冷等離子體處理技術(shù)在黃芪育種上的應(yīng)用研究

唐 欣，姚 遠(yuǎn)，張麗麗，邵長勇，，尤 泳，郝林杰，惠云婷，王德成

（1．山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100；2．山東省種子有限公司，山東 濟(jì)南 250100；3 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100083）

1 引言

中藥黃芪 (Leguminosae)又稱戴糝、芰草、百木、黃耆,為豆科黃芪屬的多年生草本植物[1]。世界范圍內(nèi),黃芪大約有2000多個品種,主要分布于北溫帶,中國約有240多種,主要分布在荒漠地區(qū),主產(chǎn)地為山西、黑龍江、內(nèi)蒙古等。黃芪具有利水退腫、補(bǔ)氣升陽、益氣固表、托瘡生肌、托毒排膿、抗衰老等功能[2]。蒙古黃芪含黃芪多糖及多種氨基酸,膜莢黃芪含黃酮、皂貳類成分,臨床上黃芪有多方面的應(yīng)用,并且在國內(nèi)外得到廣泛應(yīng)用和發(fā)展,隨著對黃芪藥理作用研究的不斷深入及其藥用范圍的不斷拓寬,對其需求量也越來越大[3]。近年來，各地黃芪的人工栽培生產(chǎn)發(fā)展較快，并在栽培技術(shù)上取得了一些經(jīng)驗，但是,目前在當(dāng)?shù)攸S芪生產(chǎn)中良種較為單一，已不能適應(yīng)黃芪產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的需要，對建立黃芪GAD基地形成了制約，品種問題已成為黃芪產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的瓶頸[4]。生產(chǎn)實踐表明，選育新品種已成為提升黃芪優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)的有效途徑之一,由于進(jìn)行黃芪常規(guī)人工雜交育種存在著許多實際困難，黃芪自交親和指數(shù)低，加之黃芪又是多年生作物，完成一個正常的生命周期約需3年時間，黃芪育種發(fā)展緩慢[5]。

冷等離子體技術(shù)作為一種種子處理新技術(shù)，國內(nèi)外進(jìn)行大量研究[6-7]。前人對小麥[8]、水稻[9]、番茄[10]、大豆[11]、大蔥[12]等作物和蔬菜進(jìn)行播前處理，改良生物學(xué)性狀或是發(fā)芽指標(biāo)。將該技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)育種在國內(nèi)外尚屬新的研究領(lǐng)域[13]，對于冷等離子體種子播前處理技術(shù)在農(nóng)作物育種上的應(yīng)用，山東省種子有限公司和中國農(nóng)業(yè)大學(xué)等有關(guān)單位已經(jīng)開始了嘗試[14]，通過使用一定功率的冷等離子體對種子或其他生物體進(jìn)行處理，不僅可以誘發(fā)植物當(dāng)代性狀變化，并且在二代乃至三代依然保持形狀改變，并且具有一致性規(guī)律[15]。通過反復(fù)試驗，運用冷等離子體種子處理技術(shù)，結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)和同工酶鑒定技術(shù)進(jìn)行輔助育種，以及利用雜交優(yōu)勢手段，已經(jīng)利用該技術(shù)培育出了目標(biāo)性狀的農(nóng)作物新品種。該技術(shù)突破了傳統(tǒng)育種低水平重復(fù)、同質(zhì)化嚴(yán)重和轉(zhuǎn)基因育種潛在危險，以及太空育種經(jīng)濟(jì)投入巨大的缺點，可以縮短育種周期，在育種方法和手段上具有先進(jìn)性[16]。冷等離子體處理功率人為可控，通過反復(fù)試驗可以找到某種作物種子某一特定性狀的處理功率，能更好地滿足選育作物優(yōu)良品種的需求[17]。

將種子經(jīng)過冷等離子體處理，等離子可以穿透種子表皮，作用于復(fù)雜的生物大分子，吸收的部分能量迫使電子產(chǎn)生振動而轉(zhuǎn)化為熱能，等離子激發(fā)了生物大分子活性，被激活的潛在基因通過一個生長季的充分表達(dá)，產(chǎn)生一定的記憶性，刻在種子里，在下代種植之后，仍然積極表達(dá)，具有活力延續(xù)性[18]。本研究將冷等離子體處理技術(shù)運用到黃芪育種上，試圖解決黃芪常規(guī)人工雜交育種存在著的許多實際困難，提升黃芪優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn),突破傳統(tǒng)黃芪育種低水平重復(fù)、同質(zhì)化嚴(yán)重和轉(zhuǎn)基因育種潛在危險，以及太空育種經(jīng)濟(jì)投入巨大的缺點。目前尚未見冷等離子體在黃芪育種方面的研究和報道。

