以外泌體為藥物遞送載體的研究進(jìn)展

楊艷萍,陳加偉,林聯(lián)君,張姍姍

(陜西服裝工程學(xué)院 健康學(xué)院,西安 712046)

外泌體是內(nèi)涵體來(lái)源,經(jīng)由多泡體(MVBs)與質(zhì)膜融合以后釋放到細(xì)胞外的膜性囊泡狀小體,內(nèi)部分布著多種生物學(xué)大分子,有蛋白質(zhì)、核酸和磷脂等,具有豐富的生物學(xué)功能,可作為細(xì)胞間物質(zhì)和信號(hào)通信的重要途徑。目前已知的多種疾病發(fā)展過(guò)程中,外泌體在參與機(jī)體的多種生理和病理發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著相應(yīng)的作用,均可見其蹤影[1]。外泌體載體綜合了細(xì)胞藥物遞送與納米技術(shù)的優(yōu)勢(shì),作為一種具有天然特性的新型藥物遞送載體,擁有可以穿過(guò)機(jī)體生物屏障的特性,因此利用外泌體作為載體能將藥物有效且安全地遞送至人體機(jī)體各大系統(tǒng),從而成為疾病治療中一種可行的有效途徑且前景極佳。

1 外泌體的結(jié)構(gòu)組成及其功能特征

外泌體是由機(jī)體細(xì)胞分泌的一種具有生物膜特性的細(xì)胞外囊泡結(jié)構(gòu),粒徑30～150 nm,機(jī)體相關(guān)的細(xì)胞均可以分泌對(duì)應(yīng)的細(xì)胞類型外泌體,直徑在30～150 nm的細(xì)胞外囊泡具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu),能攜帶蛋白質(zhì)、核酸(例如miRNA、lncRNA等)、脂質(zhì)等多種重要的生物信息。由細(xì)胞膜組成的胞外小泡(如外泌體)可通過(guò)一系列表面黏附蛋白和載體配體(四肽、整合素、CD11b和CD18受體)附著到靶細(xì)胞上,并將其有效載荷傳遞給靶細(xì)胞。一些研究表明[2],胞外小泡,如外泌體,根據(jù)其特性和來(lái)源具有特定的細(xì)胞向性,可用于靶向疾病組織或器官。外泌體的形成過(guò)程包括細(xì)胞膜內(nèi)陷,形成內(nèi)吞小體,多個(gè)內(nèi)吞小體融合為早期核內(nèi)體,而早期核內(nèi)體再次內(nèi)陷,形成多泡體,多泡體與細(xì)胞膜嵌套融合,最后將形成的外泌體釋放到細(xì)胞外[3]。

外泌體載體綜合了細(xì)胞藥物遞送和納米技術(shù)優(yōu)勢(shì),幾乎所有細(xì)胞都能主動(dòng)分泌外泌體,這個(gè)過(guò)程由多種細(xì)胞因子介導(dǎo),選擇性地將特定生物活性分子分選到外泌體中。已有研究表明,外泌體是細(xì)胞與細(xì)胞之間發(fā)揮通信作用的關(guān)鍵組成,不僅可通過(guò)其表面配體分子直接識(shí)別并接觸和激活相應(yīng)的受體細(xì)胞,還可以通過(guò)內(nèi)吞作用將“貨物”轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞,從而發(fā)揮細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[1,4]。這個(gè)過(guò)程依賴于外泌體膜表面的蛋白信號(hào)分子,這些分子與靶細(xì)胞表面的特定分子通過(guò)受體配體結(jié)合,引發(fā)內(nèi)吞或膜融合,將外泌體中攜帶的信息物質(zhì)傳遞給靶細(xì)胞,進(jìn)而改變靶細(xì)胞的生理狀態(tài)。

2 外泌體的分離提純及鑒定

2.1 外泌體的分離提純方法

截至目前,還沒有任何一種有效的方法能同時(shí)保證外泌體的含量、 純度、 生物活性[5]。當(dāng)前的研究主要集中在外泌體作為治療靶標(biāo)、藥物或基因載體及作為疾病標(biāo)志物的應(yīng)用。鑒定外泌體的方法主要是根據(jù)外泌體的生物學(xué)性狀如形態(tài)學(xué)觀察,結(jié)合其所含蛋白質(zhì)及核酸等物質(zhì)進(jìn)行分析。常見的外泌體分離提純方[5-6]法如表1。

