低能量激光對人牙周膜細(xì)胞白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α、骨保護(hù)素、核因子-κB受體活化因子配體表達(dá)的影響

湯盟 崔占琴 王陽陽 陳增國 李文靜 張翠萍

1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔正畸科，石家莊 050000；

2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔內(nèi)科，石家莊 050000；

3.福建省龍巖市永定區(qū)醫(yī)院口腔科，龍巖 364100

糖尿病是當(dāng)前較為常見的代謝性疾病[1]，患病人數(shù)逐年遞增。與此同時(shí)伴隨著人們對口腔健康意識的增強(qiáng)，對口腔頜面部審美要求的提升，在口腔正畸領(lǐng)域，越來越多的糖尿病群體尋求正畸治療。以往研究[2]證實(shí)，糖尿病患者體內(nèi)的炎癥因子水平顯著升高，在正畸治療的過程中，這種異常水平的炎癥因子會(huì)造成骨改建過程中一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生改變，引起骨質(zhì)丟失，使骨吸收的量遠(yuǎn)大于骨生成的量，導(dǎo)致骨改建失衡[3]。顯然，這無益于正畸治療過程中的牙齒移動(dòng)及牙周組織的改建。

骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）/核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）/核因子-κB 受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）系統(tǒng)是骨改建過程中重要的信號通路，且在人牙周膜細(xì)胞（human periodontal ligament cell，HPDLC）中有表達(dá)[4]。OPG/RANKL的比值可反應(yīng)骨吸收的狀態(tài)，比值增大時(shí)表明骨吸收活動(dòng)減弱，比值減小時(shí)提示骨吸收活躍。研究證實(shí)，糖尿病患者牙周組織的高血糖環(huán)境會(huì)上調(diào)RANKL的表達(dá)并下調(diào)OPG 的表達(dá)，使糖尿病患者的牙槽骨出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，影響正畸牙移動(dòng)及整個(gè)正畸治療進(jìn)程。

在正畸過程中，當(dāng)矯治力施加于被移動(dòng)牙后，分布于牙齒周圍的牙周膜細(xì)胞收到這一力學(xué)刺激信號后會(huì)分泌多種細(xì)胞因子，其中，炎癥因子的表達(dá)可以反映骨改建的程度及牙周組織的健康狀況。白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6 及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 是介導(dǎo)牙周組織炎癥過程中的重要因子，且對于牙周炎癥的評估具有較強(qiáng)的敏感性及特異性，并參與骨改建的調(diào)控。

低能量激光（low-level laser，LLL）具有殺菌、降低炎癥反應(yīng)水平的作用，對創(chuàng)口愈合及骨組織愈合等均有良好的生物刺激作用，在牙周炎的治療方面應(yīng)用廣泛[5]。但關(guān)于LLL 是否可以通過減輕糖尿病正畸患者牙周組織的炎癥，近而調(diào)控破骨通路中相關(guān)因子的表達(dá)，從而保證糖尿病患者正畸過程中骨代謝平衡的研究鮮有報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)HPDLC，分別用低糖型杜氏改良Eagle 培養(yǎng)基（Dulbecco’s modification of Ea‐gle’s medium，DMEM）和高糖型DMEM 模擬體內(nèi)的正常血糖和高血糖水平，在給予LLL 干預(yù)后，使用自制的持續(xù)靜壓力裝置模擬正畸治療過程中牙齒壓力側(cè)受力情況，研究高糖環(huán)境下LLL 對受壓力刺激的HPDLC中IL-6、TNF-α及OPG、RANKL 表達(dá)情況的影響，以期探討LLL 療法能否對糖尿病患者正畸治療過程中的骨代謝紊亂情況產(chǎn)生影響，為糖尿病人群正畸治療過程中骨改建的調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM（GIBCO 公司，美國），青霉素/鏈霉素溶液（上海碧云天生物科技有限公司），胎牛血清（PAN 公司，德國），0.25%胰蛋白酶、磷酸緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（BI公司，以色列），CK19（杭州華安生物技術(shù)有限公司），通用型SP 試劑盒（上海中杉金橋生物技術(shù)有限公司），細(xì)胞凍存液（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司），人OPG、RANKL、IL-6、TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELI‐SA）試劑盒（上海愛萌優(yōu)寧生物技術(shù)有限公司）。

