基于HS-SPME-GC-MS對(duì)祿豐香醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及成分分析

趙銳環(huán),陳乾睿,安梅,李桂蘭,康小艷,徐志強(qiáng) *

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,昆明 650201;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省畜產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心,昆明 650201)

食醋大多是以谷物或水果為基本原料,經(jīng)微生物相互作用發(fā)酵而成的一種液態(tài)產(chǎn)品[1],通常被用作酸味調(diào)味,其口感豐富、風(fēng)味獨(dú)特。

我國(guó)傳統(tǒng)食醋獨(dú)具風(fēng)味、種類繁多、各具特色,其中山西老陳醋、四川閬中保寧醋、福建永春老醋和江蘇鎮(zhèn)江香醋被譽(yù)為我國(guó)的“四大名醋”,發(fā)酵方式為固態(tài)發(fā)酵的酸醋種類有山西老陳醋、四川閬中保寧醋、江蘇鎮(zhèn)江香醋,福建永春老醋為液態(tài)靜置發(fā)酵。祿豐香醋又稱發(fā)酵米醋,是原產(chǎn)于云南省楚雄市祿豐市的一種發(fā)酵米醋,原料使用了糯米,通過酒曲的糖化,黑曲、酵母、米曲、紅曲的后糖化、酒化、醋化發(fā)酵等工序制成[2]。微生物在發(fā)酵過程中的來源多種多樣,來源于麩皮、谷殼以及周圍的環(huán)境,而且通過微生物自身的生存進(jìn)化以及環(huán)境的適應(yīng),使發(fā)酵過程中的微生物種類處于動(dòng)態(tài)平衡的同時(shí),不斷使淀粉發(fā)生糖化、酒化、醋化,形成頗有祿豐特色的地方發(fā)酵產(chǎn)品。由于對(duì)祿豐香醋的研究大部分集中在其傳統(tǒng)工藝的優(yōu)化和改進(jìn)方面,而對(duì)其風(fēng)味成分的研究鮮有報(bào)道。

當(dāng)前,對(duì)揮發(fā)性成分分析的方法多種多樣,各有優(yōu)缺點(diǎn)。其中液液萃取(LLE)分離效果最好,但消耗試劑量多[3];固相萃取(SPE)試劑用量少,但操作步驟多,且回收率較低[4];固相微萃取(SPME)不用有機(jī)溶劑,但萃取材料的量少[5];頂空固相微萃取(HS-SPME)操作步驟簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好,但運(yùn)用的范圍窄[6];攪拌棒吸附萃取(SBSE)回收率高、重復(fù)性好,但設(shè)備價(jià)格昂貴[7]。因此對(duì)食醋中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究大多采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS),集采樣、萃取、進(jìn)樣于一體,加快了分析檢測(cè)速率。李攀恒等[8]采用HS-SPME結(jié)合GC-MS測(cè)定山西老陳醋中的揮發(fā)性香氣物質(zhì),共檢測(cè)出80種,分別為酯類、醇類、酸類、醛類、酮類、吡嗪類和其他類;鄭戰(zhàn)偉等[9]采用HS-SPME-GC-MS對(duì)山西老陳醋、江蘇鎮(zhèn)江香醋、四川閬中保寧醋和福建永春老醋4種具有代表性的食醋香氣成分進(jìn)行分析,得到多種香氣化合物。其中檢測(cè)得到的香氣化合物種類較多的是山西老陳醋,對(duì)應(yīng)的酯類和雜環(huán)類化合物的種類和數(shù)量也最多。研究表明固態(tài)發(fā)酵醋的香氣成分種類數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于液態(tài)發(fā)酵醋,這與姚金霞等的研究結(jié)果相似[10-11],同時(shí)發(fā)現(xiàn)食醋的香氣化合物與發(fā)酵年份有關(guān),年份越久,香氣化合物的種類越多。

在此基礎(chǔ)上,本研究探究了不同年份祿豐香醋的理化品質(zhì),利用HS-SPME-GC-MS檢測(cè)技術(shù)對(duì)祿豐香醋的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè),并利用正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)和變量投影重要性(variable importance in projection,VIP)解析不同年份祿豐香醋樣品中的主要風(fēng)味物質(zhì),為提升祿豐香醋的風(fēng)味品質(zhì)提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同年份祿豐香醋樣品:均來自祿豐香醋廠;葡萄糖、硫酸銅、氯化鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀、酒石酸鉀鈉、磷酸、鹽酸(均為分析純):購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司;2-辛醇(色譜純):購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-5977B GC-MS聯(lián)用儀、 DB-Wax色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm) 美國(guó) Agilent 公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;HANNA HI9025 pH計(jì) 北京億賽得科技發(fā)展有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 理化指標(biāo)的測(cè)定

還原糖含量:參照GB 5009.7—2016測(cè)定;氨基酸態(tài)氮含量:參照GB 5009.235—2016以及杜善良等[12]的方法測(cè)定;pH值:采用pH計(jì)測(cè)定。

