回陽(yáng)固本湯促進(jìn)異基因造血干細(xì)胞移植后自然殺傷細(xì)胞重建的機(jī)制研究Δ

高小麗,何海濤,王 啟,姚翔媚,秦 濤,張海溪,趙 婕,馮 帥,胡 芃,楊同華(云南省第一人民醫(yī)院血液科,云南省血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,昆明 650032)

異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)是目前血液系統(tǒng)惡性疾病治療的重要方法[1]。allo-HSCT的成功常受到急性移植物抗宿主病(aGVHD)的限制,由于缺乏有效的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)和治療措施,降低移植物抗宿主病的發(fā)病率和嚴(yán)重程度仍是目前allo-HSCT治療的主要挑戰(zhàn)[2-3]。多項(xiàng)證據(jù)表明,allo-HSCT后自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)的早期重建與aGVHD的發(fā)病有著緊密聯(lián)系,其活性的恢復(fù)對(duì)于allo-HSCT的成功至關(guān)重要[4-7]。因此,NK細(xì)胞的重建成為近年來(lái)allo-HSCT研究的熱門(mén)話(huà)題。中醫(yī)認(rèn)為急性髓系白血病、骨髓增生異常綜合征或淋巴瘤等血液疾病大都具有共同的病機(jī)——脾腎陽(yáng)虛,而脾腎兩虛可造成陽(yáng)氣耗損、氣血虧虛,治療應(yīng)以扶正固本為原則[8-10]?；仃?yáng)固本湯具有補(bǔ)腎溫陽(yáng)、健脾固本的功效,是我院臨床上脾腎陽(yáng)虛型患者的常用藥。本研究前期發(fā)現(xiàn)allo-HSCT患者在移植前服用回陽(yáng)固本湯可以顯著提高外周血NK細(xì)胞數(shù)量與活性,表明回陽(yáng)固本湯可能作為allo-HSCT的輔助治療藥物。于是,本研究開(kāi)展了相應(yīng)的臨床與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)以明確其具體功效和分子調(diào)節(jié)機(jī)制,為回陽(yáng)固本湯在allo-HSCT治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床研究

1.1.1 資料來(lái)源:選取2021年7月至2022年9月于我院血液科行allo-HSCT的患者40例。納入標(biāo)準(zhǔn):年齡14～55歲,原發(fā)疾病為血液系統(tǒng)惡性疾病,均為首次接受allo-HSCT;中醫(yī)辨證為脾腎陽(yáng)虛型,即四肢怕冷、納差、便溏、乏力、腰膝酸軟,脈沉或細(xì),舌淡或胖大、苔白或白膩。排除標(biāo)準(zhǔn):合并嚴(yán)重的心、肝、腎等臟器衰竭者;不能配合治療與服藥者;臨床資料不全者。本研究為開(kāi)放研究,根據(jù)患者選擇的治療方式分組,將20例allo-HSCT聯(lián)合回陽(yáng)固本湯的患者納入HYGB組,將另外20例選擇allo-HSCT單獨(dú)治療的患者作為對(duì)照組。兩組患者的年齡、性別、原發(fā)疾病、供者類(lèi)型、CD34+細(xì)胞輸注量及移植后住院時(shí)間等一般資料具有可比性,見(jiàn)表1。本研究已通過(guò)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批(倫理審批號(hào):KHLL2022-KY125),患者及其家屬對(duì)本研究?jī)?nèi)容均已知情,并簽署知情同意書(shū)。

表1 兩組患者一般資料比較Tab 1 Comparison of general information between two groups

1.1.2 方法:所有患者均接受髓性預(yù)處理,親緣全相合供者allo-HSCT的aGVHD預(yù)防采用環(huán)孢素A+甲氨蝶呤方案;親緣單倍體供者采用環(huán)孢素A+甲氨蝶呤+嗎替麥考酚酯方案預(yù)防aGVHD。HYGB組患者在最后1次化療結(jié)束至移植預(yù)處理前服用回陽(yáng)固本湯,連續(xù)干預(yù)4周。回陽(yáng)固本湯配方:附子顆粒9 g,生姜30 g,炙甘草9 g,肉桂9 g,生曬參9 g,砂仁5 g,鹽小茴香5 g,五味子5 g,當(dāng)歸9 g,黃連5 g,醋烏梅5 g,花椒5 g,雞內(nèi)金9 g,焦麥芽9 g;1日1劑,水煎服,分早晚2次溫服。

