知柏地黃湯抗HSV-2的作用機制

徐婷玉,匡琳,石佳靈,張佳敏,吳揚帆

2型單純皰疹病毒(herpes simplex virus 2,HSV-2)屬于人類皰疹病毒家族中的α皰疹病毒,是具有囊膜的雙鏈DNA病毒［1］。HSV-2是引起生殖器皰疹的主要病原體,主要通過性接觸傳播引起反復(fù)發(fā)作、難以治愈的生殖器感染［2-3］,研究表明感染HSV-2的患者感染人免疫缺陷病毒(HIV)的危險性高于普通人,孕婦感染HSV-2會引起胎兒感染,嚴重者會導(dǎo)致胎兒持久性神經(jīng)損傷以及胎兒死亡［4-6］。由于其反復(fù)發(fā)作以及一系列嚴重的并發(fā)癥,防治單純皰疹病毒感染依然是當今世界最重要的公共健康問題之一。近年來中醫(yī)藥抗病毒治療廣泛應(yīng)用于臨床常見的病毒感染性疾病,中草藥抗HSV-2有一定的優(yōu)勢。本課題組前期在臨床上運用知柏地黃湯治療生殖器皰疹,療效確切,有效的降低了復(fù)發(fā)率［7］。但是知柏地黃湯治療生殖器皰疹的作用機制尚不清楚,相關(guān)實驗研究較少,未能深入研究知柏地黃湯抗HSV-2的作用機制。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法聯(lián)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探討知柏地黃湯抗HSV-2的作用機制,為后續(xù)的深入研究提供方向與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1知柏地黃湯抗HSV-2的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.1.1知柏地黃湯活性成分及作用靶點獲取 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫［8］(https://tcmsp-e.com/tcmsp.php)檢索知柏地黃湯各藥物的活性成分和作用靶點,并設(shè)置篩選標準為口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%及類藥性(drug likeness,DL)≥0.18,利用Uniprot數(shù)據(jù)庫［9］(https://www.uniprot.org/)對獲取的靶點進行基因名校正。

1.1.2知柏地黃湯成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將獲取的知柏地黃湯活性成分及作用靶點導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件［10］,構(gòu)建藥物成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖,利用內(nèi)置插件Cyto Hubba［11］對網(wǎng)絡(luò)圖進行分析。

1.1.3HSV-2相關(guān)靶點獲取 以“herpes simplex virus 2”為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫［12］(https://www.genecards.org/)和OMIM數(shù)據(jù)庫［13］(https://www.omim.org/)中檢索HSV-2相關(guān)靶點,并通過Venny2.1在線平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)獲取藥物成分靶點與疾病靶點的交集靶點。

1.1.4知柏地黃湯抗HSV-2的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將交集靶點上傳至String數(shù)據(jù)庫［14］(https://string-db.org/),獲取PPI網(wǎng)絡(luò)信息,再利用Cytoscape3.9.1軟件對網(wǎng)絡(luò)信息進行可視化,結(jié)合內(nèi)置插件Cyto Hubba分析并篩選核心靶點。

1.1.5交集靶點富集分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫［15］(https://david.ncifcrf.gov/)對交集靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析,以P<0.05為閾值篩選符合條件的結(jié)果,利用微生信在線平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)進行可視化處理。

1.1.6運用分子對接預(yù)測知柏地黃湯有效成分與核心靶點的關(guān)系 通過分子對接技術(shù)將1.1.1中得到的主要有效成分與1.1.4中得到的核心靶點進行相互作用的可靠性驗證。

1.2知柏地黃湯對HSV-2感染神經(jīng)元細胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

1.2.1實驗動物 SPF級SD大鼠20只,雌雄各半,8周齡,體重為(200±20)g,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司［許可證號:SCKX(湘)2019-0004］。所有大鼠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境內(nèi),12 h晝夜明暗交替,溫度22～26 ℃,濕度40%～60%,自由進食及飲水。動物實驗操作通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(批準號:LLBH-202111250002)。

