促紅細胞生成素基因修飾的人臍帶間充質(zhì)干細胞對神經(jīng)元周期和凋亡的調(diào)控作用及機制

班躍耀，孫 蕾，馬保東，靳冉冉，李瑞博，孔 寧，張 輝

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院研究生院,河南 新鄉(xiāng) 453003;2.鄭州市中心醫(yī)院神經(jīng)外科,河南 鄭州 450007;3.鄭州大學,河南 鄭州 450007)

缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是由各種因素引起腦缺氧或缺血導致的腦損傷,在兒童中較多見。HIE在成人中主要是由于呼吸驟停、心臟驟停、休克、中毒、抽搐等原因引起的神經(jīng)系統(tǒng)缺血和缺氧導致的腦損傷[1-2]。HIE病理性損傷最主要的特征是神經(jīng)元凋亡,控制神經(jīng)元凋亡可以改善腦損傷。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是非免疫原性干細胞,易增殖,具有分化成包括神經(jīng)元在內(nèi)的多種類型細胞的獨特能力;而且MSCs來源廣泛,不存在倫理問題,可穿過血腦屏障(blood brain barrier,BBB),因此,MSCs在腦損傷的治療中具有重要的臨床意義[3-4]。研究證明,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是在缺血缺氧條件下增強BBB通透性的關鍵因子之一[5];在某些情況下,VEGF與細胞凋亡、促炎細胞因子水平、星形細胞增多癥和小膠質(zhì)細胞活化減少有關[6]。促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)具有神經(jīng)保護和神經(jīng)再生作用,對于正常的神經(jīng)發(fā)育和損傷修復至關重要[7-9]。 基于此,本研究觀察過表達EPO基因的MSCs對缺氧缺血神經(jīng)元SH-SY5Y細胞系細胞周期、凋亡的影響,探討MSCs對HIE的保護作用及機制,以期為臨床HIE的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑與儀器

人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)由河南省人民醫(yī)院科教大廈實驗室提供,SH-SY5Y細胞系購自武漢普諾賽生命科技有限公司,過表達EPO慢病毒載體、對照病毒感染空載體及慢病毒溶液助轉(zhuǎn)劑購自上海吉凱基因科技有限公司,胰蛋白酶購自北京雷根生物技術有限公司,EPO一抗和二抗購自英國Abcam公司,酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;細胞培養(yǎng)箱購自力新儀器(上海)有限公司,倒置顯微鏡、熒光顯微鏡購自德國Carl Zeiss 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

hUC-MSCs培養(yǎng):取裝有hUC-MSCs的冷凍管,立即置于37 ℃水槽中快速解凍,按5×109L-1接種到T75培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),間隔3～4 d換液并觀察貼壁細胞生長情況,待細胞達到70%～80%融合時進行傳代培養(yǎng);去除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,使用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)清洗細胞1～2次,滴加2.5 g· L-1胰蛋白酶消化液2 mL,輕微轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶,使消化液覆蓋整個培養(yǎng)瓶底,去除多余胰蛋白酶消化液,在37 ℃溫浴1～2 min;倒置顯微鏡下觀察細胞回縮變圓后,加入10 mL完全培養(yǎng)基終止消化;用吸管輕輕吹打混勻,按12或13適當?shù)谋壤M行接種傳代,補充新鮮完全培養(yǎng)基至10 mL,置于 37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);待細胞完全貼壁后,每隔2～3 d更換新鮮的完全培養(yǎng)基,取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

SH-SY5Y細胞系培養(yǎng):取裝有SH-SY5Y細胞系的冷凍管,立即置于37 ℃水槽中快速解凍,按5×109L-1濃度接種到T75培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),間隔3～4 d換液并觀察貼壁細胞生長情況,待細胞達到70%～80%融合時進行傳代培養(yǎng);先盡量吸干凈T75瓶專用培養(yǎng)基,再加3～4 mL 常溫PBS輕輕潤洗細胞10～20 s,滴加1 mL胰蛋白酶,輕輕晃動培養(yǎng)瓶使胰蛋白酶均勻鋪在瓶底細胞層,將培養(yǎng)瓶置于37 ℃培養(yǎng)箱中消化細胞,專用培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化;混勻細胞,按 13比例進行接種傳代,補充專用完全培養(yǎng)基至10 mL,置于37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);待細胞完全貼壁后,每隔2～3 d更換新鮮的專用培養(yǎng)基,取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 過表達EPO的MSCs構(gòu)建

