苦參堿對食管癌Eca-109細胞自噬的影響及作用機制

侯敏杰，林淑璇，呂 洋

(河北北方學院病理學教研室,河北 張家口 075000)

食管癌是全球第八大最常見的癌癥類型,是導致癌癥死亡的第六大原因[1]。我國的食管癌在華北地區(qū)尤為高發(fā),且食管癌患者的預后仍然較差[2-3]。中藥在放化療治療食管癌過程中起到了顯著的增效減毒作用[4]?？鄥A已被證明具有抗纖維化、抗病毒、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[5-9]。細胞自噬作為一種細胞死亡過程,已被證實與多種人類疾病相關(guān),其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要意義[10]。自噬可以調(diào)節(jié)腫瘤的形成、增殖、轉(zhuǎn)移以及能量代謝等諸多方面[11]。研究發(fā)現(xiàn),苦參堿可以誘導非小細胞肺癌[12]、乳腺癌[13]和髓母細胞瘤[14]等多種腫瘤細胞發(fā)生自噬。但目前關(guān)于苦參堿對食管癌細胞自噬的作用研究較少?；诖?本研究初步探討苦參堿對食管癌自噬的作用及可能的作用機制,以期為苦參堿在臨床食管癌治療中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物、試劑及儀器

Eca-109細胞株購自南京凱基生物科技有限公司;苦參堿(純度≥98%)購自大連美侖生物技術(shù)有限公司;RPMI 1640 培養(yǎng)基購自美國Corning公司,胎牛血清購自德國Cegrogen Biotech公司,胰蛋白酶購自以色列Biological Industries (BioInd) 公司,四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5)-dimethylthahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazolumromide,MTT]購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司,蛋白提取試劑盒購自英文特生物技術(shù)(北京)有限公司,聚氰基丙烯酸正丁脂蛋白定量試劑盒購自河北瑞帕特生物科技有限公司,自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司,兔抗人微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)、Beclin1和多聚蛋白62(polyprotein 62,P62)一抗購自日本MBL公司,兔抗人肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)一抗、磷酸化肝激酶B1(phosphorylated liver kinase B1,p-LKB1)一抗、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)試劑盒購自武漢愛博泰克生物技術(shù)有限公司,兔抗人腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(phosphorylated adenosine monophosphate-actived protein kinase,p-AMPK)一抗購自杭州華安生物技術(shù)有限公司,兔抗人哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR)一抗購自上海帛龍生物科技有限公司,二抗及熒光二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,RNA提取試劑盒購自成都福際生物技術(shù)有限公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司,Beclin1基因引物購自上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司;CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國 Thermo 公司,倒置相差熒光顯微鏡購自日本Nikon公司,AI600超靈敏化學發(fā)光成像儀購自美國 GE 公司,Mastercycler nexus gradient 基因擴增儀購自德國 Eppendorf 公司,PikoReal 五通道實時熒光定量 PCR 儀購自美國 Thermo 公司,透射電子顯微鏡購自日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

Eca-109細胞復蘇后,置于37 ℃、含體積分數(shù)5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞生長至融合度約80%時,去除上清,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌細胞,2.5 g·L-1胰蛋白酶消化細胞后加入含體積分數(shù)10%胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測細胞活性

取傳代培養(yǎng)Eca-109細胞重懸計數(shù),調(diào)整細胞密度為8×107L-1,接種于96孔板中,于細胞生長至融合度約 60%時,吸去上清,將細胞分為對照組、低濃度苦參堿組、中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組。對照組細胞加入100 μL含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,低濃度苦參堿組細胞加入終質(zhì)量濃度為1.0 g·L-1苦參堿溶液,中濃度苦參堿組細胞加入終質(zhì)量濃度為1.5 g·L-1苦參堿溶液,高濃度苦參堿組細胞加入終質(zhì)量濃度為2.0 g·L-1苦參堿溶液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,加入20 μL MTT,避光孵育 4 h 后,吸去上清,每孔加入100 μL二甲基亞砜,溫箱孵育10 min,用酶標儀測490 nm處吸光度(absorbance,A)值,計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=[1-(A藥物處理組-A空白孔)/(A未處理組-A空白孔)]×100%。實驗重復3次,取均值。

1.2.3 免疫熒光細胞化學染色法檢測Eca-109細胞中 LC3 蛋白的定位及表達

取傳代培養(yǎng)Eca-109細胞,重懸計數(shù),調(diào)整細胞密度為1×109L-1,接種于24孔培養(yǎng)板(24孔板中已提前放好無菌小圓片),細胞進行爬片,待細胞生長至融合度約80% 時,吸去上清,分為對照組、低濃度苦參堿組、中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組。對照組細胞加入500 μL含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,低、中、高濃度苦參堿組細胞的干預措施同“1.2.2”項。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用多聚甲醛固定 2 h,棄甲醛,經(jīng)破膜、染色阻斷后,添加兔抗人 LC3 一抗(滴度為11 000),4 ℃ 過夜,避光加入熒光二抗,抗熒光封片,激光共聚焦觀察并保存圖像。