1.2 HPDLC的取材及培養(yǎng)

HPDLC 取材自就診于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔頜面外科12~18周歲患者因正畸減數(shù)治療而拔除的健康前磨牙，所有患者無全身系統(tǒng)性疾病，所取牙齒牙周狀況良好，無齲病及其他牙體牙髓疾病，取材前已事先告知患者所取牙用途，并取得患者及家屬知情同意，同時(shí)獲得河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理編號為（2022-R752）。牙脫位后，在無菌條件下取材，采用組織塊法進(jìn)行HPDLC 的原代培養(yǎng)，取傳代第4 代的HPDLC用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 HPDLC組織來源鑒定

取傳代第4 代生長狀況良好的HPDLC 制作細(xì)胞爬片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色和免疫組織化學(xué)染色，鑒定其組織來源。

1.4 HPDLC生長曲線的繪制

將第4 代HPDLC 消化離心后制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度以每毫升3×104個(gè)，接種于24 孔板中，每孔1 mL，置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后隨機(jī)取3孔細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，求取平均值，同一時(shí)間點(diǎn)連續(xù)計(jì)數(shù)8 d，最后進(jìn)行細(xì)胞生長曲線的繪制。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將HPDLC 隨機(jī)分為A、B、C、D 組。A 組：低糖型DMEM+壓力刺激；B 組：高糖型DMEM+壓力刺激；C 組：低糖型DMEM+LLL 照射+壓力刺激；D 組：高糖型DMEM+LLL照射+壓力刺激。C、D 組根據(jù)激光能量密度值的不同又分為1 組和2 組，其中C1、D1 組的能量密度值為3.75 J/cm2；C2、D2 組的能量密度值為5.625 J/cm2。分別在0、12、24、48、72 h 共5 個(gè)時(shí)點(diǎn)定時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，每個(gè)時(shí)點(diǎn)采集3 個(gè)樣本。

1.6 LLL照射

本實(shí)驗(yàn)采用pilot-半導(dǎo)體激光儀，波長為810 nm，光纖直徑400 nm，無線頻率2.46 Hz，功率100 mw，光斑面積9.6 cm2。參照以往文獻(xiàn)[6]結(jié)果，照射時(shí)間=能量密度/功率密度。對C1、C2、D1、D2 組細(xì)胞在壓力加載前進(jìn)行LLL 照射，為避免激光散射對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的影響，只選擇6孔板對角線上的2 孔（圖1 中紅色標(biāo)記處）進(jìn)行細(xì)胞接種實(shí)驗(yàn)，6 孔板相鄰孔間用4%臺盼藍(lán)染液（圖1中藍(lán)色標(biāo)記處）進(jìn)行分隔，并在6孔板底鋪置不透光黑紙，整個(gè)操作過程在暗室中進(jìn)行。

圖1 LLL照射HPDLC的裝置Fig 1 LLL therapy device for HPDLCs

1.7 細(xì)胞靜壓力加載裝置

本實(shí)驗(yàn)參考黃生高等[7]的機(jī)械壓力模型構(gòu)建方法，沿用本課題組原持續(xù)靜壓力加載裝置[8]如圖2所示，用以模擬正畸治療時(shí)壓力側(cè)牙周組織的受力情況。該裝置主要由圓形玻璃片（規(guī)格為直徑30 mm，厚4 mm，密度2.5×103kg/m3）加載在鋪滿單層HPDLC 的平底6 孔板上組成。細(xì)胞所受壓力計(jì)算公式：P=ρh，其中P 為細(xì)胞所受壓力，ρ為玻璃密度，h 為玻璃厚度。參照以往文獻(xiàn)[2]報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)所使用的壓強(qiáng)值為 2 g/cm2。

圖2 HPDLC 持續(xù)靜壓力加載裝置Fig 2 Static mechanical pressure sketch map of HPDLCs

1.8 LLL與壓力刺激干預(yù)HPDLC

取生長狀態(tài)良好的第3 代HPDLC，經(jīng)胰酶消化離心后用于實(shí)驗(yàn)，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6 孔板對角線位置的2 個(gè)培養(yǎng)皿中。接種完畢后，將6 孔板移至CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，次日對各孔細(xì)胞進(jìn)行換液處理，其中A、C 兩組仍使用含雙抗和20%FBS的低糖型DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行換液，B、D 兩組更換為含雙抗和20%FBS 的高糖型DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行換液，2 d 后再次重復(fù)上述方式進(jìn)行換液，每次換液后于鏡下觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞生長接近平底6孔板的板底時(shí)，按上述分組給予相應(yīng)的激光干預(yù)和壓力刺激，分別在0、12、24、48、72 h 共5 個(gè)時(shí)點(diǎn)，定時(shí)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)上清液的收集并記錄。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，計(jì)時(shí)收集HP‐DLC 培養(yǎng)液后在1 000 r/min 下離心10 min，取上清液，分裝后于-20 ℃冰箱進(jìn)行保存，待所有上清液收集完畢，統(tǒng)一將收集的上清液解凍并用ELI‐SA 試劑盒檢測各組IL-6、TNF-α、OPG、RANKL的表達(dá)情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用 SPSS 22.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用t檢驗(yàn)方法進(jìn)行各組間均數(shù)的兩兩比較，P＜0.05 被視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牙周膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)結(jié)果