表1 外泌體分離提純方法比較Tab.1 Comparison of methods for the separation and purification of exosomes

2.2 外泌體的鑒定方法

2014年國(guó)際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì) (ISEV) 提出,對(duì)于體外分離獲取的外泌體需要從三個(gè)層面進(jìn)行鑒定[7]:WB檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白的表達(dá)情況,即外泌體囊泡膜上含有能夠運(yùn)輸外泌體的跨膜蛋白家族(CD63/CD81/CD9、熱休克蛋白家族(HSP60/HSP70/HSPA5/CCT2/HSP90)和一些細(xì)胞特異性蛋白。外泌體形態(tài)結(jié)構(gòu)鑒定采用透射電子顯微鏡,電鏡具有較高的分辨率,可通過(guò)直接觀察樣品鑒定外泌體形態(tài)。外泌體粒徑和濃度采用納米顆粒示蹤分析檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。納米顆粒示蹤分析檢測(cè)技術(shù)可快速且能夠精準(zhǔn)地分析出外泌體的粒徑大小及濃度。YU M 等[8]研究經(jīng)阿伐他汀預(yù)處理后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)外泌體是否具有促血管生成能力時(shí),對(duì) BMSC來(lái)源的外泌體進(jìn)行了鑒定,透射電鏡觀察到各組外泌體的典型球形、膜狀結(jié)構(gòu)。WB分析顯示,分離的顆粒中均檢測(cè)到外泌體標(biāo)志蛋白TSG101和CD81。NTA結(jié)果表明,Exos和ATV-Exos 均在大約 80～120 nm處顯示單峰。

3 外泌體載藥

3.1 外泌體的載藥類型

外泌體的天然屬性使其成為非常有潛力的藥物遞送載體,可用于遞送各種化學(xué)物質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等。外泌體的載藥類型主要分為三大類,即藥物遞送系統(tǒng)(doxorubicin, paclitaxel, curcumin, temozolomide)、核酸遞送系統(tǒng)(siRNA, miRNA, mRNA, DNA plasmid)、蛋白遞送系統(tǒng)(catalases)[9]。

3.2 外泌體的載藥方式

目前,將藥物等小分子物質(zhì)載入外泌體的方式主要有兩種,即內(nèi)源性裝載(Pre-loading)和外源性裝載(post-loading)。

第一種是對(duì)親本細(xì)胞進(jìn)行修飾,使其分泌的外泌體載有功能分子即內(nèi)源性裝載(Pre-loading)。在生物發(fā)生過(guò)程中,親本細(xì)胞產(chǎn)生外泌體之前就可以把治療分子在外泌體生成過(guò)程中整合到外泌體內(nèi),讓細(xì)胞成為載藥外泌體的活工廠,直接生成想要的外泌體。內(nèi)源裝載思路是:在產(chǎn)生外泌體的細(xì)胞上做文章,根據(jù)外泌體產(chǎn)生的過(guò)程對(duì)細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)改造(通常涉及蛋白/多肽的融合表達(dá)、基因藥物的過(guò)表達(dá)等),讓其產(chǎn)生攜帶目標(biāo)分子的外泌體。但與外源裝載相比,內(nèi)源裝載的實(shí)驗(yàn)難度更大,周期更長(zhǎng)。內(nèi)源性外泌體裝載機(jī)制研究尚不完全清楚。Ran等[10]為了檢測(cè)外泌體作為前肽遞送載體的可行性,構(gòu)建編碼前肽抑制域的融合蛋白,將其插入至外泌體跨膜CD63的第二細(xì)胞外環(huán)當(dāng)中,使得前肽可表達(dá)在外泌體的表面,轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)前肽的慢病毒(CD63-propeptide-expressing lentivirus)進(jìn)入小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH3T3),生成表達(dá)前肽的外泌體(EXOpro),通過(guò)小鼠腹腔注射表達(dá)前肽的外泌體的特異性與野生型小鼠血清中成熟的肌生成抑制素相結(jié)合,從而發(fā)揮相應(yīng)的治療作用。Choi等[11]設(shè)計(jì)兩種蛋白表達(dá)載體,構(gòu)建可以穩(wěn)定表達(dá)CIBN-EGFP-CD9 和srIκB-mCherry-CRY2兩種重組蛋白的細(xì)胞株,利用460 nm的藍(lán)光照射,誘導(dǎo)細(xì)胞主動(dòng)將抗炎性蛋白裝載至外泌體中,從而進(jìn)行可控的蛋白互作。EXPLOR系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì):可輕松攜帶需要的重組蛋白,不需分離純化;經(jīng)基因改造的細(xì)胞可簡(jiǎn)單便捷的生產(chǎn)目的外泌體,在外泌體蛋白治療商業(yè)化中有巨大潛力;可與個(gè)性化治療兼容,生產(chǎn)根據(jù)患者定制的藥物遞送系統(tǒng),從而減少宿主免疫反應(yīng)。Fu等[12]基于體內(nèi)自組裝外泌體siRNA的策略,實(shí)現(xiàn)了siRNA從表達(dá)到裝載再到遞送的全體內(nèi)自動(dòng)化過(guò)程,體外構(gòu)建可表達(dá)siRNA的基因環(huán)路,靈活的實(shí)現(xiàn)多個(gè)siRNA和靶向肽段的插入。核心環(huán)路:不帶靶向標(biāo)簽,用于系統(tǒng)性siRNA的遞送。自組裝環(huán)路:帶靶向標(biāo)簽,用于靶向性siRNA的遞送。可編輯基因環(huán)路的優(yōu)勢(shì):以宿主自身組織細(xì)胞分泌的外泌體為載體,解決了以siRNA作為器官或者組織細(xì)胞遞送載體所帶來(lái)的各種問題,如免疫源性高和細(xì)胞或組織器官毒性高等問題,對(duì)基因環(huán)路的靈活編輯,可同時(shí)傳輸多個(gè)siRNA,對(duì)疾病進(jìn)行多靶點(diǎn)打擊,特異性的靶向肽段可高效的將siRNA輸送到特定的組織,克服血腦屏障等生物屏障的制約。

