新疆伊犁昭蘇不同動(dòng)物源糞腸球菌耐藥性及耐藥基因檢測(cè)

徐琦琦， 陳月月， 李宏博， 陳萬昭， 秦蕾， 王東， 夏利寧*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052； 2.霍城縣職業(yè)技術(shù)學(xué)校，新疆 伊犁 835200）

糞腸球菌(Enterococcus faecalis)為革蘭氏陽性球菌，是腸球菌屬的一種，廣泛分布于各種環(huán)境介質(zhì)中，如空氣、土壤、水源等，同時(shí)也是人和動(dòng)物胃腸道內(nèi)正常菌群之一[1]。過去，人們認(rèn)為腸球菌危害不大，某些腸球菌甚至可以作為益生菌來使用。但近年來不斷有調(diào)查表明，腸球菌已經(jīng)成為醫(yī)院感染的重要病原體，且高毒力的腸球菌往往來自糞腸球菌[2]。糞腸球菌感染可引起牛子宮蓄膿[3]、綿羊腦炎[4]、肉雞內(nèi)臟病變[5]等。李鵬[6]研究表明，糞腸球菌的耐藥水平可以作為在具體環(huán)境下所釋放該抗菌藥物耐藥性選擇壓力的參考，可將糞腸球菌用作當(dāng)?shù)丶?xì)菌耐藥性的指示菌，并以此研究為基礎(chǔ)來反映當(dāng)?shù)仄渌N菌株的耐藥現(xiàn)狀。前人研究多以集約化養(yǎng)殖場(chǎng)樣本為主，很少針對(duì)散養(yǎng)動(dòng)物樣本進(jìn)行深入探討。因此，本研究通過采集新疆伊犁昭蘇地區(qū)散養(yǎng)戶不同動(dòng)物源樣品，對(duì)從中分離的糞腸球菌進(jìn)行耐藥性和相關(guān)耐藥基因的檢測(cè)，了解該地區(qū)不同動(dòng)物源糞腸球菌的耐藥現(xiàn)狀及耐藥基因攜帶情況，為當(dāng)?shù)匦竽琉B(yǎng)殖的合理用藥提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)填補(bǔ)當(dāng)?shù)丶S腸球菌的耐藥數(shù)據(jù)庫，及時(shí)掌握當(dāng)?shù)亓餍械哪退幓蝾愋?，為防控耐藥性及耐藥基因的擴(kuò)散提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

于2020 年11 月從新疆伊犁昭蘇縣各散養(yǎng)戶分別采集牛、羊的鼻拭子（200 份、210 份）和肛拭子（200 份、210 份）及雞的泄殖腔拭子（300 份）樣品共1 120份，從中分離試驗(yàn)用糞腸球菌。

1.2 試劑

肉湯（mueller-hinton borth，MH）培養(yǎng)基、腦心浸液（brain-heart infusion broth，BHI）培養(yǎng)基、腸球菌購自青島海博生物技術(shù)有限公司；科瑪嘉顯色培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司（原產(chǎn)地法國科瑪嘉）；1×TE 緩沖液、50×TAE 購自上海生工生物有限公司；2×TaqPCR Master Mix、DL 2000 DNA Maker 購自北京天根生化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離與鑒定 用滅菌棉簽分別從牛、羊的鼻腔、直腸和雞的泄殖腔內(nèi)捻轉(zhuǎn)采集內(nèi)容物樣品后放入裝有滅菌肉湯的采樣管中。在實(shí)驗(yàn)室無菌間吸取含有樣品的滅菌肉湯放入裝有高鹽BHI 的圓底離心管中，42 ℃ 180 r·min-1培養(yǎng)18～24 h 后，在腸球菌選擇性培養(yǎng)基上劃線，37 ℃倒置培養(yǎng)18～24 h，挑取平板表面光滑、突起、周圍有黑色沉淀的白色或半透明單一菌落，置于裝有BHI 的圓底離心管中，42 ℃過夜培養(yǎng)后在科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上劃線，37 ℃倒置培養(yǎng)16～20 h 后挑取藍(lán)綠色單菌落于裝有BHI 的圓底離心管中，42 ℃過夜培養(yǎng)，完成對(duì)腸球菌的初次篩選。參照劉洋[7]方法合成糞腸球菌持家基因引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將檢出有目的條帶的菌液送至上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。通過BLAST 進(jìn)行序列比對(duì)，同源性＞96.0%的菌株判定為糞腸球菌。