在原代細(xì)胞的培養(yǎng)中，最快5~7 d 即可在顯微鏡下看到細(xì)胞從組織塊周圍爬出，慢的則需要20 d左右。圖3A所示為HPDLC原代培養(yǎng)10 d，鏡下可見爬出的細(xì)胞胞體形態(tài)為長梭形，胞漿透明，胞質(zhì)豐富，胞核居細(xì)胞中央，呈圓形或橢圓形，包含核仁；大約20 d 可見細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶底的80%，如圖3B 所示為HPDLCS 原代培養(yǎng)21 d，此時(shí)即可對細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代后的細(xì)胞生長速度較快，約4~5 日即可進(jìn)行下一次傳代；圖3C所示為HPDLCS傳代3代鏡下所見。

圖3 HPDLC的培養(yǎng) 倒置相差顯微鏡 × 100Fig 3 Culture of HPDLCs Inverted phase contrast microscope × 100

2.2 牙周膜細(xì)胞來源鑒定結(jié)果

細(xì)胞經(jīng)HE 染色后，鏡下觀察如圖4A 所示：細(xì)胞呈長梭形或多角形，胞核呈圓形或橢圓形，藍(lán)染嗜堿性，內(nèi)含1~5個(gè)核仁，胞漿豐富紅染嗜伊紅。免疫組織化學(xué)染色鏡下可見：抗角蛋白染色如圖4B 所示呈陰性，胞漿未見染色；細(xì)胞抗波形絲蛋白染色如圖4C 所示呈陽性，胞漿棕黃色。綜上判斷細(xì)胞符合間充質(zhì)來源的細(xì)胞特征，并結(jié)合所取組織部位可判定為所培養(yǎng)細(xì)胞為HPDLC。

2.3 細(xì)胞生長曲線

將細(xì)胞接種于24孔板，觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，鏡下見細(xì)胞生長狀態(tài)良好。根據(jù)細(xì)胞生長狀況繪制如圖5所示的細(xì)胞生長曲線，繪制出的生長曲線接近S 形，整個(gè)生長周期分為3 個(gè)階段，分別為：停滯期、對數(shù)生長期和平臺期。接種后的1~2 d，細(xì)胞生長較緩慢，未見明顯增殖；3 d 后細(xì)胞生長迅速進(jìn)入對數(shù)生長期；生長至7 d，細(xì)胞增殖速度減慢，細(xì)胞間出現(xiàn)生長抑制，細(xì)胞的增殖進(jìn)入平臺期。整個(gè)過程符合體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長規(guī)律。

圖5 HPDLC的生長曲線Fig 5 Grow curve of HPDLCs

2.4 各組炎癥因子的蛋白表達(dá)

各組炎癥因子IL-6、TNF-α 的表達(dá)水平如圖6所示，由圖可見這兩者的蛋白濃度均隨時(shí)間逐漸上升。

圖6 各組炎癥因子的表達(dá)情況Fig 6 The expression of inflammatory factors in each group

各組IL-6的表達(dá)檢測結(jié)果如表1所示。各組組間經(jīng)兩兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)可知，12 h 后組間比較，A 組與B、C1、C2 組（P＜0.05）和B 組與D1、D2組（P＜0.01）的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 ELISA 檢測各組IL-6蛋白的濃度表達(dá)情況Tab 1 The expression of IL-6 protein was detected by ELISApg/mL

對各組組內(nèi)的不同時(shí)點(diǎn)采用配對樣本t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：A 組0 h 與12、48、72 h，12 h 與48、72 h，24 h 與48、72 h；B 組0 h 與12、24、48、72 h，12 h 與48、72 h，24 h 與48 h；C1 組0 h與24、48、72 h，12 h與48、72 h；C2組0 h與12、72 h，12 h 與72 h，24 h 與48 h；D1 組0 h 與48、72 h，24 h與48、72 h；D2組0 h與24、72 h，12 h 與24、48、72 h，24 h 與72 h 間比較的IL-6 蛋白濃度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