1.2.4 Western blot法檢測Eca-109細胞中P62和LC3蛋白的表達

1.2.5 RT-qPCR法檢測Eca-109細胞中Beclin1 mRNA的表達

1.2.6 透射電子顯微鏡觀察Eca-109細胞的超微結(jié)構(gòu)

1.2.7 Western blot法檢測Eca-109細胞中LC3、Beclin1、LKB1、p-LKB1、AMPK、p-AMPK、mTOR和p-mTOR蛋白的相對表達量

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 對照組、低濃度苦參堿組、中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組Eca-109細胞增殖抑制率比較

對照組、低濃度苦參堿組、中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組細胞增殖抑制率分別為(2.903±0.788)%、(26.540±1.386)%、(30.220±1.357)%、(39.990±1.167)%。低、中、高濃度苦參堿組細胞增殖抑制率顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組細胞增殖抑制率顯著高于低濃度苦參堿組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);高濃度苦參堿組細胞增殖抑制率顯著高于中濃度苦參堿組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 對照組、低濃度苦參堿組、中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組Eca-109細胞中LC3蛋白的定位及表達

對照組、低濃度苦參堿組、中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組Eca-109細胞質(zhì)中均可見到紅色熒光標記的LC3蛋白陽性表達。對照組細胞中LC3蛋白呈彌散狀態(tài);各濃度苦參堿組細胞中LC3蛋白呈斑點狀態(tài),且苦參堿濃度越高,細胞質(zhì)中呈斑點狀LC3蛋白越多。結(jié)果見圖1。

A:對照組;B:低濃度苦參堿組;C:中濃度苦參堿組;D:高濃度苦參堿組。

2.3 對照組、低濃度苦參堿組、中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組Eca-109細胞中P62和LC3蛋白表達比較

低、中、高濃度苦參堿組Eca-109細胞中P62蛋白的相對表達量均顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組Eca-109細胞中P62蛋白的相對表達量顯著低于低濃度苦參堿組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);中濃度苦參堿組與高濃度苦參堿組Eca-109細胞中P62蛋白的相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。低濃度苦參堿組與對照組Eca-109細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組Eca-109細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組Eca-109細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著高于低濃度苦參堿組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);高濃度苦參堿組Eca-109細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著高于中濃度苦參堿組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果見圖2和表1。

表1 對照組、低濃度苦參堿組、中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組Eca-109細胞中P62蛋白表達量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比較

A:對照組;B:低濃度苦參堿組;C:中濃度苦參堿組;

2.4 對照組、低濃度苦參堿組、中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組Eca-109細胞中Beclin1 mRNA表達比較

對照組、低濃度苦參堿組、中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組Eca-109細胞中Beclin1 mRNA的相對表達量分別為1.000±0.000、1.730±0.180、3.230±0.255、8.123±0.890。低、中、高濃度苦參堿組Eca-109細胞中Beclin1 mRNA的相對表達量顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。中濃度苦參堿組和高濃度苦參堿組Eca-109細胞中Beclin1 mRNA相對表達量顯著高于低濃度苦參堿組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);高濃度苦參堿組Eca-109細胞中Beclin1 mRNA的相對表達量顯著高于中濃度苦參堿組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.5 對照組和高濃度苦參堿組 Eca-109細胞的超微結(jié)構(gòu)

對照組細胞中可見正常的細胞質(zhì)、細胞器和細胞核;高濃度苦參堿組細胞質(zhì)中可見大量大小不等的自噬泡,并可見包裹有細胞內(nèi)容物的自噬體,而細胞核未見明顯異常;結(jié)果見圖3。

A:對照組(×3 000);B～D:高濃度苦參堿組(×20 000)

2.6 對照組、自噬抑制劑組、苦參堿組和自噬抑制劑+苦參堿組Eca-109細胞中自噬相關(guān)蛋白及LKB1/AMPK/mTOR 信號通路蛋白相對表達量比較

自噬抑制劑組與對照組Eca-109細胞中Beclin1蛋白的相對表達量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);苦參堿組和自噬抑制劑+苦參堿組Eca-109細胞中Beclin1蛋白的相對表達量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 均顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?？鄥A組和自噬抑制劑+苦參堿組Eca-109細胞中Beclin1蛋白的相對表達量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 均顯著高于自噬抑制劑組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);自噬抑制劑+苦參堿組Eca-109細胞中Beclin1蛋白的相對表達量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 均顯著低于苦參堿組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