第二種是對(duì)新分離提取到的高質(zhì)量的外泌體進(jìn)行修飾,即外源性裝載(post-loading)。相比內(nèi)源裝載,外源裝載操作更簡(jiǎn)單,批次間的穩(wěn)定性更高,更適合放大化生產(chǎn)。在分離天然外泌體后,對(duì)收集到的外泌體進(jìn)行相應(yīng)的藥物裝載,分為多種不同的裝載方式,見表2。

表2 外泌體藥物裝載方式比較Tab.2 Comparison of exosomal drug loading method

已有研究證實(shí),抗癌藥物如紫杉醇(PTX)[13]和阿霉素(DOX)[14]能夠通過(guò)成功載入外泌體,進(jìn)而用于抗腫瘤治療。通過(guò)利用外泌體運(yùn)送紫杉醇到對(duì)應(yīng)的腫瘤部位進(jìn)行抗腫瘤的研究中,由于間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)可自主歸巢至腫瘤微環(huán)境且不通過(guò)基因操作就能運(yùn)輸紫杉醇,有效的輸送紫杉醇且不破壞其生物活性,小泡溶液蛋白質(zhì)濃度較低時(shí)就可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在體外對(duì)癌細(xì)胞的抑制效果方面,這種方式的抑制效果與單純使用紫杉醇的效果相比基本一致。應(yīng)用外泌體在體外成功運(yùn)輸紫杉醇的案例成為外泌體運(yùn)載抗癌藥物進(jìn)行體內(nèi)腫瘤治療的重要證據(jù)。姜黃素是一種黃色色素,主要提取于姜黃的根莖中,具有抵抗炎癥、促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)、抵抗惡性細(xì)胞增殖、疏風(fēng)散寒、抗氧化、抗血管生成及保護(hù)肝臟、提高肝臟解毒能力等功效。與紫杉醇和阿霉素的作用功效類似,姜黃素在臨床應(yīng)用方面也存在著眾多問題,如較低的水溶性、體內(nèi)代謝速度快,因此在機(jī)體能被快速清除。外泌體作為包載姜黃素[15]和大黃素[16]的載體,可以天然提高姜黃素和大黃素在機(jī)體水環(huán)境中的溶解性、穩(wěn)定性和生物利用度等。

3.3 外泌體的載藥優(yōu)勢(shì)

