植物乳桿菌與纖維素酶組合對(duì)玉米秸稈微貯品質(zhì)的影響

■ 王加黛 王利軍 王 平 劉超齊 金三俊 黨曉偉 常 娟 尹清強(qiáng)*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南鄭州 450046；2.河南德鄰生物制品有限公司，河南新鄉(xiāng) 453500）

玉米秸稈是我國(guó)常見(jiàn)的農(nóng)副產(chǎn)品，具有纖維素含量高、適口性差、瘤胃降解率低等特點(diǎn)，導(dǎo)致其利用率低，僅為30%，直接限制了玉米秸稈資源在反芻動(dòng)物粗飼料中的應(yīng)用。玉米秸稈微貯主要以干秸稈為原料，通過(guò)調(diào)節(jié)水分、添加發(fā)酵菌劑密封儲(chǔ)存，利用微生物厭氧發(fā)酵，降低其pH，達(dá)到改善飼料品質(zhì)、增加營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、提高家畜生產(chǎn)性能和經(jīng)濟(jì)效益的目的，是一種秸稈資源化利用的有效途徑[1-3]。

乳酸菌是微貯飼料中最常見(jiàn)的添加劑種類，進(jìn)行微貯時(shí)直接加入乳酸菌制劑，能夠增加發(fā)酵時(shí)的初始乳酸菌數(shù)目，加快乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸，促使微貯pH 快速下降，從而抑制霉菌等有害微生物的生長(zhǎng)繁殖，提高秸稈的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，改善微貯發(fā)酵品質(zhì)[4-5]。纖維素酶能夠降解玉米秸稈細(xì)胞壁中的纖維素，降低秸稈中的纖維含量[6]，同時(shí)將秸稈中富含的多糖物質(zhì)水解為單糖，為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供資源，促進(jìn)秸稈的發(fā)酵過(guò)程[7]。常見(jiàn)的微貯輔料（如玉米粉、豆粕等）的添加也能在一定程度上改善發(fā)酵品質(zhì)。因此，本試驗(yàn)通過(guò)添加發(fā)酵底物并聯(lián)合使用植物乳桿菌和纖維素酶進(jìn)行玉米秸稈微貯，研究其對(duì)玉米秸稈微貯品質(zhì)的影響，為玉米秸稈微貯工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米秸稈取自河南省新鄉(xiāng)市，挑選干凈的玉米秸稈去根，自然風(fēng)干，室溫保存。植物乳桿菌來(lái)自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)飼料生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，纖維素濾紙酶活為221.74 FPU/g。玉米粉、棉粕由河南德鄰生物制品有限公司惠贈(zèng)。

1.2 微貯玉米秸稈發(fā)酵底物的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用三因素三水平正交設(shè)計(jì)，選取玉米粉（A）、棉粕（B）、水分含量（C）為考察因素，進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)，共10 組（9 個(gè)試驗(yàn)組+1 個(gè)對(duì)照組），試驗(yàn)分組如表1 所示。9 個(gè)試驗(yàn)組中玉米秸稈占風(fēng)干物質(zhì)的比例為94%～98%，使風(fēng)干物質(zhì)總量達(dá)到100%；發(fā)酵物中水分含量，根據(jù)設(shè)計(jì)要求調(diào)整至60%～70%。對(duì)照組不添加玉米粉、棉粕、氯化鈉和植物乳桿菌，僅含有玉米秸稈，并調(diào)整水分含量為65%。每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100 g。將試驗(yàn)組發(fā)酵底物混合均勻后，添加0.9%氯化鈉及一定量的植物乳桿菌，使物料中植物乳桿菌的活菌數(shù)達(dá)到1×106CFU/g；混合均勻后裝入聚乙烯真空袋中，用真空包裝機(jī)封口。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室以前的試驗(yàn)結(jié)果，室溫下（16～28 ℃）微貯秸稈的發(fā)酵時(shí)間定為28 d。發(fā)酵結(jié)束后，取樣測(cè)定其pH，以pH 為主要指標(biāo)確定最佳底物配比及水分含量。

表1 微貯玉米秸稈發(fā)酵底物的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(%)

1.3 菌和酶單獨(dú)及組合處理玉米秸稈的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在獲得上述最佳發(fā)酵底物組成的基礎(chǔ)上，共設(shè)計(jì)四個(gè)組。分別為對(duì)照組：不添加菌和酶；單菌組：添加植物乳桿菌1×106CFU/g；單酶組：添加的纖維素酶濾紙酶活性為0.1 FPU/g 風(fēng)干物質(zhì)；菌酶組合組：植物乳桿菌1×106CFU/g、纖維素酶0.1 FPU/g 風(fēng)干物質(zhì)。每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100 g，將發(fā)酵底物混合均勻后放于聚乙烯真空袋中，用真空包裝機(jī)封口，室溫下發(fā)酵28 d，28 d 后取樣進(jìn)行感官評(píng)定，并進(jìn)行pH、乳酸菌活菌數(shù)、纖維素降解率的測(cè)定。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 感官評(píng)定

