微流控技術和智能手機在分析化學實驗教學中的應用探索
——以磷鉬藍比色法為例

郭錦秀,龍海濤,胡 冰,何 浪,賈利蓉,孔 濤

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 理學院,甘肅 蘭州 730070)

微流控技術起源于20世紀90年代末,是一種在微納米尺度的空間中進行流體精確操控的科學技術,具有將常規(guī)實驗室中諸如樣品處理、混合、反應、分離和檢測等多種功能集成到一個微小芯片上的能力[1-2].作為分析化學的重要分支和科技前沿技術之一,在大學分析化學的實驗教學中適當增加微流控技術的相關內(nèi)容是十分必要的.從化學實驗課的思政建設出發(fā),微流控技術可以顯著降低實驗成本、縮短實驗時間、減少污染排放,體現(xiàn)了科學發(fā)展觀,是當前科技前沿領域中的綠色技術之一;從化學實驗課的教學目的出發(fā),微流控技術的引入,有利于培養(yǎng)學生的動手和觀察能力,開拓學生的科學思維和視野,激發(fā)學生的學習和創(chuàng)新意識;從微流控技術的發(fā)展現(xiàn)狀來看,基于微流控芯片的商業(yè)化儀器已經(jīng)出現(xiàn),微流控的重要性已得到了諸多領域科研工作者的廣泛認同,各種材料廉價、操作簡單、設備要求低的微流控芯片的加工技術相繼出現(xiàn),關于微流控分析的理論已較為完善[3-4].基于以上原因,在大學化學實驗教學中引入微流控技術的條件已經(jīng)成熟.

如今智能手機通過各種軟件,可以實現(xiàn)高清拍照、圖像處理、光線感應、重力傳感、數(shù)據(jù)傳輸?shù)裙δ?這為智能手機應用于實驗教學提供了可能[5].智能手機便攜化、集成化、智能化等特點和微流控技術的初衷不謀而合,可以為微流控芯片提供一個低成本便攜式的檢測平臺.

基于微流控芯片和智能手機比色傳感的現(xiàn)場即時檢測技術(point-of-care test, POCT)已被證明在生物醫(yī)學、食品安全和環(huán)境監(jiān)測等領域具有良好的發(fā)展前景.自從2008年,Martinez等[6]利用智能手機在紙基微流控芯片上對人體尿液中葡萄糖和蛋白質(zhì)濃度實現(xiàn)比色檢測之后,基于智能手機和微流控芯片的比色檢測平臺發(fā)展迅速.2021年,中國農(nóng)業(yè)大學林建涵團隊[7]研制了一種集成的微流控比色生物傳感器,通過智能手機App對顏色進行處理來確定細菌的數(shù)量.最近Nature報道了一種利用3D打印技術構建的微流控芯片平臺,配合智能手機可以用作光電探測器,實現(xiàn)了包括冠狀病毒SARS-CoV-2在內(nèi)的一系列生物靶點的檢測[8].

1 實驗設計思路

磷鉬藍比色法是大學分析化學實驗中磷或磷酸鹽含量測定的常用方法,以往的教學都是在樣品處理后加入鉬銻抗混合顯色劑,待顯色后使用分光光度計進行定量分析,但實際操作中存在濃硫酸用量大、顯色隨時間變化等問題[9],導致實驗的安全性和結果的規(guī)律性大打折扣.微流控芯片的微量和集成優(yōu)勢可以有效減小包括濃硫酸在內(nèi)的試劑用量,消除由于顯色時間的差異造成的誤差,顯著提高分析效率,不僅能夠提高磷鉬藍比色法的安全性、準確性、高效性,同時也能夠增加實驗教學中的趣味性和前沿性.

用于制作塑料微流控芯片的金屬絲熱壓法操作成本低、難度小,適用于本科生實驗教學.用該方法制備集成有多個微混合器結構的微流控芯片,并將其用于磷酸鹽標準溶液和待測溶液的同時顯色,使用智能手機拍攝顯色照片并通過手機軟件ColorMeter提取不同濃度磷酸鹽呈現(xiàn)出的RGB(三基色)值,根據(jù)灰度與RGB的數(shù)值關系,建立灰度-磷酸鹽濃度的標準曲線,實現(xiàn)待測溶液中磷含量的測定.

2 實驗原理

聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)因其優(yōu)越的光學透明度、抗腐蝕性、價格低廉等優(yōu)勢,成為了制作微流控芯片常用的聚合物材料[10].熱壓法是一種操作簡單的微通道快速加工和復制技術,模具可以簡單到微米級直徑的金屬絲,在加熱軟化的聚合物上放陽模加壓,即可壓制出微通道,將有通道和儲液池的基片和蓋片加熱封接,可制得微流控芯片[11].

