病防治手段,是我國糧食生產(chǎn)的重要需求。

近年來,植物病理學(xué)互作機(jī)制和基礎(chǔ)理論研究正在指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)。許多抗病基因已經(jīng)被應(yīng)用于馬鈴薯抗晚疫病育種[176],且從非寄主中可能篩選到難以被克服的高效抗晚疫病基因[211]。作物抗病性往往以犧牲產(chǎn)量為代價(jià),而在水稻中的轉(zhuǎn)錄因子IPA1有助于植物平衡產(chǎn)量和抗性水平,在正常狀態(tài)下調(diào)控穗發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)、增加產(chǎn)量,而面臨稻瘟病侵染時(shí)發(fā)生磷酸化,激活抗病相關(guān)基因的表達(dá),及時(shí)提高抗病性[212],這一機(jī)制對(duì)于抗病品種的產(chǎn)量保障有重要意義,亟須在抗晚疫病育種中發(fā)掘類似的資源。此外,理論研究揭示了新的抗病思路,例如施用殼聚糖可以激發(fā)馬鈴薯的免疫反應(yīng),并提高其對(duì)致病疫霉的抗病性[213];噴灑以黏土作為載體,以致病疫霉各生理階段的重要基因?yàn)榘袠?biāo)的RNA,能極大地抑制晚疫病發(fā)生[214]。一些生防菌對(duì)于晚疫病防治具有一定效果[215-216],值得進(jìn)一步開發(fā)與推廣。

晚疫病防治方法的突破,很大程度上依賴于植物病理學(xué)理論革新,病原物與寄主植物的互作機(jī)制一直是植物病理學(xué)研究的重點(diǎn)。近年來,對(duì)于致病疫霉的相關(guān)研究取得了不菲的成果,從穿透、定殖,到病原菌與植物間的軍備競賽,均有一系列新機(jī)制被發(fā)現(xiàn),PTI與ETI的相互聯(lián)系、效應(yīng)分子對(duì)ETI的抑制作用、miRNA跨界調(diào)控等一系列發(fā)現(xiàn)大大豐富了植物病理學(xué)基礎(chǔ)理論,在傳統(tǒng)zig-zag模型的基礎(chǔ)上增添了新的內(nèi)容,這些新理論也為未來致病疫霉-馬鈴薯互作機(jī)制的進(jìn)一步研究提供了全新的思路。同時(shí),新的互作理論提醒我們,致病疫霉與植物的互作機(jī)制復(fù)雜程度遠(yuǎn)超我們的想象,新抗性資源的發(fā)掘、高效抗病基因的篩選、病原菌克服抗性情況監(jiān)測是長期的需求,這對(duì)晚疫病快速檢測、基因分型和分子標(biāo)記等方面的研究提出了更高要求。

高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和優(yōu)化對(duì)于后續(xù)研究有重要意義。在模式植物擬南芥的研究中,覆蓋全基因組的T-DNA插入突變體庫被廣泛應(yīng)用于基因功能研究,大大推動(dòng)了基礎(chǔ)理論的發(fā)展[217-218]。1991年,Judelson等首次開發(fā)了致病疫霉遺傳轉(zhuǎn)化體系,該體系利用聚乙二醇和氯化鈣處理致病疫霉原生質(zhì)體,獲得了轉(zhuǎn)化子[219]。2003年,基因槍法被應(yīng)用于致病疫霉轉(zhuǎn)化,該方法利用攜帶目的基因的金微粒轟擊目標(biāo)組織,從而獲得轉(zhuǎn)化子,不再需要制備原生質(zhì)體;選用該方法時(shí),最好的組織材料為孢子囊[220]。同時(shí),Vijn等開發(fā)了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的致病疫霉轉(zhuǎn)化體系,在乙酰丁香酮(acetosyringone)處理下,攜帶目的基因的農(nóng)桿菌與致病疫霉的游動(dòng)孢子共培養(yǎng),可以得到致病疫霉轉(zhuǎn)化子[221]。最近,Wang 等改良了這一流程,通過在農(nóng)桿菌中引入來自擬南芥的AtVIP1基因,大幅度增加了轉(zhuǎn)化效率[83]。高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立,為基因編輯株系的培育和基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。目前,致病疫霉遺傳轉(zhuǎn)化體系已日趨成熟,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)具有操作便利、轉(zhuǎn)化率高等特點(diǎn),基于該轉(zhuǎn)化技術(shù)編輯特定位點(diǎn)或構(gòu)建突變體庫無疑將大大方便后續(xù)研究,我們期待相關(guān)技術(shù)的進(jìn)一步推廣,推進(jìn)后續(xù)的晚疫病研究。

