基于遺傳算法優(yōu)化綠豆煮馬錢子的加壓炮制工藝Δ

王一鳴，張宏偉，張紅偉，張振凌，趙永琪（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450046；2.河南省中藥特色炮制技術(shù)工程研究中心，鄭州 450046；3.河南省中藥生產(chǎn)一體化工程技術(shù)研究中心，鄭州 450046；4.國家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450018；5.河南省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)院，鄭州 450008）

馬錢子為馬錢科植物馬錢Strychnos nux-vomicaL.的干燥成熟種子[1]，其有大毒，需炮制后入藥?，F(xiàn)代研究表明，馬錢子含有生物堿類、萜類、有機(jī)酸類等多種化學(xué)成分[2]，其中生物堿類成分士的寧、馬錢子堿是馬錢子的藥效成分和毒性來源[3]，具有抗腫瘤[4—5]、調(diào)節(jié)免疫[6]、抗炎鎮(zhèn)痛[7—8]等多方面功效。歷代本草典籍記載馬錢子的炮制方法有油炸、砂燙、甘草制等。清代《凈緣一助》記載了馬錢子“水泡七日，同綠豆煮一炷香”的炮制方法。2022 年版《河南省中藥飲片炮制規(guī)范》規(guī)定綠豆煮馬錢子的炮制工藝為：取凈馬錢子與綠豆同置鍋內(nèi)，加水適量，煮8 h；撈出，除去綠豆，刮去皮毛，微涼，切頂?shù)镀?.6 mm 厚，曬干；每500 g 馬錢子，用綠豆120 g[9]。但是該法存在耗時較長、加水量模糊等問題，且未對毒性成分的含量標(biāo)準(zhǔn)作出規(guī)定。本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加壓煮狀態(tài)下馬錢子仍保持原有形態(tài)，且士的寧、馬錢子堿含量變化所需時間比常壓煮更短，因此，探究綠豆煮馬錢子的加壓工藝對節(jié)約時間成本和控制質(zhì)量具有重要意義。

最小二乘法（又稱最小平方法）是一種數(shù)學(xué)優(yōu)化技術(shù)，其通過最小化誤差的平方和尋找數(shù)據(jù)的最佳函數(shù)匹配，找到數(shù)據(jù)之間的映射關(guān)系；遺傳算法是一種通過模擬自然進(jìn)化過程搜索最優(yōu)解的方法[10]。本研究以2020年版《中國藥典》馬錢子粉中士的寧、馬錢子堿的含量要求為標(biāo)準(zhǔn)，采用正交實(shí)驗(yàn)考察炮制壓力、炮制時間、綠豆用量、加水量等因素對綠豆煮馬錢子炮制工藝的影響，然后結(jié)合最小二乘法和遺傳算法獲取最佳工藝參數(shù)，并進(jìn)行驗(yàn)證，以期為綠豆煮馬錢子炮制工藝的優(yōu)化提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有LDZX-75KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），BJ-150型高速多功能粉碎機(jī)（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），LC-20AD型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司），SA224S-CW 型萬分之一天平、BT25S型十萬分之一天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]，UPT-I 型超純水機(jī)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

馬錢子藥材購自河南省新鄉(xiāng)市藥材公司，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張振凌教授鑒定為馬錢科植物馬錢S.nux-vomicaL.的干燥成熟種子，符合2020 年版《中國藥典》相關(guān)規(guī)定；綠豆分別網(wǎng)購于吉林省長春市、山東省濟(jì)南市、山西省大同市、河南省開封市、云南省昆明市（編號S1～S5），經(jīng)張振凌教授鑒定為豆科植物綠豆Vigna radiata（L.） R. Wilczek的種子，符合《中國植物志》相關(guān)描述。馬錢子堿、士的寧對照品（批號分別為PS000661、PS000844，純度均為98.0%）購自成都普思生物科技有限公司；乙腈、庚烷磺酸鈉、磷酸二氫鉀為色譜純，氫氧化鈉、無水硫酸鈉為分析純，水為實(shí)驗(yàn)室自制純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 士的寧和馬錢子堿的含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-0.01 moL/L庚烷磺酸鈉與0.02 moL/L磷酸二氫鉀等量混合溶液（用10%磷酸調(diào)節(jié)pH 值至2.8）（V/V，21∶79）為流動相；流速為1.0 mL/min；檢測波長為260 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。

2.1.2 對照品溶液制備

精密稱定士的寧、馬錢子堿對照品10.26、11.56 mg，分別置于10 mL量瓶中，加三氯甲烷適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得上述成分單一對照品溶液。精密量取士的寧對照品溶液2 mL、馬錢子對照品溶液1 mL，置于同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得上述成分質(zhì)量濃度分別為0.205 2 、0.115 6 mg/mL 的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備