由于微米級的結構,流體在微流控芯片中可以顯示出與宏觀尺度中不同的特殊性質(zhì),比如雷諾數(shù)的減小.微流控芯片通道中流體的雷諾數(shù)通常小于2 000,其中的流體將平行流動而不發(fā)生混合,但是不同組分的充分混合是化學反應的前提.為了實現(xiàn)微通道內(nèi)快速且充分的混合,可以通過設計合適的通道幾何形狀以增大不同流體的接觸時間或接觸面積.利用金屬絲熱壓法制備的雙螺旋通道結構被證明可以有效提高微通道中的混合效率[12].

在含有磷酸根的酸性介質(zhì)中,加入鉬酸銨和酒石酸銻鉀,會反應生成黃色的銻磷鉬雜多酸,該產(chǎn)物加入抗壞血酸后會被還原成鉬藍,鉬藍顏色的深淺與PO43-含量成正比,故可用比色法對磷酸鹽含量進行測定.在一個集成多個雙螺旋通道的微流控芯片上,可以基于上述原理實現(xiàn)磷酸鹽待測樣品和標準系列的同時顯色,并利用手機攝像頭對顯色后的溶液進行拍照,再利用手機軟件獲取不同濃度磷酸鹽顯色后對應的RGB數(shù)據(jù),根據(jù)公式

Y=R×0.299+G×0.587+
B×0.114

(1)

將RGB轉(zhuǎn)化為Y(灰度)[13],最后通過建立灰度數(shù)據(jù)與濃度的標準曲線實現(xiàn)磷酸鹽含量的分析.

3 實驗部分

3.1 試劑或材料

氫氧化鈉、酒石酸銻鉀(A.R.,天津市大茂化學試劑廠),鹽酸、硫酸(A.R.,成都市科龍化工試劑廠),無水乙醇(A.R.,成都市科隆化學品有限公司),丙酮(A.R.,天津化學試劑有限公司),乙二醇(A.R.,天津市百世化工有限公司),鉬酸銨、抗壞血酸(A.R.,天津市光復科技發(fā)展有限公司),磷酸二氫鉀(A.R.,廣東光華科技股份有限公司),番紅O(染料含量≥85%,Sigma-Aldrich),亮綠(染料含量≥85%,Koch-Light),實驗用水為超純水(娃哈哈純凈水,杭州娃哈哈集團有限公司),所有的溶液使用前均經(jīng)過0.45 μm微孔膜過濾.用于微流控芯片制作的PMMA板購自金億有機玻璃制品廠.

磷儲備溶液:準確稱取0.0717 g干燥并恒重過的磷酸二氫鉀溶于適量水中,然后用水定容至100 mL容量瓶中,得到500 mg/L(以磷酸根計)的磷儲備液.

鉬銻抗混合顯色劑:稱取0.13 g鉬酸銨,0.0035 g酒石酸銻鉀,溶于2 mL水中,緩緩加入1.2 mL硫酸,混勻,冷卻后用水稀釋至5 mL,得到26 g/L鉬酸銨溶液.稱取0.10 g抗壞血酸定容于1 mL水中,得到100 g/L抗壞血酸溶液.取0.2 mL 26 g/L鉬酸銨溶液與0.1 mL 100 g/L抗壞血酸溶液混合后,用水稀釋至1 mL即得到鉬銻抗混合顯色劑.

3.2 儀器和表征方法

鼓風恒溫干燥箱(DHG-9070A,上海一恒科學儀器有限公司),超聲波清洗器(KQ-100B,昆山市超聲儀器有限公司),臺式鉆床(BG-5158),移液器、漩渦混合器(QL-901)(大龍興創(chuàng)實驗儀器股份公司),數(shù)顯手機顯微鏡(上海韌躍電子科技有限公司),智能手機(Redmi Note 9 Pro).

3.3 實驗步驟

微流控芯片的制作:撕去PMMA表面保護膜,依次用水、1 mmol/L鹽酸、水、1 mmol/L氫氧化鈉、水、乙醇在超聲波清洗器中清洗5 min后,裝入載玻片盒內(nèi)于50 ℃烘干,以去除PMMA表面的污染物;用臺鉆在3 mm厚的PMMA板上打出直徑5 mm的小孔作為儲液池;在一個干凈的玻璃片表面用200 μm銅絲調(diào)整好陽模形狀,并用膠帶在玻璃片背面固定,將上一步加工有儲液池的PMMA板用長尾夾固定在有陽模的玻璃片和另一個干凈玻璃片中間,于110 ℃在烘箱中熱壓15 min,冷卻至室溫后去除銅絲形成微通道;將加工有微通道的3 mm厚PMMA基片和另一個同樣大小但厚度為1 mm的PMMA蓋片在乙醇中清洗干凈后,用長尾夾固定在一對干凈的玻璃片之間,于95℃的烘箱中熱封接10 min,冷卻后用丙酮對芯片的外圍進行密封.根據(jù)以上流程加工出圖1所示的3種微流控芯片,并放于自封袋中備用.