取對數(shù)生長期hUC-MSCs接種于6孔板上,待細胞穩(wěn)定生長至融合度達30%時,加入過表達EPO慢病毒載體、對照病毒感染空載體(11 000),混勻后繼續(xù)培養(yǎng)3 d;應用2 mg·L-1嘌呤霉素進行抗生素抗性篩選,待觀察到貼壁細胞發(fā)出熒光即為病毒感染成功;換液除去懸浮死細胞,繼續(xù)培養(yǎng),待細胞融合度達80%～90%時消化細胞;應用流式細胞儀分選熒光強度較強的細胞并收集,將收集的細胞置入T75培養(yǎng)瓶擴大培養(yǎng),其中攜帶EPO基因的MSCs定義為EPO-MSCs,攜帶空載慢病毒的MSCs定義為NC-MSCs,置于液氮中凍存,用于后續(xù)實驗。

1.2.3 Western blot檢測MSCs組、EPO-MSCs組及NC-MSCs組細胞中EPO蛋白表達

取hUC-MSCs組、EPO-MSCs組及NC-MSCs組細胞,使用放射免疫沉淀裂解緩沖液裂解hUC-MSCs、EPO-MSCs及NC-MSCs,提取總蛋白;然后,使用加熱塊在100 ℃下變性,使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質(zhì),電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上;用脫脂牛奶封閉,滴加EPO一抗(滴度為 15 000),4 ℃下孵育過夜;滴加山羊抗兔IgG二抗(滴度為 15 000)孵育;然后,使用增強電化學發(fā)光試劑顯影,應用 Image J軟件分析灰度值,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參,EPO蛋白的相對表達量以EPO灰度值與GAPDH灰度值的比值表示。實驗重復3次,取均值。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測hUC-MSCs組、EPO-MSCs組及NC-MSCs組細胞中EPO mRNA表達

取hUC-MSCs組、EPO-MSCs組及NC-MSCs組細胞,使用細胞總 RNA 提取試劑盒提取總 RNA,并使用 Prime Script 反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa D6210S) 將總 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。設計熒光定量 PCR EPO引物:上游引物序列為5′-GCTGCATGTGGATAAAGCCG-3′,下游引物序列為5′-AGACTCGGAAGAGTTTGCGG-3′,以β-actin為內(nèi)參。每個反應設3個平行管,總反應體系為10 μL,包含F(xiàn)aststart Universal SYBR green master mix 5.0 μL,上、下游引物各0.5 μL,反轉(zhuǎn)錄反應產(chǎn)物模板1.0 μL,滅菌水3.0 μL。反應條件:94 ℃預變性10 min,94 ℃ 變性15 s, 60 ℃退火1 min,共40 個循環(huán);72 ℃終末延伸 50 s;應用2-△△Ct法計算EPO mRNA相對表達量。實驗重復3次,取均值。

1.2.5 ELISA 法檢測hUC-MSCs、EPO-MSCs及NC-MSCs上清液中 EPO 蛋白表達

將hUC-MSCs、EPO-MSCs及NC-MSCs接種至含不完全培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),培養(yǎng)24 h后用移液槍吸取上清液;分別將100 μL標準品及待測上清液加入酶標板中,37 ℃孵育2 h,用洗滌液充分洗滌板,用濾紙吸干板中的殘余液體;然后,每孔分別加入 100 μL的EPO一抗,輕輕混勻,室溫孵育1 h,洗滌液充分洗滌3次;再于每孔中加入 100 μL的酶標二抗,混勻,室溫孵育1 h,洗滌液充分洗滌3次;然后,每孔加入100 μL的底物液,輕輕混勻,室內(nèi)溫度避光孵育 30 min;每孔加入50 μL終止液,用酶標儀在450 nm 波長處測定吸光度值。按照說明書的濃度梯度稀釋標準品,制備標準曲線,根據(jù)標準曲線計算EPO蛋白水平。實驗重復3次,取均值。