自噬抑制劑組Eca-109細胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK顯著低于對照組,p-mTOR/mTOR顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);苦參堿組Eca-109細胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK顯著高于對照組,p-mTOR/mTOR顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);自噬抑制劑+苦參堿組Eca-109細胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);自噬抑制劑+苦參堿組與對照組Eca-109細胞中p-mTOR/mTOR比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)?？鄥A組和自噬抑制劑+苦參堿組Eca-109細胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK顯著高于自噬抑制劑組,p-mTOR/mTOR顯著低于自噬抑制劑組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);自噬抑制劑+苦參堿組Eca-109細胞中p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK顯著低于苦參堿組,p-mTOR/mTOR顯著高于苦參堿組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果見表2和圖4。

表2 對照組、自噬抑制劑組、苦參堿組和自噬抑制劑+苦參堿組Eca-109細胞中自噬相關(guān)蛋白及LKB1/AMPK/mTOR 信號通路蛋白相對表達量比較

A:對照組;B:自噬抑制劑組;C:苦參堿組;D:自噬抑制劑+苦參堿組。

3 討論

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤,其早期手術(shù)治療有較好的臨床效果,但對于進展期患者,單純手術(shù)治療難以取得滿意的臨床效果,且術(shù)后復發(fā)和轉(zhuǎn)移較為多見,因此常輔助以化學治療、免疫治療等綜合治療。長期使用一類藥物進行治療時,除藥物本身會對患者身體造成一定的損害外,腫瘤亦容易產(chǎn)生耐藥性。因此,需要尋找有效且毒副作用較小的新型抗腫瘤藥物,制定個性化方案,以延長患者的遠期生存率,提高患者的生存質(zhì)量。

中醫(yī)藥文化歷史悠久,中草藥因其治療疾病安全有效且毒副作用較小等優(yōu)勢,已被廣泛用于治療各種疾病?？鄥⑹且晃秱鹘y(tǒng)中草藥,屬豆科槐屬植物,其性寒味苦,主要功能是清熱燥濕、利尿?？鄥A是來源于苦參的單體成分,目前關(guān)于苦參堿對食管癌的治療效果罕有報道,其作用機制也不清楚。有研究發(fā)現(xiàn),苦參堿具有阻滯細胞周期、誘導腫瘤細胞發(fā)生自噬和凋亡等作用,體外實驗發(fā)現(xiàn)其對肝癌、結(jié)腸癌有較好的抑制作用[15-17]。

研究顯示,苦參堿對胃癌具有顯著的抗腫瘤活性,而且苦參堿誘導胃癌細胞死亡時凋亡和自噬均被激活[18]。細胞自噬與腫瘤有著密切關(guān)系,在自噬過程中,哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物(mammalian target of rapamycin complex,mTORC)處于整個自噬過程的起點。細胞內(nèi)的信號通路如果可以影響到mTORC的活性,那么就能調(diào)控下游自噬的過程?？鼓[瘤藥物常通過誘導腫瘤細胞凋亡或自噬發(fā)揮治療作用[19]。LIN 等[20]研究發(fā)現(xiàn),苦參堿可抑制肝癌細胞生長、遷移和侵襲,同時促進肝癌細胞凋亡和自噬,進而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn),不同濃度苦參堿組Eca-109細胞中LC3熒光斑點隨濃度升高而增多,提示苦參堿可誘導Eca-109細胞自噬。

AMPK 的激活能磷酸化結(jié)節(jié)性硬化癥復合物,從而促進 mTOR的失活,誘導細胞自噬水平的提高。AMPK 也能直接磷酸化mTOR調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白,抑制 mTOR,上調(diào)細胞自噬。LKB1是AMPK的上游激酶,其可通過形成p-LKB1進而激活AMPK,從而調(diào)節(jié)自噬。有研究表明,細胞在缺氧或者缺乏營養(yǎng)的狀況下,能激活AMPK并顯著增加 AMPK蛋白的表達,抑制mTOR的活性,進而激活自噬相關(guān)蛋白的表達[21]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn) ,Beclin1蛋白表達量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-LKB1/LKB1和p-AMPK/AMPK在苦參堿組細胞中最高,當加入自噬抑制劑后,相關(guān)蛋白的表達量下降;而p-mTOR/mTOR在苦參堿組最低,當加入自噬抑制劑后,p-mTOR/mTOR卻增加。本研究還發(fā)現(xiàn),苦參堿可促進p-LKB1、p-AMPK蛋白的表達,抑制p-mTOR蛋白的表達,進而上調(diào)自噬,這表明苦參堿激活了LKB1/AMPK/mTOR信號通路。以上結(jié)果提示,苦參堿可能是通過調(diào)節(jié)LKB1/AMPK/mTOR通路蛋白的表達誘導食管癌Eca-109細胞發(fā)生自噬的。

4 結(jié)論

苦參堿可以抑制細胞增殖,誘導細胞產(chǎn)生自噬,LKB1/AMPK/mTOR信號通路可能涉及自噬的誘導。本研究為苦參堿治療食管癌提供一定的理論基礎(chǔ),苦參堿可能成為未來臨床輔助治療食管癌的新措施,但苦參堿誘發(fā)自噬的具體機制有待深入探究。