TNF-α 的蛋白表達(dá)情況如表2 所示，各組經(jīng)組間兩兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)可知，12 h 后組間比較，A組與B、C1、C2組（P＜0.05）和B組與D1、D2組（P＜0.01）間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 ELISA 檢測各組 TNF-α蛋白濃度表達(dá)Tab 2 The expression of TNF-α protein was detected by ELISApg/mL

針對各組組內(nèi)不同時(shí)點(diǎn)采用配對樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：A 組0 h 與24、72 h，12 h 與48、72 h，48 h 與72 h；B 組0 h 與12、24、48、72 h，12 h 與24、48、72 h，24 h 與72 h，48 h 與72 h；C1 組0 h 與48、72 h，12 h 與24、48、72 h，24 h 與72 h，48 h 與72 h；C2 組0 h 與12、24、48、72 h，12 h 與48、72 h，24 h與72 h；D1 組0 h 與12、24、48、72 h，12 h 與48、72 h，24 h 與48、72 h，48 h 與72 h；D2 組0 h 與12、24、48、72 h，12 h 與48、72 h，24 h 與48、72 h，48 h 與72 h 間比較的TNF-α 蛋白濃度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 各組骨改建相關(guān)因子的蛋白表達(dá)

各組骨改建相關(guān)因子的蛋白表達(dá)如圖7 所示，其中OPG 蛋白濃度變化如圖7A所示，總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，以24 h 為界，在0~24 h 內(nèi)均呈現(xiàn)上升趨勢，24 h 后逐漸下降；RANKL 蛋白濃度變化如圖7B 所示，各組RANKL 蛋白濃度總體呈逐步上升的趨勢；OPG/RANKL蛋白濃度的比值變化如圖7C 所示，各組OPG/RANKL 蛋白濃度比值總體呈現(xiàn)逐步下降的趨勢。

各組OPG 蛋白濃度表達(dá)如表3 所示，經(jīng)組間兩兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)可知，12 h 后組間比較，A 組與B、C1、C2組和B組與D1、D2組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

此外，對各組組內(nèi)的不同時(shí)間點(diǎn)采用配對樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：A 組0 h 與12、24 h，12 h 與24 h，24 h 與48、72 h，48 h 與72 h；B 組0 h 與12、24、48 h，12 h 與24、48、72 h，24 h 與48、72 h，48 h 與72 h；C1 組0 h 與12、24、48 h，12 h 與24 h；C2 組0 h 與12、24、48、72 h，12 h 與24、48 h，24 h 與72 h，48 h 與72 h；D1 組0 h 與24、72 h，24 h 與72 h；D2 組0 h 與12、24、48、72 h，12 h 與24、72 h，24 h與72 h 間的OPG 蛋白濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

各組RANKL 的蛋白濃度表達(dá)如表4 所示，經(jīng)組間兩兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)可知，12 h 后組間比較，A 組與B、C1、C2組和B 組與D1、D2組的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。針對各組組內(nèi)的不同時(shí)點(diǎn)采用配對樣本t檢驗(yàn)可知，A、B、C1、D2 組不同時(shí)間點(diǎn)RANKL蛋白濃度差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C2 組0 h 與24、48、72 h，12 h 與24、48、72 h，24 h 與48、72 h，48 h 與72 h；D1組0 h 與12、24、48、72 h，12 h 與24、48、72 h，24 h 與48、72 h 間比較，RANKL 蛋白濃度的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 ELISA 檢測各組 RANKL 蛋白濃度表達(dá)Tab 4 The expression of RANKL protein was detected by ELISApg/mL

各組的OPG/RANKL 蛋白濃度比值如表5 所示，經(jīng)組間兩兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)可知，12 h 后組間比較，A 組與B、C1、C2組和B 組與D1、D2組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

對各組組內(nèi)的不同時(shí)點(diǎn)采用配對樣本t檢驗(yàn)，其中A、B、D2組組內(nèi)各時(shí)點(diǎn)間OPG/RANKL蛋白濃度比值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。C1 組0 h 與24、48、72 h，12 h 與24、48、72 h，24 h與48、72 h；48 h 與72 h；C2 組0 h 與24、48、72 h，12 h 與24、48、72 h，24 h 與48、72 h 間OPG/RANKL 比值的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。D1 組0 h 與12、24、48、72 h，12 h 與24、48、72 h，24 h 與48、72 h，48 h 與72 h 間OPG/RANKL比值的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