精密稱取綠豆煮馬錢子樣品粉末（過三號篩）約0.6 g，置于具塞錐形瓶中，加氫氧化鈉溶液3 mL，放置30 min；精密加入三氯甲烷20 mL，密塞，稱定質(zhì)量；置于水浴條件下回流提取2 h，放冷，再次稱定質(zhì)量；用三氯甲烷補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，取三氯甲烷部位溶液，濾過；取續(xù)濾液3 mL，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.1.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.1.2”項(xiàng)下混合對照品溶液0.5、1、2、3、4 mL 至不同5 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得系列質(zhì)量濃度的對照品溶液；分別精密吸取上述系列對照品溶液10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程及線性范圍，具體見表1。

表1 士的寧、馬錢子堿的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.2 炮制工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

以2022 年版《河南省中藥飲片炮制規(guī)范》中綠豆煮馬錢子飲片的炮制工藝為參考，考察因素包括炮制時間、綠豆用量、加水量、炮制壓力。

2.2.1 炮制時間考察

參考高壓滅菌常用飽和蒸汽絕對壓力2.049 MPa、2022年版《河南省中藥飲片炮制規(guī)范》中每500 g馬錢子用綠豆120 g。取6 份生馬錢子，每份25 g，加蒸餾水0.5 L、綠豆6 g，于內(nèi)部飽和蒸汽絕對壓力為2.049 MPa的高壓滅菌鍋內(nèi)煮4.5、5、5.5、6、6.5、7 h后，撈出；沖洗除去綠豆，并刮去馬錢子皮毛，切頂?shù)镀?.6 mm 厚，60 ℃干燥24 h。按干燥品計算士的寧、馬錢子堿含量，結(jié)果見表2。當(dāng)炮制時間為5～7 h時，樣品含量接近2020年版《中國藥典》馬錢子粉項(xiàng)下士的寧含量為0.78%～0.82%、馬錢子堿不低于0.50%的要求。由于6.5、7 h 時間較久，不符合縮短炮制時間的優(yōu)化目的，故本研究將5、5.5、6 h選為正交實(shí)驗(yàn)炮制時間的3個水平點(diǎn)。

表2 不同炮制時間考察結(jié)果

由表2 可知，炮制時間與士的寧含量呈指數(shù)函數(shù)關(guān)系，由此筆者提出兩者的模型函數(shù)為F（x）＝a×e（bx），進(jìn)一步通過最小二乘法求解得到一元模型函數(shù)為：

式（1）中，F(xiàn)表示士的寧含量，x表示炮制時間，模型擬合優(yōu)度r2＝0.998 6，表明模型具有較高的可靠性。同理可得炮制時間和馬錢子堿含量的模型函數(shù)為：

式（2）中，R表示士的寧含量，x表示炮制時間，模型擬合優(yōu)度r2＝0.997 0。

2.2.2 炮制壓力考察

取4 份生馬錢子，每份25 g，加蒸餾水0.5 L、綠豆6 g，于內(nèi)部飽和蒸汽絕對壓力為1.208、1.691、2.049、2.393 MPa 的高壓滅菌鍋內(nèi)煮5 h 后，撈出；沖洗除去綠豆，并刮去馬錢子皮毛，切頂?shù)镀?.6 mm 厚，60 ℃干燥24 h。按干燥品計算士的寧、馬錢子堿含量，結(jié)果見表3。當(dāng)壓力為1.691～2.393 MPa時，馬錢子中士的寧、馬錢子堿含量較1.208 MPa 時更接近2020 年版《中國藥典》馬錢子粉項(xiàng)下相關(guān)要求。因此，本研究將1.691、2.049、2.393 MPa 選為正交實(shí)驗(yàn)炮制壓力的3 個水平點(diǎn)。

同理，參考炮制時間的建模方法，分別建立炮制壓力與士的寧、馬錢子堿含量關(guān)系的模型函數(shù)：

2.2.3 綠豆用量考察

取5 份生馬錢子，每份25 g，分別加蒸餾水0.5 L 及綠豆3、4.5、6、7.5、9 g，于內(nèi)部飽和蒸汽絕對壓力為2.049 MPa 的高壓滅菌鍋內(nèi)煮5 h 后，撈出；沖洗除去綠豆，并刮去馬錢子皮毛，切頂?shù)镀?.6 mm 厚，60 ℃干燥24 h。按干燥品計算士的寧、馬錢子堿含量，結(jié)果見表4。當(dāng)加入綠豆6～9 g時，馬錢子中士的寧、馬錢子堿含量接近2020 年版《中國藥典》馬錢子粉項(xiàng)下相關(guān)要求。因此，本研究將6、7.5、9 g選為正交實(shí)驗(yàn)綠豆用量的3個水平點(diǎn)。