1.2.6 缺氧缺血性神經(jīng)元細胞制備

將SH-SY5Y細胞和MSCs接種至Transwell細胞培養(yǎng)板中,置于37 ℃、含體積分數(shù)5%O2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)。取相同數(shù)量SH-SY5Y細胞分為常氧組和缺氧缺血組;將常氧組細胞于37 ℃、含體積分數(shù)5%O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),即為常氧SH-SY5Y細胞;將缺氧缺血組SH-SY5Y細胞接種在下部隔室中,置于含體積分數(shù)0.5%O2三氣體培養(yǎng)箱中24 h造成細胞缺血缺氧,即缺氧缺血SH-SY5Y細胞。

1.2.7 MSCs、NC-MSCs、EPO-MSCs與缺血缺氧SH-SY5Y細胞共培養(yǎng)

從仿真結(jié)果可以看出，本文方法能夠保證在較高精確性的前提下，較好地解決局部噪聲斑塊的解纏問題.與傳統(tǒng)最小二乘迭代法的解纏效果相比，經(jīng)掩膜濾波和質(zhì)量圖法重新定義權值的四向加權最小二乘迭代法效果更好，填充速度更快，減少了一半的迭代次數(shù)，且解纏結(jié)果也較好.

取缺氧缺血SH-SY5Y細胞接種至細胞共培養(yǎng)皿中,隨機分為MSCs共培養(yǎng)組、NC-MSCs共培養(yǎng)組、EPO-MSCs共培養(yǎng)組;將MSCs、NC-MSCs、EPO-MSCs 分別接種至共培養(yǎng)皿跨孔膜插入物上,置于含體積分數(shù)0.5%O2三氣體培養(yǎng)箱中孵育24 h。

1.2.8 流式細胞術檢測缺氧缺血SH-SY5Y細胞及共培養(yǎng)細胞周期

取SH-SY5Y細胞、缺氧缺血SH-SY5Y細胞、MSCs共培養(yǎng)組細胞、NC-MSCs共培養(yǎng)組細胞、EPO-MSCs共培養(yǎng)細胞,用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化,PBS洗滌1次,室溫下1 500 r·min-1離心10 min,棄去上清液;使用400 μL PBS溶液將細胞吹打后轉(zhuǎn)移至10 mL體積分數(shù) 70%冰冷乙醇中,過夜固定;然后,加入等量PBS溶液稀釋,1 600 r·min-1離心10 min,棄上清;再加入200 μL PBS稀釋后轉(zhuǎn)移至流式管中,2 000 r·min-1離心10 min,棄上清;加入 500 μL碘化丙啶(propidium iodide,PI)溶液,5 min 后100目濾網(wǎng)過濾,使用流式細胞儀檢測細胞周期。實驗重復3次,取均值。

1.2.9 流式細胞術檢測缺氧缺血SH-SY5Y細胞及共培養(yǎng)細胞情況

取SH-SY5Y細胞、缺氧缺血SH-SY5Y細胞、MSCs 共培養(yǎng)組細胞、NC-MSCs共培養(yǎng)組細胞、EPO-MSCs 共培養(yǎng)組細胞各約5×106個,分別加入500 μL PBS洗滌,3 000 r·min-1離心 10 min,棄上清;用1 mL Annexin V Binding Buffer溶液重懸浮;然后,滴加5 μL FITC-Annexin溶液、10 μL PI溶液染色,室溫下避光靜置15 min,使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。實驗重復3次,取均值。

1.2.10 RNA-Seq分析轉(zhuǎn)錄組學水平上差異基因表達

選取缺氧缺血SH-SY5Y細胞作為B組,與NC-MSCs、EPO-MSCs分別共培養(yǎng)48 h后的缺氧缺血SH-SY5Y細胞為C組(缺氧缺血SH-SY5Y+NC-MSCs組)和T組(缺氧缺血SH-SY5Y+EPO-MSCs組);使用三唑試劑提取3組細胞總RNA,并在轉(zhuǎn)錄后行RNA-Seq分析?；虮磉_量由每百萬個片段映射的每千基轉(zhuǎn)錄本片段數(shù)(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments,FPKM)計算。log2(折疊變化)>1和Q<0.001的基因被認為是差異表達基因(differential gene,DEG)。基于DEG進行火山圖、維恩圖、基因C光澤和富集京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 EPO-MSCs和NC-MSCs的轉(zhuǎn)染效率