在正畸牙移動(dòng)的過程中，位于牙根與牙槽骨之間的牙周膜將加載在牙齒上的力傳遞至牙槽骨上，而接收到這一力學(xué)信號的牙周組織會(huì)發(fā)生一系列的重塑和改建，表現(xiàn)為與牽引力方向相同的受壓一側(cè)的牙槽骨發(fā)生吸收，與牽引力方向相反受牽張的一側(cè)出現(xiàn)骨質(zhì)新生。這是正畸治療過程中的生理學(xué)基礎(chǔ)。牙周膜細(xì)胞作為牙周膜的主要效應(yīng)細(xì)胞，具有向各種細(xì)胞分化的潛能，在受到外力刺激時(shí)會(huì)分泌多種細(xì)胞因子參與骨改建的調(diào)控，這是組織重塑與改建的生物學(xué)基礎(chǔ)。

OPG/RANKL/RANK 系統(tǒng)在骨改建的過程中發(fā)揮重要作用，參與調(diào)控破骨細(xì)胞的形成、分化和成熟。RANKL和OPG主要由成骨細(xì)胞譜系中的細(xì)胞產(chǎn)生。對破骨細(xì)胞的生成分化起抑制作用。RANK 位于破骨細(xì)胞前體的細(xì)胞膜上，在破骨細(xì)胞的形成中發(fā)揮重要作用。RANKL 通過與破骨細(xì)胞前體上的同源受體RANK 結(jié)合，觸發(fā)破骨細(xì)胞前體分化為多核破骨細(xì)胞，從而導(dǎo)致骨吸收。這種相互作用可被RANKL 的誘餌受體OPG 所阻斷，OPG 通過競爭性結(jié)合RANKL 從而阻止RANKL 與其受體RANK 結(jié)合來調(diào)節(jié)過度的骨吸收[4,9-11]。因此，OPG與RANKL的比例關(guān)系對于正常骨改建的維持具有重要意義。該比值減小時(shí)提示破骨細(xì)胞分化增多，骨吸收活躍。該比值增大時(shí)，破骨細(xì)胞的分化減少，骨吸收反應(yīng)被抑制，故OPG/RANKL 的比值是評估正畸治療過程中骨吸收的客觀指標(biāo)之一。

糖尿病作為常見的代謝性疾病，以血液中出現(xiàn)的較高水平的血糖濃度為其主要特征，這種異常的高血糖狀態(tài)會(huì)干擾正常的機(jī)體代謝，如引起糖、脂肪和蛋白質(zhì)等的代謝紊亂，另一方面會(huì)影響心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、腎、眼等器官的功能障礙。對于口腔的影響主要表現(xiàn)為對牙周組織炎癥反應(yīng)的促進(jìn)作用。糖尿病患者血糖水平的升高會(huì)干擾微循環(huán)系統(tǒng)正常運(yùn)行，影響正常血液循環(huán)，造成組織缺氧，且會(huì)加強(qiáng)血小板的黏附和聚集，降低抗凝因子水平，紅細(xì)胞脆性的增加會(huì)進(jìn)一步引起組織缺氧，損害血管內(nèi)皮，為細(xì)菌及其毒素的入侵創(chuàng)造了條件[12-14]。相關(guān)的研究[15]證實(shí)，糖尿病與牙周炎之間存在雙向促進(jìn)關(guān)系。高水平的血糖環(huán)境會(huì)造成晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced gly‐cation end product，AGE）的增加，AGE 通過與其多配體受體（receptor for advanced glycation end product，RAGE）結(jié)合，激活A(yù)GE/RAGE 通路引發(fā)免疫應(yīng)答，使得IL-6、TNF-α等大量炎癥因子釋放，從而引發(fā)或加重牙周組織的炎癥反應(yīng)。在眾多的炎癥因子中，IL-6 及TNF-α 在介導(dǎo)牙周炎癥的過程中發(fā)揮重要作用[16-18]，對牙周炎的評估具有較強(qiáng)的敏感性及特異性。以往的研究[19]發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者牙周組織IL-6 及TNF-α 的表達(dá)顯著升高。IL-6 是由免疫細(xì)胞分化形成的一種多功能的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的骨吸收反應(yīng)。在炎癥性牙周組織中IL-6 水平顯著升高。Irwin 等[20]的研究顯示，IL-6與牙周組織的破壞密切相關(guān)。Yakovlev等[21]對青少年人群的牙周炎進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在其齦溝液中也檢測到了IL-6 水平的升高。TNF-α 是破骨細(xì)胞激活因子，可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化, 在低濃度條件下即可明顯增強(qiáng)破骨細(xì)胞形成[22-23]。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，TNF-α 可能會(huì)抑制OPG 合成，進(jìn)而導(dǎo)致骨量減少。Takeichi 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在慢性根尖周炎的根尖周病變中檢測到TNF-α，TNF-α 會(huì)刺激炎癥和骨吸收的發(fā)生。Gaspersic 等[23]認(rèn)為，TNF-α 對大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎的進(jìn)展有促進(jìn)作用。Lee 等[24]報(bào)道TNF-α 在牙周炎的齦溝液中增加，促進(jìn)牙槽骨吸收。因此本研究選取IL-6、TNF-α 及OPG、RANKL 這4 個(gè)細(xì)胞因子作為檢測指標(biāo)對骨改建水平進(jìn)行評估。