表4 不同綠豆用量考察結(jié)果

同理，參考炮制時間的建模方法，分別建立綠豆用量與士的寧、馬錢子堿含量關(guān)系的模型函數(shù)：

式（5）、（6）中F、R分別表示士的寧、馬錢子堿的含量，y表示綠豆用量，模型擬合優(yōu)度r2分別為0.979 6、0.990 7。

2.2.4 加水量考察

取5 份生馬錢子，每份25 g，加蒸餾水0.25、0.375、0.5、0.625、0.75 L 及綠豆6 g，于內(nèi)部飽和蒸汽絕對壓力為2.049 MPa 的高壓滅菌鍋內(nèi)煮5 h 后，撈出；沖洗除去綠豆，并刮去馬錢子皮毛，切頂?shù)镀?.6 mm 厚，60 ℃干燥24 h。按干燥品計算士的寧、馬錢子堿含量，結(jié)果見表5。當(dāng)加水量為0.5～0.75 L時，馬錢子中士的寧、馬錢子堿含量接近2020 年版《中國藥典》馬錢子粉項(xiàng)下相關(guān)要求，故本研究將0.5、0.625、0.75 L 選為正交實(shí)驗(yàn)加水量的3個水平點(diǎn)。

同理，參考炮制時間的建模方法，分別建立加水量與士的寧、馬錢子堿含量關(guān)系的模型函數(shù)：

表5 不同加水量考察結(jié)果

式（7）、（8）中，F(xiàn)、R分別表示士的寧、馬錢子堿的含量，z表示加水量，模型擬合優(yōu)度r2分別為0.984 8、0.988 4。

我點(diǎn)撥∶“思什么呢?言什么呢?句子拓展得上聯(lián)。而后用對聯(lián)格式去套想下聯(lián)?！毙∨K于憋半天，出一聯(lián)；思路打開，又生二聯(lián)。我便指導(dǎo)她修改完善。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計

根據(jù)“2.2”項(xiàng)下對炮制時間、炮制壓力、綠豆用量、加水量的單因素考察結(jié)果，確定設(shè)計因素范圍，采用L9（34）正交表設(shè)計實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果見表6。

表6 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

2.4 多元模型優(yōu)選工藝參數(shù)

2.4.1 基于士的寧含量的多元模型建立

根據(jù)式（1）、（3）、（5）、（7），合并同類函數(shù)項(xiàng)，乘以修正系數(shù)，建立士的寧含量多元模型：

式（9）中，m1～m3為常量，具體值由各工藝參數(shù)共同決定。

2.4.2 基于馬錢子堿含量的多元模型建立

根據(jù)式（2）、（4）、（6）、（8），合并同類函數(shù)項(xiàng)，乘以修正系數(shù)，建立馬錢子堿含量多元模型：

式（10）中，n1～n3為常量，具體值由各工藝參數(shù)共同決定。

2.4.3 多元模型求解

基于正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，利用遺傳算法對多元模型中的待定系數(shù)進(jìn)行求解。式（11）為個體適應(yīng)度函數(shù)，等于多元模型的模擬值和正交實(shí)驗(yàn)實(shí)測值的最小方差。

式（11）中，Ai為多元模型模擬值，Ait為實(shí)驗(yàn)值。

通過遺傳算法對未定參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化求解，獲得士的寧和馬錢子堿含量的多元模型[如式（12）、式（13）所示]?；谡粚?shí)驗(yàn)第2、4、6、8組樣品含量對所得模型進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示士的寧含量相對誤差分別為3.21%、1.02%、0.92%、0.46%，馬錢子堿含量相對誤差分別為2.19%、2.39%、0.09%、0.28%，表明模型可靠。

2.4.4 雙目標(biāo)優(yōu)化模型

基于士的寧含量、馬錢子堿含量的多元模型，結(jié)合實(shí)際條件建立如式（14）所示的雙目標(biāo)優(yōu)化模型，并導(dǎo)入MATLAB R2021b軟件構(gòu)建模型示意圖，結(jié)果見圖1。