目前,外泌體作為一種極有價(jià)值的天然藥物遞送載體逐漸得到廣泛深入地開發(fā)和研究。傳統(tǒng)藥物往往因?yàn)樗苄圆?、生物相容性差、易被人體機(jī)體排除、向細(xì)胞內(nèi)滲透的能力低和體內(nèi)分布不均等眾多缺陷性問題限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。外泌體作為具有納米級(jí)別的天然外囊泡,相比其他傳統(tǒng)的藥物遞送系統(tǒng)具有顯著地優(yōu)勢(shì):①釋放到細(xì)胞外的外泌體可以作為細(xì)胞間的天然信號(hào)傳遞信使,發(fā)揮細(xì)胞間通訊(尤其是遠(yuǎn)距離通訊)作用。外泌體具有良好的生物相容性、無(wú)毒且免疫原性低。而人工合成的納米載體如在機(jī)體經(jīng)多次給藥后就可誘發(fā)機(jī)體適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng),進(jìn)而被機(jī)體內(nèi)免疫系統(tǒng)快速清除,并可能激發(fā)異常的免疫應(yīng)答如過(guò)敏反應(yīng)等不良的相關(guān)事件發(fā)生[1,17]。②外泌體天然的“回巢”能力說(shuō)明其在體內(nèi)外藥物遞送中可能存在潛在應(yīng)用價(jià)值。外泌體通過(guò)特異性識(shí)別并結(jié)合到相應(yīng)細(xì)胞,是借助細(xì)胞膜表面的表達(dá)受體或細(xì)胞外基質(zhì)中相關(guān)的結(jié)合蛋白等眾多信號(hào)分子共同作用的結(jié)果,最終不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體進(jìn)行定向性或趨向性的細(xì)胞遷移,能靶向到特定的組織和器官,攝取協(xié)同的藥物載體,同時(shí)保護(hù)攜帶的治療分子(如miRNA等),減少其在體內(nèi)的降解。③外泌體作為脂質(zhì)包裹的小囊泡,能夠快捷有效地穿過(guò)生物膜,包括血腦屏障、血?dú)馄琳稀V過(guò)膜和細(xì)胞質(zhì)膜等在內(nèi)的各種生物屏障,實(shí)現(xiàn)藥物遞送[9,18]。當(dāng)然,對(duì)外泌體的研究還可進(jìn)行工程化改造等。

4 結(jié)論

近年來(lái),在癌癥治療中,將抗癌類藥物運(yùn)輸?shù)竭_(dá)癌癥部位成為癌癥治療的關(guān)鍵技術(shù)問題,引起了各領(lǐng)域研究者們的眾多關(guān)注。藥物載體種類較多,但目前在研究中使用比較廣泛的有兩類,一是以聚合物作為載體,另一是以脂質(zhì)體作為載體。而這些藥物載體依然存在著穩(wěn)定性差、在血液中駐留時(shí)間短、易被機(jī)體免疫系統(tǒng)清除、藥物靶向性較低等問題。藥物的靶向遞送一直是治療機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)疾病急需解決的關(guān)鍵問題之一,因此需要一種新的、安全的、有效的藥物遞送載體[9,19]。

外泌體以細(xì)胞分泌納米級(jí)的小泡在細(xì)胞與細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)部的信息交流過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,并因在人體內(nèi)廣泛分布能順利穿過(guò)細(xì)胞膜且不會(huì)引起機(jī)體細(xì)胞的免疫反應(yīng),這也是其能夠成為藥物載體的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),成為運(yùn)輸基因、抗腫瘤、抗炎等類藥物的新途徑。目前,在臨床疾病治療中,已有使用外泌體進(jìn)行安全性治療的臨床結(jié)果[1,20],但對(duì)外泌體在靶向藥物遞送過(guò)程中許多環(huán)節(jié)涉及到的重要技術(shù)尚不清楚,還有重多難題需要解決。外泌體是如何攜載“貨物”遞送至機(jī)體各個(gè)系統(tǒng),這一機(jī)制還有待進(jìn)一步的闡明。應(yīng)用外泌體載藥遞送技術(shù)治療臨床疾病,外泌體的提純、質(zhì)量、產(chǎn)量、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)、載藥效率、存儲(chǔ)條件和載藥穩(wěn)定性等都是其相關(guān)技術(shù)在臨床實(shí)踐過(guò)程中非常重要的評(píng)定因素[20]。如何解決以上系列問題、促進(jìn)納米藥物載體的有效遞送系統(tǒng)從實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入臨床應(yīng)用,目前的技術(shù)條件仍相當(dāng)有限,亟待更新技術(shù)克服這些困難。