LLL 又稱低強(qiáng)度激光或弱激光等，通常其輸出功率小于250 mw，常用的波長范圍為600~950 nm[25]，常見的He-Ne激光、半導(dǎo)體激光都屬于此類。利用半導(dǎo)體作為增益介質(zhì)的激光器稱為半導(dǎo)體激光，鋁、鎵、砷、銦化物等是常見的半導(dǎo)體激光介質(zhì)，不同的介質(zhì)也決定了激光的波長，常見范圍在800~980 nm。本實(shí)驗(yàn)中所用激光為半導(dǎo)體激光，其良好的組織穿透性和熱效應(yīng)使其在臨床中獲得了廣泛的應(yīng)用，半導(dǎo)體激光能被內(nèi)源性發(fā)色團(tuán)如血紅蛋白和黑色素吸收，它對血紅蛋白的吸收率最高，在有血液存在的情況下表現(xiàn)最好，且體積小巧，操作便捷，故為當(dāng)前在牙周組織疾病尤其是牙周炎的治療中應(yīng)用最廣泛的一種LLL 療法[26]，其中本研究所應(yīng)用的810 nm 的鎵鋁砷激光器和980 nm 的銦鎵砷化激光器為半導(dǎo)體家族中應(yīng)用最廣泛的2種。

LLL 已經(jīng)過一系列的體內(nèi)和體外的研究證實(shí)有緩解牙周組織炎癥的作用，為探究LLL 能否通過減少糖尿病患者的牙周組織炎癥反應(yīng)，降低相關(guān)炎性因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制其對OPG/RANKL/RANK 信號通路的不良影響導(dǎo)致的骨代謝異常。本研究通過體外培養(yǎng)HPDLC，在體外持續(xù)靜壓力模型上模擬臨床正畸治療過程中壓力側(cè)的HPDLC受力情況，在加力前給予LLL 干預(yù)，探究在高糖環(huán)境下LLL對受壓力刺激HPDLC 的IL-6、TNF-α、OPG、RANKL 表達(dá)的影響，以期探討在臨床中是否可以應(yīng)用LLL 對糖尿病正畸患者治療過程中的炎癥反應(yīng)和骨改建進(jìn)行調(diào)控。

本研究采用組織塊法體外培養(yǎng)HPDLC，選擇傳代第4代的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞加力裝置沿用了本課題組之前的持續(xù)靜壓力加載模型，此種方法的壓強(qiáng)值只受玻片自身厚度及密度的影響，故操作過程中易于控制所加載力值的大小，壓力持續(xù)加載，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中可避免對細(xì)胞生長環(huán)境的改變，且板底細(xì)胞受力均勻。由于玻片自身透明，所以整個(gè)操作過程中，可隨時(shí)在鏡下觀察細(xì)胞的狀態(tài)，亦不會(huì)影響到細(xì)胞正常生長狀態(tài)下的溫度及濕度，操作簡便，可以模擬臨床中正畸加力后壓力側(cè)牙周組織的受壓狀況。黃生高等[7]和張建興等[27]采用四唑鹽比色（methyl thiazo‐lyl tetrazolium，MTT）法進(jìn)行檢測了壓力對于細(xì)胞的毒性損傷及增值率的影響，對比壓力培養(yǎng)組與對照組之間的吸光度值（optical density，OD），發(fā)現(xiàn)只有4 g/cm2的較大應(yīng)力組會(huì)對細(xì)胞毒性產(chǎn)生影響，其余組細(xì)胞損傷均在可接受范圍內(nèi)，可以得知玻片產(chǎn)生的壓力對于細(xì)胞生長并未產(chǎn)生明顯損傷。本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的持續(xù)靜壓力值為2 g/cm2，研究認(rèn)為此時(shí)壓力側(cè)的骨改建最為活躍，細(xì)胞狀態(tài)較佳。較小的力值不利于相關(guān)因子的充分表達(dá)，過大的壓力反而會(huì)使相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)水平下降，這可能是由于過大的應(yīng)力超過了細(xì)胞所能承受的力值范圍，會(huì)干擾細(xì)胞的正常生理功能。也再次印證了正畸臨床過程中，過大的應(yīng)力加載不僅不會(huì)加快牙齒的移動(dòng)，反而使牙齒的移動(dòng)發(fā)生停滯。這提示臨床醫(yī)生在接診患有糖尿病的正畸患者時(shí)，應(yīng)重視治療過程中的施力方式，避免因正畸矯治力過大而引起牙槽骨的異常吸收、牙齒松動(dòng)甚至脫落，所以本研究最終設(shè)定的持續(xù)靜壓力值為2 g/cm2。