1.2.2實驗藥物及試劑 知柏地黃湯配方顆粒:知母10 g、黃柏10 g、山茱萸15 g、山藥15 g、牡丹皮10 g、澤瀉10 g、茯苓10 g、熟地黃20 g(深圳華潤三九股份有限公司提供)。

DMEM高糖培養(yǎng)基(武漢普諾賽公司,貨號PM150210),BCA蛋白定量試劑盒(武漢伊萊瑞特公司,貨號E-CK-A362),甲酸(美國Thermo Fisher公司,貨號A117),乙腈(德國Merck公司,貨號1000304008)。

1.2.3實驗細胞及病毒株 人神經(jīng)母細胞瘤細胞株(SH-SY5Y),購于武漢普諾賽,貨號為CL-028。HSV-2 333株,購于武漢病毒所,TCID50為4.5,保存于湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合病原生物實驗室。本實驗中所有病毒操作均在BSL-2實驗室中完成。

1.2.4實驗儀器 二級生物安全柜、二氧化碳培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機、EasynLC色譜系統(tǒng)、QExactive HF-X質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher公司),倒置熒光顯微鏡(德國CarelZeiss公司),立式自動壓力蒸汽滅菌器(廈門致微儀器公司)。

1.2.5含藥血清制備 20只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,按照隨機數(shù)字表法分為空白對照組與知柏地黃湯組,每組10只。根據(jù)人與大鼠體表面積換算的等效劑量比值計算出大鼠給藥劑量［16］。知柏地黃湯組予以9 g/(kg·d)的劑量灌胃,空白對照組以等體積的生理鹽水灌胃,2次/d,連續(xù)灌胃7 d。末次灌胃24 h后,用40 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠,腹主動脈采血,室溫靜置2 h后,3 000 r/min,離心15 min收集上層血清,56 ℃滅活30 min,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后分裝保存于-80 ℃冰箱中。

1.2.6構(gòu)建HSV-2感染的SH-SY5Y細胞模型 SH-SY5Y細胞密度達80%以上時,胰酶消化,重懸細胞后接種于6孔板中,設(shè)置正常對照組(BCG組)、病毒模型組(MCG組)和知柏地黃湯組(ZDD組)。首先各組以10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基進行培養(yǎng),待細胞貼壁且密度達70%以上時,MCG組和ZDD組加入100TCID50的病毒液進行干預(yù),CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h后,BCG組與MCG組更換10%空白血清的培養(yǎng)基,ZDD組更換為10%知柏地黃湯含藥血清的培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集相應(yīng)樣本。

1.2.7蛋白質(zhì)組學(xué)研究 取干預(yù)后的SH-SY5Y細胞樣品,加入SDT裂解液,沸水浴15 min。14 000 g離心15 min,取上清液,BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。蛋白樣品經(jīng)丙酮沉淀、重溶、還原、烷基化、酶解、去除SDC及多肽脫鹽處理得到肽段。每份樣品采用納升流速EasynLC色譜系統(tǒng)進行分離,經(jīng)色譜分離后用QExactive HF-X質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用MaxQuant軟件(v1.6.17.0)進行數(shù)據(jù)庫搜索,數(shù)據(jù)庫為uniprot_homo_20221024_20402_9606_swiss_prot,采用LFQ(LabelFree Quantitation)算法進行定量分析。然后利用t檢驗方法計算P鑒定差異蛋白,以表達差異倍數(shù)大于1.5倍且P≤0.05為篩選條件;再通過Fisher精確檢驗進行差異蛋白GO及KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

2.1.1知柏地黃湯活性成分及靶點篩選結(jié)果 以O(shè)B≥30%及DL≥0.18為篩選標準,共獲得126個活性成分,其中知母15個,黃柏37個,熟地黃2個,山藥16個,山茱萸20個,牡丹皮11個,澤瀉10個,茯苓15個。剔除無對應(yīng)靶點信息的活性成分并去重,最終得到69個活性成分。對知柏地黃湯活性成分靶點信息預(yù)測結(jié)果整合去除重復(fù)值后得到213個作用靶點。