圖1 微流控芯片通道結構示意圖

微流控芯片中溶液的混合:在十字型通道和Y型雙螺旋通道中將兩種染料混合,以證明雙螺旋通道結構能夠有效提高微通道中溶液的混合效率.為了避免染料在PMMA表面的吸附,微流控芯片使用前需用乙二醇充滿通道并靜置5 min,抽干儲液池中的乙二醇后再注入染料[14].分別在十字型通道的A、B、C三池中分別加入乙二醇、10 mmol/L亮綠和10 mmol/L番紅O各20 μL,3種溶液在液面壓力差的作用下向D池流動,用數(shù)顯手機顯微鏡記錄混合通道中的現(xiàn)象.微通道中溶液混合現(xiàn)象記錄裝置如圖2所示.然后在Y型雙螺旋通道的A、B兩池中加入10 mmol/L亮綠和10 mmol/L番紅O各20 μL,用同樣的方法記錄兩種溶液的混合現(xiàn)象,并與十字型通道中的實驗結果進行對比.

圖2 微通道中溶液混合現(xiàn)象記錄裝置

磷酸鹽標準系列和待測樣品在微流控集成芯片上的顯色:分別取0,0.1,0.2,0.3,0.4 mL磷儲備液于5個5 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻,得到0,10,20,30,40 mg/L磷標準溶液.清洗Y型雙螺旋集成芯片后先用乙二醇充滿微通道并靜置5 min,抽干儲液池中的乙二醇.在集成芯片上每一個Y型結構的A、B兩池中分別加入鉬銻抗混合顯色劑和磷酸鹽溶液各40 μL.加溶液時使用移液槍先在6個B池中加入顯色劑,然后于1 min內(nèi)以濃度從小到大的順序依次在6個A池中加入5個磷標準溶液和1個待測樣品,由于集成芯片的對稱結構和液面壓力差的作用,磷酸鹽溶液和顯色劑會在雙螺旋通道中混合并于6個C池中完成顯色.

手機拍照、RGB值提取和數(shù)據(jù)處理:選用稱量紙作為襯底,通過智能手機的攝像頭對6個顯色池在自然光下進行拍照,然后打開手機上的ColorMeter軟件,點擊圖片取色→選擇照片→選取C池中顏色均勻處→讀取RGB值,圖3為使用軟件時的截圖.根據(jù)不同濃度磷酸鹽溶液的RGB值,得到對應的灰度值,建立灰度值與磷酸鹽濃度的標準曲線,在該曲線上讀取待測樣品灰度值對應的磷酸鹽濃度,完成磷酸鹽含量的測定.

圖3 ColorMeter軟件RGB值提取界面

4 結果與討論

4.1 PMMA微流控芯片的制作條件

實驗中使用的金屬絲熱壓法可以實現(xiàn)聚合物芯片的批量制作,成本低、易操作,圖1中的3個芯片僅需2 h即可在一間普通化學實驗室中完成加工,無需超凈間和昂貴的設備.與報道的金屬絲熱壓法中先壓通道后打孔的流程不同[15],本實驗在通道壓制之前已將用作儲液池的小孔用臺鉆加工完成,這樣可以有效避免打孔時造成的通道末端變形和堵塞現(xiàn)象.PMMA的熱變形溫度是90 ℃,因此壓制通道和封接溫度需高于90 ℃,實驗發(fā)現(xiàn)110 ℃下壓制15 min的通道即可滿足本實驗中的混合要求,之后在95 ℃熱封接10 min即可在保持通道結構的前提下實現(xiàn)基片和蓋片的緊密貼合,溫度過低會因封接不嚴導致漏液,溫度過高會使通道變細甚至消失.圖4是利用數(shù)顯手機顯微鏡拍攝的通道放大照片.由圖4可知,用這種方法制得的通道光滑均勻,保留了陽模中的細微結構.另外,數(shù)顯手機顯微鏡的使用進一步降低了芯片制作成本,提高了實驗裝置的便攜性,也增加了實驗過程的趣味性.