關(guān)于LLL 治療的參數(shù)設(shè)定，國內(nèi)外學(xué)者做過大量的研究[28-30]，認(rèn)為波長在600~950 nm 的波長范圍內(nèi)，激光能發(fā)揮較好的生物刺激作用，激光的透射量接近最大值，此外，紅外輻射在血紅蛋白和水中的吸收系數(shù)較低，在組織中的穿透深度較高[31]，本實(shí)驗(yàn)所用的pilot 砷化鎵鋁半導(dǎo)體激光（810 nm）即在此波長范圍內(nèi)。對于LLL 治療效應(yīng)影響較大的另一重要參數(shù)為能量密度，能量密度較小時(shí)會(huì)產(chǎn)生正向刺激作用，當(dāng)能量密度超過一定范圍，則會(huì)產(chǎn)生抑制作用。Wang 等[5]使用Nd:YAG 激光對炎癥狀態(tài)下的人牙周膜干細(xì)胞（hu‐man periodontal ligament stem cell，HPDLSC） 進(jìn)行照射，結(jié)果顯示8 J/cm2的LLL 可有效調(diào)節(jié)HP‐DLSC 的成骨潛力，4~8 J/cm2的LLL 能促進(jìn)HP‐DLSC中的氧化應(yīng)激水平，降低HPDLSC中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)和活性氧基團(tuán)或分子（reactive oxy‐gen species，ROS）水平；16 J/cm2的LLL 可顯著抑制HPDLC 的增殖和成骨分化，并促進(jìn)炎性細(xì)胞因子和ROS水平。Rigi-Ladez等[32]用波長為810 nm和940 nm 的二極管激光器對牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行照射后發(fā)現(xiàn)，2 種波長的LLL 均在2.5 J/cm2組時(shí)細(xì)胞有顯著增殖。后續(xù)的學(xué)者[6]研究發(fā)現(xiàn)，LLL 治療的理想能量密度值為2~12 J/cm2，能量密度計(jì)算公式：（功率×?xí)r間）/光斑面積，通過公式可知，由于6孔板底面積是確定的，所以只能通過改變照射時(shí)長來調(diào)整能量密度值?？紤]到在實(shí)際操作過程中6孔板底面積及接受LLL照射時(shí)長等因素，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定2 個(gè)能量密度值分別為3.75、5.625 J/cm2，以探究不同能量密度值對骨改建的影響是否存在差異。

