馬錢子苷抑制CXCL12/CXCR4信號通路對腰椎間盤突出癥大鼠疼痛反應的影響

喬松，胡艷平，何生華

腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation，LDH）是腰痛和神經放射性腿疼的常見原因，具有病程長、易復發(fā)的特點，嚴重影響患者生活質量［1］。LDH 主要是由于腰神經根受到機械性壓迫或髓核局部炎癥引起，炎性介質可引起膠質細胞激活及炎性因子、趨化因子的釋放，導致神經病理性疼痛的產生［2］。CXC 趨化因子配體12（CXC chemokine ligand 12，CXCL12）又稱基質細胞衍生因子-1（stromal cellderived factor-1，SDF-1），主要來源于活化的神經膠質細胞，可與其特異性受體CXC 趨化因子受體4（CXC chemokine receptor 4，CXCR4）結合并激活下游通路，參與神經系統(tǒng)功能的調節(jié)［3］。研究顯示，CXCL12/CXCR4通路參與脊神經結扎誘導的神經性疼痛，使用CXCL12 中和抗體或CXCR4 拮抗劑AMD3100可抑制神經性疼痛的發(fā)生，減少脊髓背角中星形膠質細胞標志物——膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）和小膠質細胞標志物——離子鈣結合銜接分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba-1）的表達［4］。馬錢子苷（loganin）是從中藥山茱萸中提取的環(huán)烯醚萜苷類化合物，具有抗炎、抗氧化和保護神經元的作用［5］。研究顯示，馬錢子苷可抑制氧化應激和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）活化，改善糖尿病神經病變介導的疼痛，從而改善神經性疼痛［6］。本研究基于CXCL12/CXCR4 信號通路，探討馬錢子苷治療神經性疼痛的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物。6～8 周齡SPF 級SD 雄性大鼠50只，體質量210～230 g，購自河南省實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK（豫）2022-0001，動物飼養(yǎng)于溫度25 ℃，相對濕度55%的環(huán)境中，12 h 晝、夜循環(huán)照明，保持環(huán)境通風整潔，大鼠正常飲食水。（2）主要試劑與儀器。馬錢子苷（純度：98%）購自Sigma公司；CXCL12及CXCR4拮抗劑AMD3100購自MedChemExpress 公司；大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β、IL-6 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；CXCL12、CXCR4、NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）、胱天蛋白酶1（caspase-1）、IL-1β、Iba-1 及異硫氰酸熒光素（FITC）標記的IgG 二抗購自Abcam 公司。BME-403 Von Frey 纖維絲測痛儀、BME-410C 全自動熱痛刺激儀（中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所）；iMark680 多功能酶標儀（美國Bio-Rad 公司）；BX53 熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；ST8R 高速離心機（美國Thermo Scientific公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗動物分組及模型制備 大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，將50 只大鼠按隨機數(shù)字表法抽取10 只為假手術組（Sham組），其余40 只大鼠制備LDH 模型［7］，腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，于背部正中切開約4 cm 皮下組織，暴露雙側L4—L5椎板并切除半椎板，暴露L5神經根，從尾椎間盤取出約10 mg 髓核置于L5 神經根上，避免壓迫，術后每日于臀大肌注射40萬U青霉素預防感染，連續(xù)給藥3 d。Sham組大鼠切開皮膚后僅暴露L4—L5椎板。

造模成功后，將40 大鼠隨機分為Model 組、CXCR4 拮抗劑組（AMD3100 組）、馬錢子苷組、馬錢子苷+CXCL12 組，每組10 只。AMD3100 組給予大鼠鞘內注射20 μg 的AMD3100，馬錢子苷組給予大鼠5 mg/kg 的馬錢子苷腹腔注射，馬錢子苷+CXCL12 組同時給予大鼠腹腔注射5 mg/kg 的馬錢子苷及鞘內注射250 ng 的CXCL12，給藥劑量參照文獻［5，8］，Sham 組與Model 組大鼠同時腹腔注射及鞘內注射等量的生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥2周。

1.2.2 大鼠熱撤足反應潛伏期檢測 分別于造模后1 d及治療后3、7、14 d，采用紅外輻射測溫法評估大鼠熱撤足反應潛伏期，將大鼠置于玻璃籠中1 h以適應環(huán)境，玻璃表面溫度保持在30 ℃，在右后爪下方放置輻射熱源，使用足底鎮(zhèn)痛儀測定30 s內的熱撤足反應潛伏期，測量3次，取平均值。

1.2.3 機械性撤足閾值檢測 分別于造模后1 d 及治療后3、7、14 d，使用BME-410C 全自動熱痛刺激儀檢測機械性撤足閾值，以von Frey 纖維絲（2.5～50 g）刺激大鼠右肢足底二、三跖骨處，每次刺激測試間隔5 min，連測3次，取平均值。

1.2.4 脊髓背角組織形態(tài)學觀察 麻醉處死大鼠，取L4—L6節(jié)段脊髓背角組織，每組隨機抽取5 只大鼠脊髓背角組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋并切片（4 μm），HE染色，顯微鏡下觀察脊髓背角組織形態(tài)學變化。剩余大鼠脊髓背角組織置于液氮中保存。