1.1.3 療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn):造血重建標(biāo)準(zhǔn):allo-HSCT結(jié)束后,在未使用粒細(xì)胞集落刺激因子的情況下,當(dāng)中性粒細(xì)胞絕對(duì)值>0.5×109/L持續(xù)3 d,以第1日作為中性粒細(xì)胞植入日期;同時(shí),在脫離血小板輸注情況下,當(dāng)血小板計(jì)數(shù)>20×109/L持續(xù)7 d,以第1日作為血小板植入日期[11]。中性粒細(xì)胞與血小板植入時(shí)間未超過(guò)28 d視作造血重建良好,否則視為造血重建不良。同時(shí),統(tǒng)計(jì)90 d內(nèi)復(fù)發(fā)及死亡例數(shù)。

1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.1 材料:(1)儀器。CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司);流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司);聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(美國(guó)ABI公司);電泳儀(北京六一生物科技有限公司);酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司);離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司);凝膠成像分析儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

(2)試劑。人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)分離試劑盒與人NK細(xì)胞分離試劑盒均購(gòu)自天津科維諾生物科技有限公司;IMDM培養(yǎng)基、Hanks溶液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;RNeasy提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與SYBR Green試劑均購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司;CCK-8溶液、磷酸鹽緩沖液、重組白細(xì)胞介素(IL)15、胰蛋白酶與RIPA裂解緩沖液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;所有抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;10%人血清購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司;Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2.2 方法:(1)NK細(xì)胞計(jì)數(shù)。分別于allo-HSCT前、allo-HSCT后第30、60和90日采集兩組患者外周血4～5 mL,采用Hanks溶液等體積稀釋后,使用人PBMC分離試劑盒、根據(jù)密度梯度離心法于1 500 r/min離心15 min(離心半徑10 cm),獲取PBMC,以磷酸鹽緩沖液重新懸浮細(xì)胞,避光條件下采用PerCP-Cy5.5-抗CD3抗體、PE-抗CD56抗體、FITC-抗CD16抗體標(biāo)記20 min,采用流式細(xì)胞儀分析CD3-CD56+CD16+NK細(xì)胞比例,以對(duì)照組作為基準(zhǔn),計(jì)算相對(duì)比例。

(2)NK細(xì)胞分離培養(yǎng)。隨機(jī)選取對(duì)照組與HYGB組患者外周血各3份來(lái)提取NK細(xì)胞,分離PBMC,使用人NK細(xì)胞分離試劑盒分離NK細(xì)胞,分離后采用流式細(xì)胞儀鑒定CD3-CD56+CD16+,純度為94.1%～96.8%。隨后重懸1×106個(gè)細(xì)胞于IMDM培養(yǎng)基(含有10%人血清、0.5 g/mL IL-15),將培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。每實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR。采用PCR檢測(cè)外周血中CD15與CD56的表達(dá)量,首先使用RNeasy提取試劑盒提取PBMC中的總RNA,然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,最后使用SYBR Green試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,于PCR儀上分析并計(jì)算相對(duì)甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的表達(dá)量(2-ΔΔCt法)。

(4)細(xì)胞活性檢測(cè)。采用CCK-8法評(píng)價(jià)細(xì)胞活性,將分離培養(yǎng)的NK細(xì)胞以2×103細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中,分別培養(yǎng)0、24、48和96 h,向每個(gè)孔中加入CCK-8溶液(10 μmol/L)于37 ℃孵育2 h后,用酶標(biāo)儀測(cè)量細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)下的吸光度(OD值)。

(5)細(xì)胞凋亡分析。收集細(xì)胞并將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/mL,使用胰蛋白酶消化后,分別與Annexin V-FITC、PI結(jié)合緩沖液混合,孵育30 min,采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

(6)蛋白質(zhì)印跡法。以RIPA裂解緩沖液提取NK細(xì)胞總蛋白,凝膠電泳分離蛋白條帶并轉(zhuǎn)膜,使用1∶1 000稀釋的一級(jí)抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析,隨后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育,使用凝膠成像分析儀進(jìn)行拍照,并使用Image J軟件量化條帶強(qiáng)度,以GAPDH作為內(nèi)參,計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。每樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù),計(jì)算平均值。

(7)細(xì)胞分組干預(yù)。從患者外周血中分離培養(yǎng)NK細(xì)胞,分為對(duì)照組、HYGB組和LY294002組,HYGB組細(xì)胞采用回陽(yáng)固本湯干預(yù),LY294002組細(xì)胞在回陽(yáng)固本湯干預(yù)的同時(shí)加入LY294002 50 μmol/L干預(yù)24 h,隨后分別檢測(cè)各組細(xì)胞活性與凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 allo-HSCT患者近期臨床效果評(píng)價(jià)及不良反應(yīng)發(fā)生情況分析