A:EPO-MSCs白光下的細胞形態(tài);B:EPO-MSCs藍光下綠色熒光細胞形態(tài);C:NC-MSCs白光下的細胞形態(tài);D:NC-MSCs藍光下綠色熒光細胞形態(tài)。

A:EPO-MSCs慢病毒感染效率;B:NC-MSCs慢病毒感染效率。

2.2 MSCs 組、NC-MSCs組和EPO-MSCs組細胞中EPO蛋白及mRNA相對表達量比較

MSCs組、NC-MSCs組和EPO-MSCs組細胞中EPO蛋白相對表達量分別為 177 543.00±10 026.09、156 848.67±11 020.44、224 622.33±1 124.30,EPO mRNA相對表達量分別為 1.17±0.00、0.49±0.00、46.25±0.00 ;3組間EPO蛋白和mRNA相對表達量比較差異有統(tǒng)計學意義(F=31.40、968.69,P<0.05);EPO-MSCs組細胞中EPO蛋白和mRNA相對表達量顯著高于MSCs組和NC-MSCs組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); MSCs組與NC-MSCs組中EPO蛋白和mRNA相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)果見圖3。

1:MSCs組;2:NC-MSCs組;3:EPO-MSCs組。

2.3 MSCs組、NC-MSCs組和EPO-MSCs組細胞上清液中EPO蛋白表達水平比較

MSCs組、NC-MSCs組和EPO-MSCs組細胞上清液中EPO蛋白表達水平分別為0.19±0.00、0.23±0.00、3.23±0.00。3組細胞上清液中EPO蛋白表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義(F=2 219.69,P<0.05);EPO-MSCs組細胞上清液中EPO蛋白表達水平顯著高于MSCs組和NC-MSCs組,差異有統(tǒng)計意義(P<0.05);MSCs組與NC-MSCs組細胞上清液中EPO表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4 常氧組、缺氧缺血組、MSCs共培養(yǎng)組、NC-MSCs共培養(yǎng)組及EPO-MSCs共培養(yǎng)組SH-SY5Y細胞凋亡率比較

常氧組和缺氧缺血組SH-SY5Y細胞凋亡率分別為(0.73±0.12)%、(40.76±1.50)%;缺氧缺血組SH-SY5Y細胞凋亡率顯著高于常氧組,差異有統(tǒng)計學意義(t=37.520,P<0.05)。MSCs共培養(yǎng)組、NC-MSCs共培養(yǎng)組和EPO-MSCs共培養(yǎng)組SH-SY5Y細胞凋亡率分別為(28.37±2.30)%、(23.50±1.78)%、(6.40±0.77)%;3組SH-SY5Y細胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學意義(F=88.600,P<0.05);EPO-MSCs共培養(yǎng)組SH-SY5Y細胞凋亡率顯著低于MSCs共培養(yǎng)組和NC-MSCs共培養(yǎng)組,差異有統(tǒng)計學意義(t=12.830、3.810,P<0.05);MSCs共培養(yǎng)組與NC-MSCs共培養(yǎng)組SH-SY5Y細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義(t=2.370,P>0.05)。MSCs共培養(yǎng)組、NC-MSCs共培養(yǎng)組和EPO-MSCs共培養(yǎng)組SH-SY5Y細胞凋亡率顯著低于缺氧缺血組,差異有統(tǒng)計學意義(t=6.395、5.520、28.760,P<0.05)。結(jié)果見圖4。