1.2.5 ELISA 法檢測脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6 水平 取50 mg 脊髓背角組織，按照質量體積比1∶9 的比例加入生理鹽水，勻漿后，以離心半徑10 cm，5 000 r/min 離心20 min，留取上清液于-20 ℃保存，參照試劑盒說明書檢測上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.2.6 免疫熒光染色檢測脊髓背角組織小膠質細胞的激活情況 取液氮中保存的脊髓背角組織，切成10 μm 的切片，室溫干燥后，使用丙酮在4 ℃條件下固定10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后，加入1.2%過氧化氫孵育30 min，再使用0.3% Triton X-100 透化30 min，加入Iba-1 抗體（1∶100 稀釋），4 ℃孵育過夜，再加入FITC標記的IgG二抗（1∶100）室溫孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 Western blot 檢測脊髓背角組織蛋白表達 取凍存的脊髓背角組織，研磨后加入RIPA裂解液提取組織總蛋白，二辛可寧酸（dicinchonic acid，BCA）法檢測蛋白濃度，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離并轉膜；封閉后加入CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β、β-actin抗體稀釋液（1∶1 000），4 ℃孵育過夜；洗滌后，加入二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h。采用Image-Quant 軟件分析CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β 蛋白相對表達量，以βactin為內參。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠熱撤足反應潛伏期、機械性撤足閾值比較 建模后1 d，與Sham組比較，其余組大鼠熱撤足反應潛伏期、機械性撤足閾值降低（P＜0.05）。在治療后3 d、7 d 及14 d，與Sham 組比較，Model 組大鼠熱撤足反應潛伏期、機械性撤足閾值降低（P＜0.05），與Model 組比較，AMD3100 組與馬錢子苷組大鼠熱撤足反應潛伏期、機械性撤足閾值升高（P＜0.05）；在治療后7 d 及14 d，與馬錢子苷組比較，馬錢子苷+CXCL12 組大鼠熱撤足反應潛伏期、機械性撤足閾值降低（P＜0.05），見表1、2。

Tab.1 Comparison of incubation period of hot withdrawal reaction between the five groups of rats表1 各組大鼠熱撤足反應潛伏期比較 （n=10，s，）

＊＊P＜0.01；a與Sham 組比較，b與Model 組比較，c與馬錢子苷組比較，P＜0.05；表2—4同。

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Tab.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold of rats between the five groups表2 各組大鼠機械性撤足閾值比較（n=10，g，）

Tab.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold of rats between the five groups表2 各組大鼠機械性撤足閾值比較（n=10，g，）

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2.2 各組大鼠脊髓背角組織形態(tài)學變化 Sham 組脊髓背角組織結構完整，細胞形態(tài)規(guī)則，核仁清晰可見，胞漿內尼氏小體顆粒豐富；Model 組脊髓背角組織損傷嚴重，炎性細胞浸潤，細胞形態(tài)不規(guī)則，核仁及輪廓不清，胞漿中尼氏小體排列不均勻，胞漿呈空泡樣變化；AMD3100組與馬錢子苷組脊髓背角組織損傷明顯改善，細胞形態(tài)尚規(guī)則，細胞核邊緣與核仁較為清晰，胞漿內尼氏小體分布較為均勻，有少量細胞固縮、壞死；馬錢子苷+CXCL12 組脊髓背角組織較馬錢子苷組病理損傷加重，炎性細胞增多，細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞核邊緣模糊，見圖1。

Fig.1 Histomorphologic changes of spinal dorsal horn in five groups(HE staining,×100)圖1 各組脊髓背角組織形態(tài)學變化（HE染色，×100）

2.3 各組大鼠脊髓背角組織小膠質細胞活化情況比較 與Sham組比較，Model組綠色熒光增加，Iba-1陽性表達增多；與Model組比較，AMD3100組與馬錢子苷組Iba-1 陽性表達減少；與馬錢子苷組比較，馬錢子苷+CXCL12組綠色熒光增多，Iba-1陽性表達增加，見圖2。

Fig.2 Activation of microglia in each group(immunofluorescence staining,×400)圖2 各組小膠質細胞的活化（免疫熒光染色，×400）

2.4 各組大鼠脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 與Sham 組比較，Model 組大鼠脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6 水平升高（P＜0.05）；與Model 組比較，AMD3100 組與馬錢子苷組脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6 水平降低（P＜0.05）；與馬錢子苷組比較，馬錢子苷+CXCL12 組脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of levels of TNF-α,IL-1β and IL-6 in spinal dorsal horn of rats between five groups表3 各組大鼠脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較（n=10，ng/L，）

Tab.3 Comparison of levels of TNF-α,IL-1β and IL-6 in spinal dorsal horn of rats between five groups表3 各組大鼠脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較（n=10，ng/L，）

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2.5 各組大鼠脊髓背角組織蛋白表達 與Sham 組比較，Model 組大鼠脊髓背角組織CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β 表達水平升高（P＜0.05）；與Model 組比較，AMD3100 組與馬錢子苷組CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β 表達水平降低（P＜0.05）；與馬錢子苷組比較，馬錢子苷+CXCL12 組CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β表達水平升高（P＜0.05），見表4、圖3。