兩組患者在移植后90 d內(nèi)均未發(fā)生移植相關(guān)死亡,對(duì)照組90%(18/20)的患者造血重建良好,HYGB組100%(20/20)的患者造血重建良好。在移植后3個(gè)月內(nèi),對(duì)照組患者復(fù)發(fā)2例,非移植相關(guān)死亡1例;HYGB組患者復(fù)發(fā)1例,未出現(xiàn)死亡。兩組患者近期療效比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表2。同時(shí)統(tǒng)計(jì)患者不良反應(yīng)發(fā)生率,結(jié)果顯示,兩組患者消化道癥狀(惡心、嘔吐和腹瀉)、感染和肝功能損害的發(fā)生率比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);HYGB組患者aGVHD發(fā)生率顯著低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表3。

表2 兩組患者allo-HSCT后臨床效果比較[例(%)]Tab 2 Comparison of clinical effects between two groups after allo-HSCT [cases (%)]

表3 兩組患者allo-HSCT后90 d內(nèi)不良反應(yīng)比較[例(%)]Tab 3 Comparison of adverse drug reactions within 90 d after allo-HSCT between two groups [cases (%)]

2.2 回陽(yáng)固本湯對(duì)allo-HSCT后患者體內(nèi)CD3-CD56+CD16+ NK細(xì)胞比例的影響

allo-HSCT進(jìn)行0 d時(shí),兩組患者CD3-CD56+CD16+NK細(xì)胞比例,CD56、CD16表達(dá)量的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);但allo-HSCT后30、60和90 d時(shí),HYGB組患者CD3-CD56+CD16+NK細(xì)胞比例,CD56、CD16表達(dá)量顯著高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1。

2.3 回陽(yáng)固本湯對(duì)allo-HSCT患者來(lái)源NK細(xì)胞體外活性的影響

與對(duì)照組相比,HYGB組患者NK細(xì)胞活性顯著升高,細(xì)胞凋亡率顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖2。

A.CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NK細(xì)胞在450 nm處的吸光值;B—C.流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定兩組NK細(xì)胞Annexin V-FITC/PI雙染情況與細(xì)胞凋亡率;n=3,*P<0.05。A. absorbance of NK cells at 450 nm detected by CCK8 assay; B-C. Annexin V-FITC/PI double staining and apoptosis rate of NK cells in both groups detected by flow cytometry; n=3, *P<0.05.圖2 回陽(yáng)固本湯對(duì)allo-HSCT患者來(lái)源NK細(xì)胞體外活性影響Fig 2 Effects of Huiyang Guben decoction on in vitro activity of NK cells derived from allo-HSCT patients

2.4 回陽(yáng)固本湯對(duì)患者來(lái)源NK細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響

與對(duì)照組相比,HYGB組患者NK細(xì)胞內(nèi)磷酸化的PI3K(p-PI3K)和磷酸化的Akt(p-Akt)的表達(dá)水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而HYGB組與對(duì)照組總的Akt和PI3K表達(dá)水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖3。

2.5 PI3K抑制劑對(duì)回陽(yáng)固本湯提高NK細(xì)胞體外活性的影響

與HYGB組比較,HYGB+LY294002組NK細(xì)胞活性顯著降低,而細(xì)胞凋亡比例顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),該結(jié)果逆轉(zhuǎn)了HYGB提高NK細(xì)胞活性的效果,見(jiàn)圖4。

A.CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組NK細(xì)胞在450 nm處的吸光值;B—C.流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定三組NK細(xì)胞Annexin V-FITC/PI雙染情況與細(xì)胞凋亡率;n=3,*P<0.05。A. absorbance of three groups of NK cells at 450 nm detected by CCK8 assay; B-C: Annexin V-FITC/PI double staining and apoptosis rate of NK cells in three groups detected by Flow cytometry; n=3, *P<0.05.圖4 PI3K抑制劑對(duì)回陽(yáng)固本湯提高NK細(xì)胞體外活性的影響Fig 4 Effects of PI3K inhibitor on enhancement of NK cell activity in vitro by Huiyang Guben decoction

3 討論

NK細(xì)胞是機(jī)體免疫防御的前線(xiàn)細(xì)胞,能夠識(shí)別并殺死惡性腫瘤細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞[12-13]。目前,人們對(duì)NK細(xì)胞相關(guān)分子調(diào)節(jié)通路的理解仍顯不足,NK細(xì)胞在防止allo-HSCT后aGVHD的潛力,值得更進(jìn)一步研究探索。