感官評(píng)定方法參考我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部下發(fā)的《青貯飼料質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)》，如表2 所示，開(kāi)封時(shí)對(duì)微貯玉米秸稈的水分含量、色澤、氣味和質(zhì)地等感官指標(biāo)評(píng)定，并測(cè)定pH，進(jìn)行綜合評(píng)分。

表2 青貯飼料質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)（分）

1.4.2 pH測(cè)定

將樣品混勻后稱取10 g 于250 mL 錐形瓶中，加入90 mL 純化水，于搖床上180 r/min 振蕩20 min，通過(guò)定性濾紙過(guò)濾，所制備的浸提液采用pHS-3C pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.4.3 乳酸菌活菌數(shù)測(cè)定

將樣品混勻后稱取2 g 于50 mL 離心管中，加入18 mL滅菌生理鹽水，振蕩均勻后稀釋至100萬(wàn)倍，使用MRS固體培養(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。乳酸菌活菌數(shù)采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果以每克微貯飼料所含的微生物菌落數(shù)（CFU/g）的自然對(duì)數(shù)值（lg）來(lái)表示。

1.4.4 纖維素含量的測(cè)定

將樣品置于65 ℃烘箱，干燥至恒重后，將干燥后的樣品用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎并過(guò)40 目篩后用自封袋密封保存待測(cè)。利用濾袋法，參照Van Soest 等[8]的方法測(cè)定樣品中中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、纖維素和半纖維素的含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan’s 法對(duì)組間進(jìn)行多重比較，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳底物配比及水分含量的正交試驗(yàn)結(jié)果

以pH 為參照指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)分析，由表3 可知，各因素對(duì)玉米秸稈微貯pH 影響的主次關(guān)系為：C（水分含量）＞A（玉米粉）＞B（棉粕），正交試驗(yàn)得出的最佳組合為A2B2C1，與5 組一致，且5 組pH 顯著低于2、3、4 組和對(duì)照組（P＜0.05）。因而，玉米秸稈微貯中最佳風(fēng)干物質(zhì)的組成為96%玉米秸稈、2%玉米粉、2%棉粕；最佳水分含量為60%。以此為基礎(chǔ)，開(kāi)展下面的試驗(yàn)。

表3 不同比例玉米粉、棉粕、水分含量對(duì)微貯28 d玉米秸稈pH的影響

2.2 菌酶復(fù)合發(fā)酵對(duì)玉米秸稈微貯乳酸菌活菌數(shù)、pH及感官評(píng)定的影響

由表4 可知，與對(duì)照組相比，單菌組和菌酶復(fù)合組均能顯著提高玉米秸稈微貯中的乳酸菌活菌數(shù)（P＜0.05）。單菌組、單酶組和菌酶復(fù)合組與對(duì)照組相比，均能顯著降低玉米秸稈微貯的pH，其中菌酶復(fù)合組的pH 降至3.88，顯著低于其余各組（P＜0.05）。感官評(píng)定總評(píng)分從高到低依次為：菌酶復(fù)合組＞單菌組＞單酶組＞對(duì)照組。

表4 發(fā)酵28 d各組玉米秸稈微貯乳酸菌活菌數(shù)及感官評(píng)定

2.3 菌酶復(fù)合發(fā)酵對(duì)微貯玉米秸稈纖維素含量及纖維素降解率的影響

由表5 可知，與對(duì)照組和單菌組對(duì)比，單酶組和菌酶復(fù)合組均可顯著降低玉米秸稈的中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）、纖維素和半纖維素含量（P＜0.05）。

表5 發(fā)酵28 d各組玉米秸稈中纖維素含量（%）

3 討論

3.1 發(fā)酵底物對(duì)微貯效果的影響

微貯原料中可溶性碳水化合物（WSC）的含量可影響微貯發(fā)酵的效果[9]，由于秸稈中的WSC 含量較低，所以在發(fā)酵底物中添加玉米粉可提高原料的初始WSC 含量，為乳酸菌生長(zhǎng)提供優(yōu)質(zhì)碳源，促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)增殖，從而達(dá)到降低微貯pH、改善玉米秸稈的微貯效果[10]。棉粕中粗蛋白含量高，可以為微生物的生長(zhǎng)和繁殖提供氮源，有利于提高玉米秸稈的發(fā)酵品質(zhì)。本試驗(yàn)中，在玉米秸稈的發(fā)酵底物中添加適量的玉米粉和棉粕可顯著降低玉米秸稈微貯后的pH，其原因是玉米粉和棉粕提供了充足的能源和氮源，有利于乳酸菌的生長(zhǎng)和繁殖。水分含量的高低可直接影響微貯的發(fā)酵效果，水分過(guò)高容易導(dǎo)致微貯過(guò)程中發(fā)生腐敗，水分過(guò)低則不利于微生物生長(zhǎng)和秸稈發(fā)酵。本試驗(yàn)結(jié)果顯示水分為60%時(shí)微貯效果最好，這與李苗苗等[11]的研究結(jié)果一致。