基于測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法展開的多組學(xué)研究,極大地推動(dòng)了植物病理學(xué)發(fā)展。以高質(zhì)量基因組為基礎(chǔ),利用多種測序和生物信息學(xué)分析方法,進(jìn)行多組學(xué)聯(lián)合分析,有助于發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵位點(diǎn)或解析隱藏作用機(jī)制,為致病疫霉研究提供了巨大的助力。近年來,更多高質(zhì)量基因組組裝及注釋結(jié)果被陸續(xù)發(fā)布,2022公布了第一個(gè)染色體級(jí)別的致病疫霉基因組全長為246.5 Mb,其中219 Mb的區(qū)域被映射到15條染色體上;研究者在全基因組范圍內(nèi)預(yù)測到19 981 個(gè)蛋白質(zhì),超過之前的預(yù)測結(jié)果;另外,該基因組中約72%的區(qū)域被注釋為重復(fù)序列。通過與染色體級(jí)別高質(zhì)量基因組對(duì)比,研究者發(fā)現(xiàn)致病疫霉有性生殖后代頻繁出現(xiàn)染色體多倍體化或非整倍化現(xiàn)象,且不同染色體的發(fā)生頻率存在差異,這一現(xiàn)象影響了基因表達(dá),導(dǎo)致后代的生活力和致病能力發(fā)生多樣的變化。此外,作者對(duì)介導(dǎo)甲霜靈抗性的致病疫霉基因進(jìn)行了定位,確認(rèn)決定抗藥性的主要位點(diǎn)位于3號(hào)染色體上;這一區(qū)域頻繁發(fā)生基因重組與染色體變異,產(chǎn)生了生長速度和抗藥性水平多樣的后代[222],可見高質(zhì)量基因組對(duì)后續(xù)研究意義重大。Knaus 等發(fā)現(xiàn)致病疫霉基因組普遍存在拷貝數(shù)變異,大量菌株在特定位點(diǎn)上表現(xiàn)為三倍體甚至四倍體,且這種變異可以發(fā)生在保守的核心直系同源基因中,并不遵循雙速基因組模型[223],這一現(xiàn)象的成因及后果還有待更多研究揭示。另外,細(xì)胞質(zhì)基因組學(xué)研究也引起了研究者的關(guān)注,例如Shen 等對(duì)致病疫霉線粒體基因組的分析表明,不同地區(qū)的菌株間線粒體基因組存在極大的遺傳分化,并可能為致病疫霉適應(yīng)不同溫度環(huán)境做出貢獻(xiàn)[224]。多組學(xué)研究在植物病理學(xué)工作中的地位,如今已不容忽視。目前,大量田間致病疫霉菌株的收集積累、致病疫霉完整高質(zhì)量基因組的公布以及生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展,為全面開展正向遺傳學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。整合、匯總不同田間菌株和誘變菌株的基因組信息,構(gòu)建致病疫霉泛基因組,從中鑒定決定致病力的關(guān)鍵基因,建立泛功能基因組學(xué)、泛效應(yīng)分子組學(xué)數(shù)據(jù)庫,對(duì)于深入的毒力機(jī)制研究、進(jìn)一步發(fā)掘新抗病資源、合理規(guī)劃防治方案具有重要意義。

值得期待的是,多組學(xué)的發(fā)展可與人工智能領(lǐng)域的進(jìn)展接軌?；谌斯ぶ悄芎蜋C(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù),對(duì)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)、互作關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測,甚至根據(jù)靶標(biāo)從頭設(shè)計(jì)藥物已成為現(xiàn)實(shí)[225],而相關(guān)技術(shù)需要大量組學(xué)數(shù)據(jù)作為基礎(chǔ)。基于多組學(xué)研究,利用人工智能和機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù),根據(jù)致病疫霉代謝和侵染過程中的關(guān)鍵靶標(biāo)設(shè)計(jì)殺菌劑,從理論上已具有實(shí)現(xiàn)的可能。我們期待多組學(xué)研究思路將在未來的晚疫病研究中扮演更重要的角色。

在基礎(chǔ)理論研究的基礎(chǔ)上,田間預(yù)測預(yù)報(bào)手段的更新對(duì)于晚疫病防治也有積極意義。以高光譜成像技術(shù)、機(jī)器視覺技術(shù)為基礎(chǔ)實(shí)現(xiàn)的馬鈴薯晚疫病快速檢測已進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用環(huán)節(jié),以便攜式檢測儀實(shí)現(xiàn)晚疫病快速識(shí)別、分級(jí)和統(tǒng)計(jì)處理,大大方便了田間檢測[226-229]。高光譜成像技術(shù)(hyperspectral imaging technology)和機(jī)器學(xué)習(xí)(machine learning)結(jié)合,可以實(shí)現(xiàn)田間復(fù)雜環(huán)境、多病害環(huán)境下的快速識(shí)別和監(jiān)測[230]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)可以應(yīng)用于晚疫病的早期檢測,且具有高靈敏性,有助于解決晚疫病發(fā)病初期癥狀不明顯這一問題[231-232];侯冰茹等利用光譜技術(shù)檢測馬鈴薯發(fā)病葉片的過氧化物酶(peroxidase)活性,經(jīng)過數(shù)據(jù)擬合建立了基于過氧化物酶活性的馬鈴薯晚疫病患病成都預(yù)測模型,能有效評(píng)估田間晚疫病發(fā)病情況,進(jìn)行病害分級(jí)[233]。從比利時(shí)引進(jìn)的CARAH晚疫病預(yù)測模型,以及一系列我國自主研發(fā)的新預(yù)測模型已進(jìn)入推廣應(yīng)用階段,這些模型基于氣象數(shù)據(jù)進(jìn)行發(fā)病情況預(yù)測,在許多地區(qū)表現(xiàn)良好,田間自動(dòng)監(jiān)測儀收集的溫度、濕度、降水量等數(shù)據(jù)為監(jiān)測模型提供了足夠精密的輸入數(shù)據(jù)[234-237],在此基礎(chǔ)上,基于物聯(lián)網(wǎng)技術(shù)的晚疫病實(shí)時(shí)監(jiān)測預(yù)警系統(tǒng)已經(jīng)成為可能[238],有望實(shí)現(xiàn)預(yù)測預(yù)報(bào)和自動(dòng)化防治手段的有機(jī)結(jié)合,實(shí)現(xiàn)自動(dòng)、智能、低成本的晚疫病防治。