目前,中藥湯劑已被廣泛用于多種疾病的臨床治療,包括各類(lèi)血液系統(tǒng)疾病。張國(guó)梁等[14]指出,采用髓白1號(hào)方聯(lián)合化療治療急性髓細(xì)胞白血病,顯著提高了患者的緩解率,降低了復(fù)發(fā)率;王永敏等[15]發(fā)現(xiàn),益髓補(bǔ)腎方可以顯著增強(qiáng)患者的免疫功能,改善惡性淋巴瘤化療患者相關(guān)性貧血。本研究首先采用回陽(yáng)固本湯輔助allo-HSCT治療血液系統(tǒng)惡性疾病患者,結(jié)果發(fā)現(xiàn),回陽(yáng)固本湯雖然在療效改善方面與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),可能是由于樣本數(shù)量偏小導(dǎo)致的差異不顯著;但數(shù)據(jù)顯示,回陽(yáng)固本湯可顯著降低患者移植后9個(gè)月內(nèi)aGVHD的發(fā)生率。中醫(yī)認(rèn)為,各類(lèi)血液系統(tǒng)惡性疾病,無(wú)論是急性髓細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、骨髓增生異常綜合征或高侵襲性淋巴瘤等,都源于氣血不足,毒邪侵體,與西醫(yī)的自身免疫功能低下的病因相通[16-18]。因此,其治療應(yīng)以扶正為主,鼓舞正氣,解毒為輔,抵御毒邪,增強(qiáng)機(jī)體免疫功能,恢復(fù)各臟器功能,為移植后造血干細(xì)胞的存活、分化創(chuàng)造條件。回陽(yáng)固本方中,制附片回陽(yáng)救逆、補(bǔ)火助陽(yáng);生姜與黃連解毒;炙甘草作為補(bǔ)益劑,具有益氣滋陰、通陽(yáng)復(fù)脈的功效;姜半夏消痞散結(jié);生曬參具有補(bǔ)元養(yǎng)血、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)及免疫功能的作用;當(dāng)歸補(bǔ)血活血;各藥合用,共奏回陽(yáng)固本之效。

在分子機(jī)制上,本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),接受回陽(yáng)固本湯干預(yù)的患者,其外周血NK細(xì)胞比例顯著升高,且NK細(xì)胞體外增殖活性增強(qiáng),凋亡率降低。該結(jié)果說(shuō)明,回陽(yáng)固本湯可以促進(jìn)NK細(xì)胞的早期重建,提高NK細(xì)胞活性。此外,本研究結(jié)果顯示,回陽(yáng)固本湯顯著激活了NK細(xì)胞中的PI3K/Akt通路。PI3K/Akt信號(hào)與細(xì)胞增殖、凋亡等細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程密切相關(guān),并且多項(xiàng)研究結(jié)果證實(shí)該信號(hào)參與了NK細(xì)胞活性的調(diào)控[19-20]。本研究通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)繼續(xù)探究PI3K/Akt是否參與了回陽(yáng)固本湯對(duì)NK細(xì)胞活性的調(diào)控,采用PI3K抑制劑LY294002協(xié)同回陽(yáng)固本湯一起干預(yù)NK細(xì)胞,結(jié)果顯示,LY294002導(dǎo)致NK細(xì)胞增殖活性降低、凋亡率升高,逆轉(zhuǎn)了回陽(yáng)固本湯在體外促進(jìn)NK細(xì)胞活性的效果。

本研究報(bào)道了回陽(yáng)固本湯用于輔助allo-HSCT治療的增益作用,并揭示了詳細(xì)的分子調(diào)控機(jī)制。但是本研究也存在一定的局限性:(1)由于實(shí)驗(yàn)條件的限制,本研究中未能探究回陽(yáng)固本湯對(duì)于NK細(xì)胞分型及殺傷活性的影響機(jī)制;(2)本研究中的臨床研究?jī)H為單中心、小樣本研究,可能導(dǎo)致結(jié)果呈現(xiàn)一定程度的偏倚,未來(lái)或可聯(lián)合多中心進(jìn)行更大樣本的臨床研究,以驗(yàn)證本研究結(jié)論。

綜上所述,回陽(yáng)固本湯通過(guò)激活PI3K/Akt通路促進(jìn)了allo-HSCT后NK細(xì)胞的重建與活性維持,將有助于預(yù)防治療過(guò)程中aGVHD的發(fā)生,并可能進(jìn)一步提升allo-HSCT成功率。本研究結(jié)果可能為回陽(yáng)固本湯在allo-HSCT治療中的應(yīng)用提供科學(xué)的理論依據(jù)。