(a)十字型通道 (b)Y型雙螺旋通道圖4 微流控芯片通道放大10倍后的顯微鏡照片

4.2 雙螺旋型微通道的混合效果

盡管使用PMMA等聚合物材料可以降低芯片成本,但是大部分聚合物材料表面疏水,存在嚴重的非特異性吸附,會對微通道中流體流動行為產(chǎn)生影響.已有研究證明乙二醇可以有效抑制染料分子在聚合物表面的吸附[14],因此,本實驗中的芯片使用前先用乙二醇充滿通道并靜置5 min,以完成通道表面的改性.如圖5所示,經(jīng)乙二醇改性后,十字型芯片中的亮綠和番紅O在很長一段通道內(nèi)幾乎都不發(fā)生混合,上下流體界面清晰,僅在邊界處能看到微小的擴散現(xiàn)象;而在雙螺旋型通道內(nèi),兩種染料流經(jīng)不到0.5 cm的距離后即能夠混合完全,混合速率可達到0.17 cm/s,由此證明雙螺旋結構能夠有效提高微通道中溶液的混合效率.

(a)十字型通道 (b)Y型雙螺旋通道圖5 兩種染料在微通道中混合的顯微鏡照片

4.3 標準曲線的繪制和未知樣的測定

按照GB/T 6913-2008方法中鉬銻抗混合顯色劑的用量,使不同濃度的磷酸鹽溶液與顯色劑在集成有6個雙螺旋混合通道的芯片上進行混合和顯色.雙螺旋結構的存在可以在混合后30 s內(nèi)即于C池顯出藍色,盡管此時樣品和顯色劑在雙螺旋通道中已完成了充分混合,但是為了保證分析結果的準確性,需要等待儲液池中有足夠多的溶液再拍照,溶液過少會導致取色時產(chǎn)生較大的誤差,因此最終選擇混合2 min后再行拍照.周圍光線在芯片表面的反射和斜射對照片中顏色提取造成的影響,可以通過用稱量紙作為襯底拍照的方法有效避免[16].混合2 min后用智能手機拍攝以稱量紙為襯底的顯色照片如圖6所示,其中個別周邊儲液池中顯現(xiàn)的藍色是由于液面壓力差將顯色劑壓入磷酸鹽溶液池中導致的.因此要特別注意顯色過程中芯片中心廢液池的液面,要及時抽去其中流入的廢液,以防廢液進入顯色池對結果造成影響.

圖6 微流控集成芯片上磷酸鹽溶液的顯色照片

用ColorMeter軟件讀取圖片中的RGB值,并在Excel中通過公式(1)將RGB轉(zhuǎn)化為灰度值,表1中列出了不同濃度的磷酸鹽標準溶液與其對應的三原色值和灰度值,在磷酸鹽濃度為0～40 mg/L的范圍內(nèi)得到線性擬合方程為Y= -1.6295X+ 164.05,其中X為濃度,mg/L,Y為灰度,相關系數(shù)為0.9972.將待測樣品顯色照片的灰度值113.182代入上述擬合方程中,得到相應的磷酸鹽濃度為31.22 mg/L.

表1 不同濃度的磷酸鹽標準溶液與其對應的RGB值和灰度值

4.4 方法精密度與對比實驗

在同樣的條件下對未知樣品平行測定5次,得到該方法的相對標準偏差為2.9%.

將溶液體積等比例增大后,在相同實驗條件下用可見分光光度計(722N,上海精密科學儀器有限公司)在波長710 nm處測得標準溶液的吸光度,得到線性擬合方程Y= 0.0018X- 0.0026,其中X為濃度,mg/L,Y為吸光度,相關系數(shù)為0.9918.將待測樣品顯色后溶液的吸光度值0.055帶入上述擬合方程中,得到未知樣中磷酸鹽濃度為32.10 mg/L.與微流控-手機比色法相比,分光光度法得到的相關系數(shù)相差不大,二者測得未知樣中磷含量的結果也基本相符.但從擬合方程的斜率來看,微流控-手機比色法的靈敏度比分光光度法要高.

5 結語

利用金屬絲熱壓法在PMMA基材上加工了具有多個雙螺旋型通道結構的微流控芯片,并將其用于不同濃度磷酸鹽溶液與鉬銻抗顯色劑的混合與顯色,配合智能手機比色分析法在顯色后兩分鐘即可實現(xiàn)待測樣品中磷酸鹽含量的準確測定.微流控芯片和智能手機的配合使用縮短了傳統(tǒng)磷鉬藍比色法的操作時間,提高了檢測靈敏度,減少了危險試劑和大型儀器的使用,消除了由于顯色程度隨時間變化帶來的誤差,更能增強化學實驗教學內(nèi)容的前沿性和時代性.