2.1.2知柏地黃湯藥物成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 利用Cyto Hubba插件計算各節(jié)點的Degree值,根據(jù)Degree值篩選出排名前10的成分,分別為槲皮素、山奈酚、豆甾醇等,見表1。將得到的藥物活性成分和作用靶點導(dǎo)入Cytoscape3.9.1中,構(gòu)建知柏地黃湯成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖,網(wǎng)絡(luò)中共291個節(jié)點,1 263條邊。

表1 知柏地黃湯Degree值前10的活性成分

2.1.3HSV-2相關(guān)靶點篩選結(jié)果 以“herpes simplex virus 2”為關(guān)鍵詞分別在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫進行檢索,將得到的結(jié)果合并刪除重復(fù)值后,最終獲得HSV-2疾病靶點282個。將其與藥物成分靶點上傳至Venny2.1在線平臺,取交集后共獲得37個交集靶點,韋恩圖見圖1。獲得的交集靶點即為知柏地黃湯抗HSV-2的潛在作用靶點。

圖1 知柏地黃湯與HSV-2靶點韋恩圖

2.1.4知柏地黃湯抗HSV-2的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將37個交集靶點上傳至String數(shù)據(jù)庫,置信度選擇最高置信度0.9,隱藏?zé)o關(guān)靶點,得到PPI網(wǎng)絡(luò)信息。利用Cytoscape3.9.1軟件對導(dǎo)出的tsv文件進行可視化處理,得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖2),結(jié)合Cyto Hubba插件進行分析,根據(jù)Degree值篩選出排名前10的核心靶點,主要有RELA、IL-6、TNF、IL-10等,見圖3,表2。

圖2 知柏地黃湯抗HSV-2潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 知柏地黃湯抗HSV-2核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

表2 知柏地黃湯抗HSV-2核心靶點

2.1.5GO功能分析結(jié)果 通過David數(shù)據(jù)庫對37個交集靶點進行GO基因功能分析,共得到GO功能富集結(jié)果479個,包括399個生物過程,27個細胞組分,53個分子功能,涉及144條KEGG通路。對于GO分析中BP、CC和MF中排名前10的條目繪制富集條形圖(圖4)。在GO富集分析結(jié)果中,知柏地黃湯抗HSV-2的生物過程包括基因表達的正調(diào)節(jié)、細胞凋亡過程、炎癥反應(yīng)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、細胞凋亡過程、DNA模板轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)等;細胞組分中包括細胞外間隙、胞核、胞質(zhì)、胞漿、線粒體外膜等;分子功能主要富集于酶結(jié)合、細胞因子活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、激酶活化、DNA結(jié)合等。

圖4 知柏地黃湯抗HSV-2潛在靶點GO分析

2.1.6KEGG富集通路分析結(jié)果 KEGG富集通路分析共得到144條信號通路,其中主要有IL-17信號通路、Toll受體信號通路、TNF信號通路等通路,根據(jù)P值篩選出前30條通路繪制KEGG富集圖(圖5)。在30條通路中發(fā)現(xiàn)部分與病毒感染有關(guān)的通路,分別為甲型流感、人巨細胞病毒感染、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、丙型肝炎等通路,說明知柏地黃湯可能通過相關(guān)信號通路途徑發(fā)揮抗病毒作用。

圖5 KEGG富集分析柱狀圖

2.1.7知柏地黃湯主要成分與核心靶點的分子對接結(jié)果 選取知柏地黃湯中3個主要有效成分槲皮素、山柰酚、豆甾醇與3個關(guān)鍵靶點IL-10、 IL-6、TNF進行分子對接。結(jié)果表明主要有效成分和靶點之間具有較好的結(jié)合性。見表3,圖6。