1.3.2 保菌 在裝有1 mL 菌液的EP 管中加入0.5 mL 60.0%（體積分?jǐn)?shù)）滅菌甘油，使之成為20.0%（體積分?jǐn)?shù)）的甘油菌，保存至-20 ℃冰箱。

1.3.3 藥物敏感性試驗(yàn) 按照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clincal and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的瓊脂稀釋法[8]執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)對(duì)糞腸球菌進(jìn)行8 大類10 種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)，所選抗菌藥物分別為四環(huán)素類（四環(huán)素、多西環(huán)素）、氟喹諾酮類（環(huán)丙沙星、左氧氟沙星）、噁唑烷酮類（利奈唑胺）、糖肽類（萬古霉素）、β-內(nèi)酰胺類（氨芐西林）、酰胺醇類（氟苯尼考）、氨基糖苷類（慶大霉素）、大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素）。糞腸球菌ATCC29212 作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株，藥敏試驗(yàn)結(jié)果以敏感（sensitivity，S）、中介（intermediary，I）、耐藥（resistance，R）表示。

1.3.4 耐藥基因檢測(cè) 根據(jù)選擇的抗菌藥物選擇相對(duì)應(yīng)的耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)。包括抗大環(huán)內(nèi)酯類藥物基因ermA、ermB、ermC；抗噁唑烷酮類藥物基因cfr、optrA、poxtA；抗酰胺醇類藥物基因fexA；抗四環(huán)素類藥物基因tet(M)；抗氟喹諾酮類藥物基因emeA；抗氨基糖苷類藥物基因aph(3’)-Ⅲ。參考文獻(xiàn)[9-17]合成上述基因的引物序列并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)后確定。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 使用SPSS22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，單因素分析采用卡方檢驗(yàn)或Fisher 精確檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 糞腸球菌分離鑒定結(jié)果

采集不同動(dòng)物源各部位樣品共1 120 份，經(jīng)糞腸球菌持家基因鑒定得到263 株糞腸球菌，分離率為23.5%。雞源糞腸球菌、羊鼻糞腸球菌、羊肛糞腸球菌、牛鼻糞腸球菌和牛肛糞腸球菌的分離率分別為21.3%、19.0%、28.6%、21.0%和28.5%（表1）。

表1 不同動(dòng)物源糞腸球菌的分離結(jié)果Table 1 Isolation results of Enterococcus faecalis from different animal sources

2.2 糞腸球菌藥敏結(jié)果

對(duì)不同動(dòng)物源糞腸球菌的耐藥性進(jìn)行分析，結(jié)果（表2）表明，羊源糞腸球菌對(duì)紅霉素、四環(huán)素、氟苯尼考、多西環(huán)素的耐藥率分別為78.0%、83.0%、83.0%、84.0%，均高于75.0%，顯著高于雞源、牛源糞腸球菌；雞源糞腸球菌對(duì)紅霉素、四環(huán)素和多西環(huán)素的耐藥率分別為36.0%、48.4%和50.0%，顯著高于牛源糞腸球菌。在羊源糞腸球菌中，羊鼻拭子糞腸球菌對(duì)利奈唑胺的耐藥率為42.5%，顯著高于羊肛拭子、雞源、牛鼻拭子和牛肛拭子糞腸球菌。5 種來源糞腸球菌對(duì)慶大霉素的耐藥率均較低。羊源糞腸球菌對(duì)環(huán)丙沙星表現(xiàn)為完全敏感；雞源和牛源糞腸球菌對(duì)環(huán)丙沙星耐藥情況表現(xiàn)為差異不顯著。左氧氟沙星耐藥菌株僅在雞源糞腸球菌中檢出。所有糞腸球菌分離株均對(duì)氨芐西林和萬古霉素表現(xiàn)為完全敏感。