2 材料與方法

2.1 材料

黃芪是世界上最重要的中草藥之一，因此選擇黃芪種子進(jìn)行本研究。黃芪種子是通過正規(guī)渠道購買的“隴芪3號”。只選擇沒有明顯缺陷的健康種子。

2.2 種子加工裝置及原理

種子處理設(shè)備是中國農(nóng)業(yè)大學(xué)和山東省種子有限公司等單位研制的2SZ-10型冷等離子體種子處理儀。該裝置在模擬真空狀態(tài)下進(jìn)行密閉操作，是通過氣體放電使氣體電離而產(chǎn)生的，氣體放電中，氣體分子和原子吸取了外界的能量被分解和電離，成為帶負(fù)電的電子和帶正電的離子，形成等離子體。當(dāng)種子通過等離子體輝光放電區(qū)時受到光的作用，光與種子表層相互作用時，光被吸收和散射，吸收的部分能量迫使電子產(chǎn)生振動而轉(zhuǎn)化為熱能，當(dāng)物質(zhì)分子吸收了光子，其電子會從較低能態(tài)（基態(tài)）躍遷到較高能態(tài)（激發(fā)態(tài)），引起物質(zhì)的能態(tài)躍遷，從而使種子增強(qiáng)生命活力[19]。

2.3 處理方法

用冷等離子體種子處理技術(shù)對黃芪種子進(jìn)行處 理，8 個處理分別為 0（CK），50W、100W、150W、200W、250W、300W 和 350W，對應(yīng)處理時間為17S，每個處理150g，黃芪品種為隴芪3號。

2.4 試驗設(shè)計

2.4.1 室內(nèi)試驗

8個處理按照牧草種子發(fā)芽試驗操作規(guī)程，于2015年1月山東省種子有限責(zé)任公司質(zhì)檢室內(nèi)進(jìn)行。將純凈水置于培養(yǎng)皿中，至濾紙飽和，每個培養(yǎng)皿播入100粒無病、飽滿大小均勻的黃芪種子，每個處理設(shè)三次重復(fù)。分別在25℃恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12天[20]，每天觀察種子萌發(fā)情況，記錄發(fā)芽數(shù)、保持各處理萌發(fā)環(huán)境相對穩(wěn)定。根據(jù)所得數(shù)據(jù)計算發(fā)芽勢和發(fā)芽率；發(fā)芽試驗結(jié)束后，測量苗高和根長。

2.4.2 田間試驗

8個處理的黃芪種子按照株行距20*15cm條播，在同一地塊相同田間管理模式下種植比較。調(diào)查播種后一個月幼苗株高和分枝數(shù)；霜降調(diào)查一年生根的主根長、根粗、鮮根重；回收種子測定單株結(jié)實數(shù)，田間種植測定二代種子一年生根的主根長、根粗、鮮根重。該試驗在山東省種子有限公司齊河試驗站進(jìn)行。

2.5 發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)

發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)的計算公式如下:

n1為第6天發(fā)芽數(shù)，n2為第12天發(fā)芽數(shù)，N為種子總數(shù)。利用方差分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素隨機(jī)區(qū)組試驗方差分析。

2.6 苗高和根長的測量方法

在最后計數(shù)時，從每次重復(fù)中選出10株生長均勻的幼苗。用游標(biāo)卡尺測定苗高和根長。

2.7 幼苗和主根長的測量方法

幼苗長勢在出苗后一個月進(jìn)行，從中間行選擇10株連續(xù)單株，用尺子測定株高，測定葉片數(shù)；

霜降后用專用工具挖出完整的黃芪根，隨機(jī)選取10個根測量根長[21]、根粗和鮮重。

根長：把根拉直直接測定長度

根粗：隨機(jī)選10個黃芪根用小刀修齊頂端，游標(biāo)卡尺測定粗度，取平均值。

株高：是指地面到苗頂最高點的測量值；

鮮重：隨機(jī)選10個單株，從土壤中挖出、洗凈后，用吸水紙或濾紙吸干根表面水分，用電子天平稱取根鮮重。

2.8 結(jié)果與分析

采用SPSS軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素隨機(jī)區(qū)組試驗方差分析。

3 試驗結(jié)果及分析

冷等離子體處理條件下對黃芪種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響如圖1所示：

圖1 不同冷等離子體處理條件下黃芪種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率Figure 1 Germination vigor and germination rate of Astragalus seeds under different cold plasma

圖1和表1可以看出，不同功率的冷等離子體處理對黃芪種子的發(fā)芽勢均有不同程度影響。與對照相比，處理功率200W，發(fā)芽勢比對照提高27.61% ，產(chǎn)生差異達(dá)到顯著水平；處理功率100W測定的發(fā)芽勢低于對照，對黃芪發(fā)芽起到了抑制作用，但差異不顯著。而當(dāng)處理功率50W、150W時，發(fā)芽勢高于對照相關(guān)測定值，有差異但不顯著；處理功率250W、300W和350W發(fā)芽勢測定值與對照無差異。