圖6 槲皮素與IL-10、IL-6、TNF分子對接示意圖

表3 知柏地黃湯主要有效成分與核心靶點的分子對接結(jié)果 (kcal/mol)

2.2蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果

2.2.1蛋白/ 多肽統(tǒng)計 本研究共鑒定到3 960個蛋白(groups),28 434 條多肽,見圖7。本實驗中的質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集自Q Exactive HF-X高分辨率質(zhì)譜儀,能夠獲得高質(zhì)量的MS2圖譜,然后使用Andromeda對MS圖譜數(shù)據(jù)進行分析,最終獲得每張MS2圖譜的得分,即肽段離子得分(Ion Score)。從圖8中可以看出,大多數(shù)肽段得分在60分以上,每一套Label-free數(shù)據(jù)在定性分析工作中均使用Peptide FDR≤0.01和Protein FDR≤0.01作為篩選標準,結(jié)合所得的優(yōu)秀肽段得分分布情況,進一步說明實驗數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。

圖7 蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果統(tǒng)計圖

圖8 肽段離子得分分布圖

2.2.2差異蛋白的篩選與表達分析 共鑒定出3 960個蛋白,病毒模型組(MCG組)與正常對照組(BCG組)相比,有688個上調(diào)蛋白,641個下調(diào)蛋白;知柏地黃湯組(ZDD組)與MCG組相比,有569個上調(diào)蛋白,619個下調(diào)蛋白,見圖9。比較各組顯著表達差異蛋白,其中ILF3、MAP1B、SERBP1等差異蛋白在MCG組呈現(xiàn)下調(diào),在ZDD組呈現(xiàn)上調(diào),而ADAM10、ITGAV、CD63等差異蛋白在MCG組呈現(xiàn)上調(diào),在ZDD組呈現(xiàn)下調(diào)。說明這部蛋白可能是知柏地黃湯抗HSV-2的核心蛋白,后續(xù)還需通過實驗進行進一步認證。

Note:Points in the figure are upregulated proteins in blue, downregulated proteins in cyan, and no difference in gray and black.

2.2.3差異蛋白GO 功能富集分析 采用 Blast2Go(https://www.blast2go.com/)軟件對所有差異表達蛋白質(zhì)進行GO功能注釋,通過Fisher精確檢驗來發(fā)現(xiàn)差異表達蛋白的顯著性的富集趨勢(P<0.05)。結(jié)果表明這些蛋白主要參與了生物進程、細胞組成和分子功能的作用,潛在作用靶點主要集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、胞外區(qū)和細胞膜。知柏地黃湯通過影響細胞mRNA的穩(wěn)定性、ATP的合成等途徑干預(yù)HSV-2病毒在細胞內(nèi)的復(fù)制,見圖10。

Note:The ordinate represents the GO function name, the horizontal axis value is the significance P value-Log10 converted value, the color indicates the different GO function classification, and the number on the column represents the rich factor value.

2.2.4差異蛋白的KEGG 富集分析 對所有顯著差異蛋白納入KEGG 數(shù)據(jù)庫進行檢索,找出有顯著關(guān)系的KEGG 通路,結(jié)果顯示知柏地黃湯所涉及的通路主要有Toll、IL-17、P13K-Akt信號通路等,見圖11。

Note:The ordinate indicates the KEGG pathway name, the abscissa indicates the rich factor value, the circle color represents the converted value, the blue color indicates the smaller P value, and the circle size indicates the number of differential proteins included in the pathway.