根據(jù)本課題組以往的研究[8]發(fā)現(xiàn)，HPDLC 在正常培養(yǎng)條件下僅有少量的OPG、RANKL 表達(dá)分泌，而較低濃度的因子表達(dá)不足以引起骨改建反應(yīng)的發(fā)生，故本研究未設(shè)定空白對照組。以往的文獻(xiàn)[2]報(bào)道，高糖環(huán)境及壓力刺激會(huì)促進(jìn)HPDLC炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給予HPDLC 持續(xù)靜壓力刺激后，IL-6、TNF-α 濃度隨時(shí)間逐漸上升，與低糖環(huán)境組相比高糖環(huán)境組中，IL-6、TNF-α 增長的趨勢更加明顯，在24 h 前增幅較大，24 h 后緩慢增長。高水平表達(dá)的IL-6、TNF-α 會(huì)進(jìn)一步刺激OPG 的下降和RANKL 的上升，與此同時(shí)，同時(shí)點(diǎn)OPG/RANKL 的比值較正常組明顯降低，這表明高糖環(huán)境會(huì)促進(jìn)壓力側(cè)骨吸收。有學(xué)者[33]曾進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，建立大鼠牙移動(dòng)的模型，最終通過顯微CT 對牙移動(dòng)后壓力側(cè)的牙周組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，在對被移動(dòng)牙進(jìn)行施力的過程中，OPG、RANKL 均呈現(xiàn)增加趨勢，且二者均表現(xiàn)為受壓早期增加，后期出現(xiàn)降低，相較之下RANKL 對這種刺激的反應(yīng)出現(xiàn)更早，即RANKL 的表達(dá)峰值先于OPG。另外的研究[34]則發(fā)現(xiàn)，在給予HPDLC 壓力刺激后，OPG 的表達(dá)出現(xiàn)下降，RANKL 的表達(dá)升高。劉長庚等[35]對在不同時(shí)段正畸力作用下的HPDLC 進(jìn)行提取和培養(yǎng)，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）對壓力區(qū)的OPG 進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，在牙移動(dòng)的最初，幾乎不能檢測到OPG，牙移動(dòng)3 個(gè)月時(shí)OPG 表達(dá)達(dá)到高峰，牙移動(dòng)結(jié)束時(shí)該因子又出現(xiàn)下降，這表明OPG 在牙齒移動(dòng)過程不同階段的表達(dá)，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)，OPG 蛋白濃度以24 h 為界，24 h 之前OPG 呈現(xiàn)上升趨勢，24 h 后OPG 的濃度隨時(shí)間逐漸下降。RANKL 的蛋白濃度在0~72 h 之間隨時(shí)間逐漸上升，且在12 h后增幅明顯。OPG/RANKL的比值隨時(shí)間呈下降趨勢，可見在以往的研究中關(guān)于壓力刺激下HPDLC 分泌OPG 的變化并未有明確的規(guī)律。相較于OPG 的表達(dá)，OPG/RANKL 的表達(dá)可能更具有客觀性，更能表達(dá)牙周組織改建的狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給予實(shí)驗(yàn)組LLL 干預(yù)后，會(huì)降低炎癥因子IL-6、TNF-α 的表達(dá)，并上調(diào)OPG，下調(diào)RANKL 的表達(dá)，以對抗高糖環(huán)境產(chǎn)生的影響，從而使OPG/RANKL 的比值趨近于正常對照組，表明LLL 可拮抗高糖環(huán)境引起的炎癥因子水平升高以及OPG/RANKL 的比值下降。實(shí)驗(yàn)中還觀察到，在3.75~5.625 J/cm2這一能量密度范圍內(nèi)，隨LLL 劑量的增大，其產(chǎn)生的調(diào)控作用增強(qiáng)，表明在一定能量密度范圍內(nèi)，LLL 的作用發(fā)揮隨劑量增加而增強(qiáng)，由此可以得出相關(guān)的細(xì)胞學(xué)結(jié)論，即LLL 具有降低高糖環(huán)境中受壓力刺激的HPDLC炎癥因子IL-6、TNF-α分泌水平的作用，并可參與對骨改建相關(guān)因子OPG與RANKL的調(diào)控。

盡管有相當(dāng)多的體外實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)和臨床對照實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其有效性，但在臨床應(yīng)用LLL 的過程中還存在很多爭議，主要原因是目前針對LLL 發(fā)揮效應(yīng)的真正機(jī)制尚未完全清楚還有待進(jìn)一步的研究。不同的參數(shù)設(shè)定會(huì)影響LLL 效應(yīng)的發(fā)揮，例如波長、功率、能量密度、照射時(shí)間、頻次及相關(guān)劑量等，同時(shí)實(shí)驗(yàn)對象和操作方法的差異也會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。與此同時(shí)，不同的實(shí)驗(yàn)對象和操作方法也需要對激光的波長進(jìn)行進(jìn)一步相應(yīng)的探索，這是本實(shí)驗(yàn)需要下一步需要探索的目標(biāo)。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了LLL 對于高糖環(huán)境下受靜壓力刺激的HPDLC 的炎癥因子及相關(guān)的骨改建因子有調(diào)控作用，由此可以推測，在臨床中，可以嘗試應(yīng)用LLL 來減輕糖尿病患者正畸治療過程中牙周組織的炎癥反應(yīng)進(jìn)而調(diào)節(jié)骨代謝失衡。為LLL 應(yīng)用于糖尿病患者的正畸治療提供理論依據(jù)及臨床指導(dǎo)。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面本研究尚存在一定的不足，在對LLL 療法的參數(shù)設(shè)定時(shí)沒有探究更大范圍的能量密度值對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響。所以能夠根據(jù)治療需要制定出標(biāo)準(zhǔn)化、統(tǒng)一化、規(guī)范化的參數(shù)，對于LLL療法在臨床中的應(yīng)用具有重要意義，也需要進(jìn)一步探索。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。