A:常氧組;B:缺氧缺血組;C:MSCs共培養(yǎng)組;D:NC-MSCs共培養(yǎng)組;E:EPO-MSCs共培養(yǎng)組。

2.5 常氧組、缺氧缺血組、MSCs共培養(yǎng)組、NC-MSCs共培養(yǎng)組及EPO-MSCs共培養(yǎng)組SH-SY5Y細胞周期比較

常氧組和缺氧缺血組G0-G1期SH-SY5Y細胞比例分別為(76.04±2.58)%、(93.97±1.02)%;缺氧缺血組G0-G1期SH-SY5Y細胞比例顯著高于常氧組,差異有統(tǒng)計學意義(t=9.120,P<0.05)。MSCs共培養(yǎng)組、NC-MSCs共培養(yǎng)組和EPO-MSCs共培養(yǎng)組G0-G1期SH-SY5Y細胞比例分別為(85.20±1.34)%、(81.29±1.16)%、(70.25±1.61)%,3組G0-G1期SH-SY5Y細胞比例比較差異有統(tǒng)計學意義(F=88.600,P<0.05);EPO-MSCs共培養(yǎng)組G0-G1期SH-SY5Y細胞比例顯著低于MSCs共培養(yǎng)組和NC-MSCs共培養(yǎng)組,差異有統(tǒng)計學意義(t=10.110、7.880,P<0.05);MSCs共培養(yǎng)組與NC-MSCs共培養(yǎng)組G0-G1期SH-SY5Y細胞比例比較差異無統(tǒng)計學意義(t=3.120,P>0.05)。MSCs共培養(yǎng)組、NC-MSCs共培養(yǎng)組和EPO-MSCs共培養(yǎng)組G0-G1期SH-SY5Y細胞比例顯著低于缺氧缺血組,差異有統(tǒng)計學意義(t=7.360、11.590、17.610,P<0.05)。結(jié)果見圖5。

A:常氧組;B:缺氧缺血組;C:MSCs共培養(yǎng)組;D:NC-MSCs共培養(yǎng)組;E:EPO-MSCs共培養(yǎng)組。

2.6 EPO 過表達對MAPK信號通路的影響

在B組和T組之間共鑒定出4 726個上調(diào)基因和4 405 個下調(diào)基因,共9 131個DEG(圖6A)。在B組和C組之間共發(fā)現(xiàn)4 352個上調(diào)基因和4 809個下調(diào)基因,共9 161個DEG(圖6A)。在所有DEG中,3組均表達的基因有116個(圖6B)?；蚓垲惙治霭l(fā)現(xiàn),相較于B組,T組的基因差異表達更為顯著(圖6C)。KEGG途徑富集結(jié)果顯示,MAPK信號通路和細胞凋亡通路是B組和T組中富集程度最高的通路(圖6D)。RNA-seq鑒定顯示,p53途徑的激活在細胞凋亡的調(diào)節(jié)中起關鍵作用。

A:T組、C組與B組間的DEG火山圖,以 P<0.001 為閾值確定 DEG 的顯著性,黃點表示上調(diào)的 DEG,藍點表示下調(diào)的 DEG,灰點表示2組之間無顯著變化的轉(zhuǎn)錄本;B:T組、C組與B組之間DEG 數(shù);C:基因聚類分析,X 軸表示不同的樣本,而 Y 軸表示DEG,顏色從藍色到紅色表示從低到高的 DEG 表達式強度;D:KEGG途徑富集分析,X軸顯示富集因子,左側(cè) Y 軸顯示前 10 個正 KEGG 通路名稱,顏色越深表示 q 值越小,氣泡大小表示 DEG 數(shù)。

3 討論

HIE是一種由各種因素引起的腦血流量減少導致的腦損傷性病,會遺留各種并發(fā)癥,包括癲癇發(fā)作、意識改變、呼吸困難、肌張力差或代謝異常等急性癥狀以及腦性癱瘓、癲癇、智力障礙、行為障礙等慢性疾病,甚至導致過早死亡,給患者及其家庭帶來極其沉重的負擔。目前,尚無 HIE 臨床治療很有效的方法。因此,研究新型治療HIE的方法、作用機制并盡早應用于臨床中具有重要意義。EPO 主要由腎臟球旁器顆粒細胞產(chǎn)生,但在小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元細胞等細胞表面亦可見到EPO受體大量表達,低氧使EPO/EPO受體明顯上調(diào),作為一種內(nèi)源性神經(jīng)保護機制在緩解缺氧導致腦損傷中發(fā)揮重要作用;但在正常狀態(tài)下,僅1%～2% EPO能通過BBB,故需補充外源性EPO以發(fā)揮腦保護作用。研究表明,通過腦內(nèi)或全身注射EPO可減輕腦損傷[10]。MSCs是非免疫原性干細胞,易于增殖,并具有分化成多種細胞類型的獨特能力[4]。研究報道,MSCs遷移到炎癥部位,可發(fā)揮抗炎作用并減少活性氧[11]。PARK等[12]研究報道,MSCs可減少因缺氧缺血導致的神經(jīng)元凋亡,減輕神經(jīng)元缺氧損傷。成人臨床試驗已經(jīng)證明,MSCs在骨科損傷、心血管疾病、肝臟疾病、自身免疫疾病和移植物抗宿主病中可發(fā)揮再生潛力[13]。但關于基于EPO研究MSCs 在HIE治療中的作用和機制較少。