3 討論

生殖器皰疹屬于中醫(yī)“陰瘡”、“陰疳”等范疇,主要由于正氣不足,觸染濕熱毒邪而發(fā)病,而濕熱久蘊,耗氣傷陰,陰虛邪戀,病情反復(fù)發(fā)作［17］。知柏地黃湯最早見于《醫(yī)宗金鑒》,由六味地黃丸化裁而來,主要由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓、黃柏、知母八味中藥組成,主要功效為滋陰降火,臨床上用于治療陰虛邪戀,陰虛火旺證。前期臨床上運用知柏地黃湯治療復(fù)發(fā)性生殖器皰疹取得了一定的療效［7］。

本研究網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示,槲皮素、山奈酚、豆甾醇等可能為知柏地黃湯抗HSV-2的主要活性成分。槲皮素是一種天然黃酮類化合物,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有抗氧化、抗炎、抗病毒以及光譜抗菌性等藥理作用［18-20］。許玲芬等［21］發(fā)現(xiàn)槲皮素可以通過TLR4-NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎、抗病毒的作用。山奈酚是一種黃酮化合物,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗病毒、抗氧化等藥理作用［22］。豆甾醇屬于一種植物性甾醇,具有較強的生物活性,具有抗炎、抗氧化、抗癌等作用,其對過敏性皮膚病也有一定的藥理作用［23-24］。

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)及拓撲分析,篩選出較為重要的核心靶點,主要有RELA、IL-6、TNF、IL-10等。RELA通過可以通過抑制NF-κB和SP1的作用來阻斷HSV-1病毒的轉(zhuǎn)錄［25］。腫瘤壞死因子、白介素等屬于炎癥細胞因子,其表達的異常一定程度上反映了機體免疫功能狀況。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果一定程度上說明知柏地黃湯抗HSV-2的核心靶點蛋白通過調(diào)節(jié)機體炎癥反應(yīng)以及免疫反應(yīng)發(fā)揮抗病毒作用。GO與KEGG富集分析結(jié)果表明,RELA、IL-6、TNF、IL-10等靶點,可能通過參與調(diào)控IL信號通路、Toll樣受體信號通路、TNF信號通路等多種信號通路。其中Toll樣受體(TLRs)是一種模式識別受體,主要是識別病原體以及誘導(dǎo)先天免疫應(yīng)答,在免疫系統(tǒng)發(fā)育和維持中起著重要作用［26］。本課題組前期研究表明了Toll樣受體通路在HSV-2感染方面有重要作用［27］。

本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與病毒模型組相比,知柏地黃湯組中有569個蛋白上調(diào),619個蛋白下調(diào),共1 188個差異蛋白,其中ILF3、DDX1、CD63、ITGAV、HLA-C等差異表達顯著。查閱相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn),白介素增強因子(ILF3)在抗病毒感染方面發(fā)揮重要作用,在病毒感染后,ILF3在細胞質(zhì)中積累并參與抗病毒天然免疫［28］。蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示,知柏地黃湯組ILF3上調(diào),表明知柏地黃湯可能通過調(diào)節(jié)ILF3來發(fā)揮抗HSV-2作用。整合素α-V(ITGAV)是多種蛋白的受體,研究發(fā)現(xiàn)α-Vβ6和α-Vβ8作為HSV-1進入宿主細胞的受體,以高親和力結(jié)合gH/gL,從而影響了HSV-2的進入途徑［29］。蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示知柏地黃湯組ITGAV下調(diào),說明知柏地黃湯可能通過調(diào)節(jié)ITGAV而發(fā)揮抗HSV-2的作用。

綜上所述,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法篩選出知柏地黃湯抗HSV-2的核心成分與核心靶點,知柏地黃湯可能通過槲皮素、山奈酚、豆甾醇等核心成分,作用于RELA、IL-6、TNF、IL-10等靶點,參與調(diào)控IL、Toll樣受體、TNF等信號通路干預(yù)HSV-2的復(fù)制,體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分-多靶點-多通路協(xié)同作用的特點。但知柏地黃湯的核心有效成分是如何通過主要的信號通路抑制生殖器皰疹復(fù)發(fā)的機制尚不清楚,有待后續(xù)深入研究及實驗驗證,為該方的臨床應(yīng)用提供的理論依據(jù)。