Fig.3 Expression levels of CXCL12,CXCR4,NLRP3,caspase-1 and IL-1b in spinal dorsal horn of rats in each group圖3 各組大鼠脊髓背角組織CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表達

Tab.4 Comparison of protein expressions of CXCL12,CXCR4,NLRP3,caspase-1 and IL-1β in spinal dorsal horn of rats between five groups表4 各組大鼠脊髓背角組織CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表達比較（n=5，）

Tab.4 Comparison of protein expressions of CXCL12,CXCR4,NLRP3,caspase-1 and IL-1β in spinal dorsal horn of rats between five groups表4 各組大鼠脊髓背角組織CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表達比較（n=5，）

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3 討論

LDH 多發(fā)于中年男性，主要表現(xiàn)為反復腰痛和坐骨神經痛；髓核對神經根的機械壓迫是產生疼痛的主要原因，神經根在炎癥狀態(tài)下，可激發(fā)機體免疫反應并激活小膠質細胞，促進炎性因子釋放，引發(fā)疼痛［9］。本研究顯示，馬錢子苷可改善LDH 大鼠疼痛反應，減輕大鼠脊髓背角組織病理損傷，降低炎性因子水平，提示馬錢子苷可抑制炎癥反應改善LDH大鼠疼痛反應。

小膠質細胞參與中樞神經系統(tǒng)的免疫反應，活化的小膠質細胞可通過分泌TNF-α、IL-1β 等促炎因子，促進神經炎癥反應，引起痛覺過敏［10］。IL-6、IL-1β 等炎性因子水平變化與疼痛程度密切相關，臨床上，LDH 患者經過治療后血清中TNF-α、IL-1β等因子水平下降，神經痛緩解［11］。在LDH動物模型中，抑制脊髓小膠質細胞活化和神經炎癥反應可治療大鼠神經性疼痛［12］。馬錢子苷在心血管系統(tǒng)、炎癥性疾病與中樞神經系統(tǒng)疾病中具有廣泛的應用［13］。據(jù)報道，馬錢子苷可通過抑制NF-κB 激活，抑制促炎細胞因子TNF-α、IL-1β的釋放，改善慢性壓迫性損傷誘導的神經炎癥和疼痛行為［14］；馬錢子苷還可抑制Aβ1～42誘導的小膠質細胞激活，抑制炎癥反應［15］。本研究結果亦證實，使用馬錢子苷干預后，大鼠脊髓背角組織小膠質細胞活化減少，同時脊髓背角組織TNF-α、IL-1β、IL-6 水平降低，提示馬錢子苷可抑制小膠質細胞活化，抑制脊髓炎癥反應，進而改善LDH大鼠疼痛反應。

CXCL12屬于趨化因子家族，除了具有趨化淋巴細胞的作用外，還可調節(jié)神經信號傳遞，CXCL12 與其受體CXCR4在神經元、星形膠質細胞及小膠質細胞均有表達，CXCL12/CXCR4 通路可激活外周傷害性感覺神經元，引發(fā)痛覺敏化，在骨癌疼痛、糖尿病引起的疼痛、部分坐骨神經結扎誘導的神經疼痛中發(fā)揮重要作用［16-17］。研究顯示，在脊髓損傷小鼠模型中，抑制CXCL12/CXCR4 通路可抑制星形膠質細胞的活化和炎癥反應，減輕神經性疼痛［18］。Cheng等［8］研究顯示，馬錢子苷可通過抑制CXCL12/CXCR4 通路介導的NLRP3 炎性小體的激活來減輕坐骨神經慢性壓迫損傷誘導的神經性疼痛。在本研究中，Model 組大鼠脊髓背角組織中CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β 表達水平較Sham組均升高，表明CXCL12/CXCR4信號通路被激活；給予馬錢子苷治療后，大鼠脊髓背角組織中CXCL12、CXCR4、NLRP3、caspase-1、IL-1β 表達水平均降低，提示馬錢子苷對LDH 大鼠疼痛反應的改善作用可能與抑制CXCL12/CXCR4 信號通路激活有關。此外，CXCR4 拮抗劑AMD3100 可改善LDH 大鼠脊髓背角組織病理損傷，馬錢子苷與AMD3100的作用結果一致；而在馬錢子苷干預的基礎上給予模型大鼠鞘內注射CXCL12 后，馬錢子苷對模型大鼠疼痛反應的改善作用被明顯減弱，提示馬錢子苷可能通過抑制CXCL12/CXCR4 信號通路的激活，抑制小膠質細胞活化與炎癥反應，改善LDH大鼠疼痛反應。

綜上所述，馬錢子苷可改善LDH 大鼠疼痛反應，可能與抑制CXCL12/CXCR4信號通路活性有關。本研究從體內水平初步探究了馬錢子苷治療神經性疼痛的分子機制，除CXCL12/CXCR4信號通路外，馬錢子苷能否通過其他因子或通路發(fā)揮作用仍需進一步探究，在未來的研究中將結合體外細胞實驗深入驗證馬錢子苷的作用機制。