表2 不同動(dòng)物源糞腸球菌的耐藥率Table 2 Resistance of E. faecalis from different animal sources

2.3 糞腸球菌的多藥耐藥結(jié)果

表3 為伊犁昭蘇不同動(dòng)物源糞腸球菌多藥耐藥結(jié)果。263 株糞腸球菌中4 耐占比最高，為26.2%。64 株雞源糞腸球菌中，0 耐占比最高，為45.3%；5 耐次之，為18.8%。100 株羊源糞腸球菌中，4 耐占比最高，為64.0%；99 株牛源糞腸球菌中，僅檢測(cè)到對(duì)1～3 種藥具有耐受性，其中1 耐占比最高，為24.2%。

表3 不同動(dòng)物源糞腸球菌的耐藥率Table 3 multidrug resistance of Enterococcus faecalis from different animal sources（%）

2.4 糞腸球菌中耐藥基因的檢測(cè)

263株糞腸球菌中除cfr、ermC和poxtA基因未檢出外，其他7種耐藥基因均有檢出（表4）。外排泵基因emeA在不同來源糞腸球菌中均有檢出，檢出率高于80.0%。在羊源糞腸球菌中，ermB、fexA、optrA、tet(M)和aph(3’)-Ⅲ基因的檢出率分別為73.0%、75.0%、75.0%、81.0%和77.0%，顯著高于雞源和牛源糞腸球菌。ermA基因僅在雞源和羊源糞腸球菌中檢出，且羊源糞腸球菌檢出率顯著高于雞源糞腸球菌。

表4 伊犁昭蘇不同動(dòng)物源糞腸球菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果Table 4 Detection results of drug resistance genes of Enterococcus faecalis from different animal sources in Zhaosu， Yili

3 討論

本研究在不同種類動(dòng)物的鼻腔、肛門和泄殖腔中分離鑒定出的糞腸球菌對(duì)被檢抗菌藥物表現(xiàn)不同程度的耐藥，其耐藥程度由高到低依次為羊源、雞源和牛源；羊源、牛源的鼻拭子與肛拭子糞腸球菌之間的耐藥性無明顯差異。羊源的鼻拭子、肛拭子對(duì)紅霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素和氟苯尼考的耐藥率均在70.0%以上，高于阿迪萊·卡哈曼[18]的研究結(jié)果。本研究所采集的樣本均來自散養(yǎng)戶，與規(guī)?；B(yǎng)殖不同，散養(yǎng)動(dòng)物有食物天然（放牧）以及抗菌藥物使用量少等優(yōu)勢(shì)，但在這種情況下依然出現(xiàn)耐藥率高的現(xiàn)象，應(yīng)引起注意。結(jié)合羊源鼻拭子也有檢出耐藥糞腸球菌的情況，可能是在放牧過程中所接觸的土壤、水及空氣中存在耐藥基因；也可能養(yǎng)殖人員攜帶耐藥菌，或養(yǎng)殖環(huán)境中有野生動(dòng)物攜帶，比如野鼠等。這一現(xiàn)象警示我們，平時(shí)常說的“純天然綠色食品”的家養(yǎng)動(dòng)物可能也無法逃離耐藥菌的侵襲。此外，值得注意的是，羊源鼻、肛拭子糞腸球菌中均檢出利奈唑胺耐藥菌，且鼻拭子糞腸球菌的耐藥率高達(dá)42.5%，遠(yuǎn)高于王舒豐等[19]的結(jié)果。利奈唑胺被認(rèn)為是治療耐萬古霉素腸球菌的最后關(guān)卡，應(yīng)嚴(yán)格規(guī)范該藥物的使用，盡可能延長(zhǎng)耐萬古霉素腸球菌出現(xiàn)的時(shí)間。不同動(dòng)物源糞腸球菌對(duì)慶大霉素的耐藥率較低，且均為低水平耐藥，但也應(yīng)提高警惕，盡量延長(zhǎng)糞腸球菌對(duì)慶大霉素產(chǎn)生高水平耐藥的時(shí)間，因?yàn)樗赡軙?huì)打破氨基糖苷類和β-內(nèi)酰胺類以及糖肽類抗菌藥物的協(xié)同殺菌作用[20]。牛源糞腸球菌的耐藥率普遍較低，這可能是由于每個(gè)散養(yǎng)戶養(yǎng)殖牛的數(shù)量較少，且飼養(yǎng)過程中沒有用過抗菌藥物。雞源糞腸球菌對(duì)四環(huán)素類藥物的耐藥情況最差，其次是紅霉素，但本研究結(jié)果均低于蔣逸凡等[21]的研究結(jié)果。通過對(duì)畜主走訪調(diào)研了解，雞在飼養(yǎng)過程中并未大量使用抗生素，食物來源也是自產(chǎn)的小麥及玉米，這可能是其耐藥率低于規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)的原因。但這樣的結(jié)果也不容樂觀，再一次證明“純天然”家養(yǎng)動(dòng)物也可能將其攜帶的耐藥菌株通過飼喂、屠宰、食品加工、銷售等過程傳遞給人。從這一現(xiàn)象也可以推測(cè)，伊犁昭蘇地區(qū)的環(huán)境被耐藥菌污染的可能性較大，平時(shí)應(yīng)做好環(huán)境消殺工作，并處理好動(dòng)物的排泄物，以免污染當(dāng)?shù)厮?，?dǎo)致耐藥菌的廣泛傳播。

從耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果來看，伊犁昭蘇地區(qū)不同動(dòng)物源糞腸球菌中耐藥基因的攜帶率較高，對(duì)被檢測(cè)的6 大類耐藥基因均有檢出。其中，羊源糞腸球菌中耐藥基因的檢出率最高，ermB、fexA、optrA、tet(M)和aph(3’)-Ⅲ的檢出率均在70.0%以上，與其耐藥表型基本一致。結(jié)合羊源糞腸球菌對(duì)慶大霉素和利奈唑胺的耐藥率及中介率，證明在中介菌株中也能檢出相關(guān)耐藥基因，應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)。氟苯尼考是動(dòng)物專用藥，在動(dòng)物體內(nèi)的耐利奈唑胺腸球菌與其在臨床長(zhǎng)期使用有著密切關(guān)系[22-23]。本研究中optrA檢出率較高，該基因可介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)利奈唑胺產(chǎn)生耐藥性，為避免引發(fā)交叉耐藥，在飼養(yǎng)過程中應(yīng)謹(jǐn)慎使用此藥物。牛源糞腸球菌的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果中，aph(3’)-Ⅲ和fexA的檢出率低于其相對(duì)應(yīng)藥物的耐藥率，這可能由于菌株攜帶有未檢測(cè)的耐藥基因或新的耐藥基因。在雞源糞腸球菌中，aph(3’)-Ⅲ和optrA的檢出率略高于其相對(duì)應(yīng)藥物的耐藥率，這可能是由于耐藥基因在菌體內(nèi)未表達(dá)，這些攜帶耐藥基因的菌株在藥物選擇壓力下轉(zhuǎn)變成耐藥菌株。此外，3 種動(dòng)物源糞腸球菌中外排泵基因emeA的檢出率均在80.0%以上，該基因可介導(dǎo)糞腸球菌對(duì)多種不同結(jié)構(gòu)的抗菌藥物（如慶大霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、新生霉素等）產(chǎn)生外排作用[16]，降低細(xì)菌內(nèi)藥物的有效含量，從而導(dǎo)致療效下降。

綜上所述，新疆伊犁昭蘇地區(qū)羊源糞腸球菌的耐藥性非常嚴(yán)重，相關(guān)耐藥基因的檢出率較高，因此紅霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素和氟苯尼考應(yīng)考慮不再繼續(xù)使用或謹(jǐn)慎使用；牛源糞腸球菌耐藥情況相對(duì)較好，但也應(yīng)持續(xù)監(jiān)測(cè)，避免耐藥程度的加劇。此外，該地區(qū)應(yīng)加強(qiáng)環(huán)境的消殺管理，特別是動(dòng)物排泄物的規(guī)范化處理，避免排泄物中的耐藥菌由環(huán)境向人或動(dòng)物傳播。