本研究結(jié)果顯示,EPO-MSCs慢病毒轉(zhuǎn)染效率為98.51%,NC-MSCs慢病毒轉(zhuǎn)染效率為97.83%;EPO-MSCs組細胞中EPO蛋白和mRNA相對表達量顯著高于MSCs和NC-MSCs,MSCs與NC-MSCs中EPO蛋白和mRNA相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義;且EPO-MSCs上清液中EPO蛋白表達水平顯著高于MSCs和NC-MSCs, MSCs與NC-MSCs上清液中EPO表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義。這一結(jié)果說明,過表達MSCs構(gòu)建成功,EPO-MSCs歸巢到受損的神經(jīng)細胞部分時,EPO-MSCs可以大量釋放EPO到細胞外,從而發(fā)揮其免受NMDA 受體介導的谷氨酸毒性,并通過抑制細胞凋亡來發(fā)揮神經(jīng)保護作用[14-16]。

本研究將SH-SY5Y細胞暴露于含體積分數(shù)0.5%O2中24 h造成細胞缺氧缺血,并將缺氧缺血SH-SY5Y細胞與MSCs、NC-MSCs、EPO-MSCs共培養(yǎng),流式細胞術檢測顯示,EPO-MSCs共培養(yǎng)組SH-SY5Y 細胞凋亡率顯著低于MSCs 共培養(yǎng)組和NC-MSCs共培養(yǎng)組, MSCs共培養(yǎng)組與NC-MSCs共培養(yǎng)組SH-SY5Y細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義,MSCs共培養(yǎng)組、NC-MSCs共培養(yǎng)組和EPO-MSCs共培養(yǎng)組SH-SY5Y細胞凋亡率顯著低于缺氧缺血組;EPO-MSCs共培養(yǎng)組G0-G1期SH-SY5Y細胞比例顯著低于MSCs共培養(yǎng)組與NC-MSCs共培養(yǎng)組,MSCs共培養(yǎng)組和NC-MSCs共培養(yǎng)組G0-G1期SH-SY5Y細胞比例比較差異無統(tǒng)計學意義,MSCs共培養(yǎng)組、NC-MSCs共培養(yǎng)組和EPO-MSCs共培養(yǎng)組G0-G1期SH-SY5Y細胞比例顯著低于缺氧缺血組。這說明,EPO-MSCs可顯著抑制缺血缺氧神經(jīng)元凋亡,減少細胞間期阻滯,進而發(fā)揮腦損傷的保護作用。JUUL等[17]研究也發(fā)現(xiàn),內(nèi)源性EPO增加可預防腦組織缺血損傷。此外,本研究對缺氧缺血SH-SY5Y細胞以及與NC-MSCs、EPO-MSCs共培養(yǎng)缺氧缺血SH-SY5Y細胞進行RNA提取和轉(zhuǎn)錄,并行RNA-Seq分析,結(jié)果顯示,MAPK信號通路和細胞凋亡通路是與NC-MSCs共培養(yǎng)缺氧缺血SH-SY5Y細胞、EPO-MSCs共培養(yǎng)缺氧缺血SH-SY5Y細胞中富集程度最高的通路, p53途徑的激活在細胞凋亡的調(diào)節(jié)中起關鍵作用;這說明,EPO介導的MAPK通路對神經(jīng)元有重要影響,可減少氧化應激[18-19];EPO-MSCs可進一步增強MSCs對缺氧誘導的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用,這可能通過MAPK-p53途徑實現(xiàn)。

4 結(jié)論

EPO過表達的MSCs可顯著抑制缺氧缺血神經(jīng)元凋亡,減少細胞間期阻滯,EPO基因修飾可增強MSCs對HIE的保護作用,其 機 制 可 能 與EPO過表達的MSCs激活MAPK-p53信號通路有關,但其具體的調(diào)控機制還需進一步研究;這為EPO基因修飾MSCs應用于臨床HIE的治療提供一定依據(jù)。