3.2 菌酶復(fù)合使用對(duì)微貯玉米秸稈中乳酸菌活菌數(shù)的影響

乳酸菌是微貯發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵微生物。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌產(chǎn)生的乳酸對(duì)微貯玉米秸稈發(fā)酵品質(zhì)具有改善作用，乳酸菌通過(guò)產(chǎn)生乳酸提高飼料發(fā)酵質(zhì)量[12]，并且在生長(zhǎng)過(guò)程中將秸稈中難以被消化吸收的大分子物質(zhì)和抗?fàn)I養(yǎng)因子分解轉(zhuǎn)化，形成便于家畜吸收和利用的小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提高秸稈的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[13]。經(jīng)過(guò)風(fēng)干后的秸稈可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量低于新鮮秸稈，且表面附著的乳酸菌數(shù)量減少，因此進(jìn)行微貯時(shí)加入乳酸菌制劑能夠增加發(fā)酵初始乳酸菌數(shù)目，促進(jìn)乳酸菌增殖產(chǎn)酸，迅速降低微貯秸稈的pH，抑制霉菌等有害微生物的生長(zhǎng)，有效改善微貯發(fā)酵品質(zhì)。纖維素酶能夠水解玉米秸稈細(xì)胞壁的多糖結(jié)構(gòu)，使之分解為葡萄糖，為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供豐富碳源，進(jìn)而增加微貯玉米秸稈中有益微生物菌群的數(shù)量[14]。本試驗(yàn)中，單菌組和菌酶復(fù)合組發(fā)酵28 d 后，乳酸菌活菌數(shù)顯著高于對(duì)照組，且菌酶復(fù)合組的乳酸菌數(shù)目顯著高于單菌組。其原因是，纖維素酶分解秸稈產(chǎn)生的葡萄糖等低分子碳水化合物，為乳酸菌的生長(zhǎng)和繁殖提供了充足的能源，提高了發(fā)酵秸稈中乳酸菌數(shù)量，并降低pH，說(shuō)明菌酶復(fù)合有利于提高發(fā)酵秸稈的品質(zhì)，與青綠飼料的發(fā)酵結(jié)果一致[15]。

3.3 菌酶復(fù)合使用對(duì)微貯玉米秸稈pH的影響

pH 是衡量玉米秸稈微貯發(fā)酵秸稈品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，發(fā)酵過(guò)程中微貯的pH 因乳酸菌大量繁殖產(chǎn)生的乳酸而下降[16]。本試驗(yàn)結(jié)果中單菌組、單酶組和菌酶聯(lián)合組處理的微貯pH 均顯著低于對(duì)照組，其中菌酶復(fù)合組的微貯玉米秸稈中pH 最低。乳酸菌是微貯發(fā)酵是否成功的關(guān)鍵，底物中添加的玉米粉，可被乳酸菌利用產(chǎn)生有機(jī)酸，使微貯的pH 顯著降低。纖維素酶的添加可以破壞細(xì)胞壁中纖維結(jié)構(gòu)，并在進(jìn)行微貯時(shí)將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖，可作為乳酸菌的發(fā)酵底物，促進(jìn)乳酸的產(chǎn)生，降低發(fā)酵后的pH[16]。這也是為什么菌酶聯(lián)合組pH 顯著降低及發(fā)酵效果好和評(píng)分高的原因[17]。

3.4 菌酶復(fù)合使用對(duì)微貯玉米秸稈中纖維素含量的影響

本研究結(jié)果證明，添加纖維素酶的兩組均能顯著降低玉米秸稈的NDF、ADF和纖維素及半纖維素的含量。其主要原因是在微貯過(guò)程中添加纖維素酶所致，與前人研究結(jié)果一致[18]。因此，在未來(lái)的秸稈微貯中，為了提高微貯秸稈的品質(zhì)，考慮纖維素酶及其與乳酸菌的共同添加。

4 結(jié)論

玉米秸稈微貯發(fā)酵風(fēng)干底物的組成為玉米秸稈96%、玉米粉2%、棉粕2%，水分含量為60%時(shí)，微貯發(fā)酵效果最好；在此基礎(chǔ)上進(jìn)行菌酶復(fù)合常溫微貯28 d 后，顯著提高了玉米秸稈的發(fā)酵品質(zhì)，證明了纖維素酶與植物乳桿菌在微貯玉米秸稈中的疊加功能，有利于優(yōu)質(zhì)微貯玉米秸稈的生產(chǎn),但菌酶組合微貯玉米秸稈在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用效果還有待進(jìn)一步探究。