表1 與對照相比不同冷等離子體處理條件下黃芪的發(fā)芽勢和發(fā)芽率提高的比例Table 1 Compared with the control,the ratio of the germination vigor and germination rate of Astragalus membranaceus under different cold plasma treatment conditions

當(dāng)處理功率為200W時，經(jīng)過冷等離子體處理的黃芪的種子的發(fā)芽率提高最大16.01% ，顯著高于對照；50W、250W和300W比對照提高，但不顯著，150W和350W測定的發(fā)芽率與對照無差異；而處理功率100W發(fā)芽率的測定值顯著低于對照。合適功率冷等離子體處理可以提高發(fā)芽指標(biāo)，處理功率與發(fā)芽勢、發(fā)芽率非正相關(guān)，隨著功率增加呈馬鞍型波動。

不同處理功率和處理時間對30日苗齡黃芪幼苗株高和分枝數(shù)有顯著影響（圖2、圖3），在不同處理時間下，隨著功率的增加，黃芪的株高和分枝數(shù)變化不同。處理功率200W時，30日苗齡測定的T1株高提高23.08% ，分枝提高27.66% ，此時株高和分枝數(shù)均到達(dá)峰值；此功率T2株高提高22.89% ，分枝提高24.19% 。處理功率200W的冷等離子體處理黃芪種子，可以促進(jìn)其苗期長勢。處理功率300W時，T1株高增加，分枝數(shù)減少；而處理功率350W時，T1分枝數(shù)增加，株高減少。可根據(jù)育種材料的育種方向，運用不同處理功率改良分枝數(shù)或植株高度。冷等離子體處理后黃芪T1和T2的株高變化幅度不同，但趨勢基本一致。說明冷等離子體處理黃芪種子，對苗期分枝和株高的影響具有遺傳性。

圖2 不同冷等離子體處理條件下30日苗齡黃芪T 1和T2幼苗情況Figure 2 Condition of 30-day-old Astragalus T1 and T2 seedlings under different cold plasma treatments

圖3 不同冷等離子體處理條件下30日苗齡黃芪T1和T2幼苗與對照相比增幅情況Figure 3 The increase of 30-day-old Astragalus T1 and T2 seedlings compared with the control under different cold plasma treatment conditions

冷等離子體處理對黃芪根系的影響如表2所示：

表2 不同冷等離子體處理條件下黃芪T1和T2一年生主根的情況Table 2 Annual taproots of Astragalus T1 and T2 under different cold plasma treatment conditions

由表2看出，不同功率的冷等離子體處理對黃芪種子的主根長和主根粗均有不同程度影響。處理功率200W，處理時間17S時，黃芪T1一年生主根長達(dá)到最大值，與對照產(chǎn)生顯著差異；處理功率100W，處理時間18S時，主根長與對照無差異；處理功率50W、處理時間20S，處理功率150W、處理時間17S，處理功率250W、處理時間16S，處理功率350W，處理時間15S時，T1一年生主根長均高于對照，產(chǎn)生差異，但差異不顯著；處理功率300W、處理時間15S時，T1一年生主根長低于對照，產(chǎn)生不顯著差異；處理功率150-250W和350W時，T2一年生主根長均高于對照，產(chǎn)生不顯著差異；處理功率100W和300W時，T2一年生主根長小于對照，差異不顯著；由數(shù)據(jù)和方差分析可以得出，冷等離子體處理具有遺傳性，遺傳性 T1＞T2。

當(dāng)處理功率100-200W時，黃芪T1一年生根粗均高于對照，產(chǎn)生顯著差異；處理功率50W、250W和300W時，根粗亦高于對照產(chǎn)生差異，但差異不顯著；當(dāng)處理功率200W和350W時，黃芪T2一年生根粗比對照仍顯著提高，具有遺傳性。

由表3看出，處理功率0-250W或350W時，冷等離子體處理T1和T2根鮮重均不同程度增加；但處理功率300W時，T1和T2的測定的黃芪一年生根系鮮重均比對照降低。說明處理功率與根系改良情況并非正相關(guān)，亦并非全都是促進(jìn)作用。不同作物不同處理功率差距大，需根據(jù)試驗測定結(jié)果選擇最優(yōu)處理功率。

表3 不同冷等離子體處理條件下黃芪T1和T2一年生根重的情況Table 3 Annual root weight of Astragalus T1 and T2 under different cold plasma treatment conditions