圖1 不同壓力條件下兩種成分含量的模型圖

式（14）和（15）中，x為5～6 h，a為1.691、2.049、2.393 MPa，y為6～9 g，z為0.5～0.75 L。

根據(jù)2020年版《中國藥典》馬錢子粉項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)，士的寧含量應(yīng)為0.78%～0.82%，馬錢子堿含量應(yīng)不低于0.50%，本研究以F為0.78%～0.82%、R≥0.5%求解雙目標(biāo)模型，結(jié)果無解。這表明不能同時滿足F為0.78%～0.82%、R≥0.5%。以F＝0.78%～0.82%求解雙目標(biāo)模型，得到炮制時間最短且R接近0.5%的工藝參數(shù)為x＝5.5 h、a＝2.393 MPa、y＝9 g、z＝0.75 L，此工藝參數(shù)下F＝0.82%、R＝0.38%。以R≥0.5%求解雙目標(biāo)模型，得到炮制時間最短且F接近0.78%～0.82%的工藝參數(shù)為x＝5 h、a＝2.393 MPa、y＝6 g、z＝0.48 L，此工藝參數(shù)下F＝0.92%、R＝0.51%。為保證用藥安全有效，選擇x＝5.5 h、a＝2.393 MPa、y＝9 g、z＝0.75 L作為最佳工藝，即馬錢子與綠豆在2.393 MPa飽和蒸汽絕對壓力下煮5.5 h后，撈出；沖洗除去綠豆，并刮去馬錢子皮毛，切頂?shù)镀?.6 mm厚；每500 g馬錢子用綠豆180 g、水15 L。

2.5 最佳工藝驗(yàn)證

取生馬錢子及不同批次的綠豆，按最佳工藝條件平行制備5份樣品（S1～S5），然后進(jìn)行含量測定。結(jié)果顯示，每份樣品中士的寧、馬錢子堿含量均符合相應(yīng)要求（具體見表7），RSD均小于3.0 %，表明工藝穩(wěn)定、可行。

表7 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝5）

3 討論

馬錢子的毒性為藥效物質(zhì)導(dǎo)致的固有毒性[11—12]，其炮制工藝研究需使藥效成分含量控制在一定范圍內(nèi)，降低毒性的同時不損失藥性。2020 年版《中國藥典》收載有3種馬錢子飲片規(guī)格（共2種含量標(biāo)準(zhǔn)）：如生馬錢子、制馬錢子干燥品含士的寧應(yīng)為1.20%～2.20%，馬錢子堿不得少于0.80%；馬錢子粉干燥品含士的寧應(yīng)為0.78%～0.82%，馬錢子堿不得少于0.50%。但2020年版《中國藥典》同時也注明，馬錢子不宜生用，應(yīng)炮制后入丸散用，而制馬錢子因毒性較大在臨床很少直接使用，通常將其粉碎后加淀粉制成毒性更低但仍有藥效的馬錢子粉使用。因此，本研究以馬錢子粉含量標(biāo)準(zhǔn)作為炮制工藝評價參照，以期在保證綠豆煮馬錢子飲片藥效的同時，使其安全性更高，且在粉碎后可直接用于臨床，不必再加入淀粉稀釋。在工藝優(yōu)化過程中，筆者發(fā)現(xiàn)，無論是實(shí)驗(yàn)結(jié)果還是數(shù)學(xué)模擬運(yùn)算結(jié)果，當(dāng)士的寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.78%～0.82%時，馬錢子堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)都會低于0.50%，即無法同時滿足樣品中士的寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.78%～0.82%、馬錢子堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于0.50%。在單因素實(shí)驗(yàn)中，馬錢子堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降速率大于士的寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降速率，故筆者推測可能是因?yàn)樯盃C法與綠豆煮法的炮制原理不同，從而使得到的飲片有所差異。

筆者查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，士的寧的毒性較馬錢子堿大[13—14]，因此，為了保證用藥安全，士的寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)控制在0.78%～0.82%。代入工藝模型函數(shù)得最佳炮制工藝：馬錢子與綠豆在2.393 MPa 飽和蒸汽絕對壓力下煮5.5 h 后，撈出；沖洗除去綠豆，并刮去馬錢子皮毛，切頂?shù)镀?.6 mm 厚；每500 g 馬錢子用綠豆180 g、水15 L。此工藝得到的飲片中士的寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.78%～0.82%、馬錢子堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.38%～0.40%。有研究顯示，馬錢子堿以0.12 mg/kg 的劑量灌胃大鼠時具有藥效[15]，按照動物與人體間的等效劑量及馬錢子飲片單次口服劑量（0.3 g），換算出飲片中馬錢子堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)為0.38%。本研究最佳炮制工藝得到的飲片中馬錢子堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.38%，說明該工藝飲片雖未達(dá)到《中國藥典》馬錢子粉項(xiàng)下含量標(biāo)準(zhǔn)，但仍具有一定藥效。

綜上所述，本研究所優(yōu)化的炮制工藝有利于綠豆煮馬錢子飲片的質(zhì)量控制，可為馬錢子炮制品的生產(chǎn)和應(yīng)用提供參考。