當(dāng)處理功率為200W時，經(jīng)過冷等離子體處理的黃芪在T1和T2，其主根長、主根粗、根鮮重均優(yōu)于對照，可作為遺傳育種中改良根系的最佳處理方案。根系改良，對吸收深層土壤中的水分和養(yǎng)分更有突出作用，因為植物在生長過程中需要吸收大量的肥料和水分來供給枝葉生長和結(jié)果，植物的根系越發(fā)達(dá)，植株長勢越強(qiáng)。說明冷等離子體處理促進(jìn)了黃芪親本根系發(fā)育和幼苗的生長。

4 討論

冷等離子體技術(shù)作為一種種子處理新技術(shù)，將該技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)育種在國內(nèi)外尚屬新的研究領(lǐng)域[22]。運用冷等離子體處理黃芪育種材料，根據(jù)育種目標(biāo)選出得到改良的優(yōu)良材料。通過混合選擇，采用雜交、自交和回交等常規(guī)育種手段，并結(jié)合分子標(biāo)記和同工酶鑒定手段進(jìn)行輔助育種[23]，選育得到了黃芪穩(wěn)定材料，育種材料具有發(fā)芽指標(biāo)提高、幼苗長勢增強(qiáng)、根系改良等至少一種性狀。通過抗性鑒定試驗及品比試驗，最終得到根系改良的優(yōu)良黃芪新品種，符合預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)[23-32]。

4.1 創(chuàng)造黃芪育種新思路、創(chuàng)新了黃芪育種新方法。該方法突破了傳統(tǒng)黃芪育種低水平重復(fù)、同質(zhì)化嚴(yán)重和轉(zhuǎn)基因育種潛在危險，以及太空育種經(jīng)濟(jì)投入巨大的缺點，可以縮短黃芪育種周期，在黃芪育種方法和手段上具有先進(jìn)性。

4.2 運用適量功率的冷等離子體種子處理，改良了黃芪性狀某些性狀，提高了變異率。具體表現(xiàn)在改良根系和提高結(jié)實。

4.3 冷等離子體處理的處理功率人為可控，有益變異率高，結(jié)合分子標(biāo)記和同工酶鑒定利用，可以找到控制黃芪自交不親和的基因，通過反復(fù)試驗得出改良自交不親和系的最佳的處理功率，能更好地滿足選育黃芪品種的需求，選育出更為優(yōu)良的黃芪新品種。

5 結(jié)論

5．1 經(jīng)過200W冷等離子體處理的黃芪的種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率提高最大，分別比對照提高27.61% 和16.01% ，說明經(jīng)過冷等離子體處理后，黃芪種子發(fā)芽勢大幅提高，發(fā)芽率亦有所提高，田間出苗快且整齊，實現(xiàn)了親本材料的苗齊苗壯。

5．2 經(jīng)過冷等離子體處理的黃芪地上部分分枝數(shù)或株高提高，處理功率200W時，30日苗齡T1測定的株高提高23.08% ，分枝提高27.66% ，此時株高和分枝數(shù)均到達(dá)峰值；此功率T2株高提高22.89% ，分枝提高24.19% 。說明冷等離子體處理促進(jìn)了幼苗的快速生長，生長勢旺盛，實現(xiàn)了親本材料的促生復(fù)壯，苗期優(yōu)勢可以遺傳到T2代。

5．3 當(dāng)處理功率為200W時，經(jīng)過冷等離子體處理的黃芪在T1和T2，其主根長、主根粗、根鮮重均優(yōu)于對照，可作為遺傳育種中改良根系的最佳處理方案。

種植供選擇自交系用的基本材料，建立原始材料圃，根據(jù)目標(biāo)性狀選擇優(yōu)良株系。通過群體內(nèi)植株雜交，回交、測交等選擇優(yōu)良株系，建立雜交選育圃。把根系長勢、產(chǎn)量作為自交系選育的依據(jù)，在群體改良過程中，每一步都應(yīng)根據(jù)育種目標(biāo)的要求，為新品種選育服務(wù)。按照育種目標(biāo)，從雜交選育圃中，選出單株或一定數(shù)量外形近似的優(yōu)良個體（單株、單穗），進(jìn)行混合收獲、脫粒、種植，建立混合選育圃，多代種植直至穩(wěn)定。選育出的優(yōu)良株系，建立鑒定圃，在鑒定圃內(nèi)進(jìn)行初級的產(chǎn)量比較，同時進(jìn)行抗性鑒定，進(jìn)行供試品種初選。將種植鑒定圃選出的優(yōu)良品系，進(jìn)行種植，建立品比圃，品系比較試驗在較大面積上進(jìn)行的更為精確、更有代表性的鑒定試驗，對新品系的純度、豐產(chǎn)性、熟性、穩(wěn)定性、抗逆性等育種目標(biāo)進(jìn)行更為詳細(xì)的鑒定。將獲得的新品種進(jìn)行區(qū)域試驗、生產(chǎn)示范和品質(zhì)檢測等，之后進(jìn)行品種技術(shù)鑒定，新品種選育工作完成。