1.3.2 SPME-GC-MS 檢測(cè)方法

SPME條件:取醋樣100 μL于20 mL 頂空瓶中,再加入10 μL 2-辛醇并密封。水浴(60 ℃、15 min),將萃取頭插入頂空瓶中(60 ℃、30 min),取出后插入GC 進(jìn)樣口,20 ℃下解吸 4 min,進(jìn)行GC-MS 分析。

GC條件:色譜柱采用 DB-Wax(30 m×250 μm×0.25 μm),進(jìn)樣口溫度250 ℃,不分流進(jìn)樣,載氣為氦氣,恒流模式;柱流速1 mL/min;程序升溫(40 ℃、4 min),以 5 ℃/min升到245 ℃,保持5 min。

MS條件:電子電離源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;質(zhì)量掃描范圍(m/z)20～400 Da。

使用LECO Chroma TOF V4.3X軟件,和NIST數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3.3 醋樣香氣成分半定量分析

采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行半定量分析,以2-辛醇為內(nèi)標(biāo)物。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.5和Excel對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、分析以及圖形繪制;采用SPSS 20.0進(jìn)行差異顯著性分析,P<0.05表示差異顯著;采用SIMCA-P進(jìn)行OPLS-DA和VIP值分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 祿豐香醋理化指標(biāo)分析

4個(gè)不同年份祿豐香醋的理化指標(biāo)見表1。

表1 祿豐香醋理化指標(biāo)分析結(jié)果

總酸在一定程度上能夠反映酸醋的質(zhì)量[13],祿豐香醋的pH為4.60～4.70,總酸為0.51～0.54 g/100 g,且兩者之前存在一定的相關(guān)性,總酸與pH呈負(fù)相關(guān),這與張林祥等的研究結(jié)果一致,祿豐香醋的pH高于鎮(zhèn)江香醋的pH(3.60～3.90)[14],低于赤水曬醋的pH(5.75～6.20)[15],這可能與發(fā)酵的原料、發(fā)酵時(shí)所選用的微生物、發(fā)酵場(chǎng)地和儲(chǔ)存時(shí)間的差異有關(guān)。

還原糖在發(fā)酵過程中為微生物提供能量,發(fā)酵前期大量利用還原糖,隨著發(fā)酵速度的減緩,還原糖在后期含量保持穩(wěn)定[16],同時(shí)還原糖還能調(diào)節(jié)發(fā)酵醋柔和的口感[17]。祿豐香醋的還原糖含量為1.2～1.4 g/100 g,與Wu等[18]測(cè)定鎮(zhèn)江香醋的研究結(jié)果類似,還原糖含量也是1.2～1.4 g/100 g。發(fā)酵醋中的氨基酸態(tài)氮是指以氨基酸形式存在的氮元素,發(fā)酵醋的品質(zhì)受到該含量的影響,含量越高,表明發(fā)酵醋的鮮味越濃郁[19]。4個(gè)醋樣中的氨基酸態(tài)氮含量為0.39～0.42 g/100 g,山西老陳醋的氨基酸態(tài)氮含量為0.21 g/100 g[20],鎮(zhèn)江香醋的氨基酸態(tài)氮含量為0.28～0.30 g/100 g。祿豐香醋的氨基酸態(tài)氮與鎮(zhèn)江香醋的類似,可能與它們所使用的原料都是糯米有關(guān),山西老陳醋的原料是大麥和豌豆[21]。

2.2 祿豐香醋香氣成分分析

為評(píng)價(jià)4個(gè)不同年份祿豐香醋的香氣成分差異,采用 HS-SPME-GC-MS 分析鑒定祿豐香醋揮發(fā)性化合物成分以及含量,結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 不同年份揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量

圖2 不同年份總揮發(fā)性物質(zhì)含量

不同年份祿豐香醋揮發(fā)性成分分析結(jié)果見表2。

表2 不同年份祿豐香醋揮發(fā)性成分分析結(jié)果

在一定程度上,樣品的風(fēng)味特征取決于揮發(fā)性化合物的組成和含量[22]。4個(gè)不同年份的樣品中共檢測(cè)到120種化合物,包括9種醇類物質(zhì)、21種醛類物質(zhì)、7種酸類物質(zhì)、24種酯類物質(zhì)、17種酮類物質(zhì)、7種酚類物質(zhì)、11種烷烴類物質(zhì)、3種烯烴類物質(zhì)以及21種雜環(huán)類物質(zhì)。4個(gè)不同年份祿豐香醋中揮發(fā)性成分各組分含量占比在一定程度上存在差異,其中酸類、酯類、醇類、酮類以及雜環(huán)類在不同年份祿豐香醋的所有揮發(fā)性化合物中占比較高。2017年的祿豐香醋揮發(fā)性化合物含量最高,為(86.65±8.33) μg/L,2018年、2019年、2020年的祿豐香醋揮發(fā)性化合物含量分別為(76.35±5.95),(68.71±7.51),(64.75±11.96) μg/L,表明揮發(fā)性化合物的種類、含量與年份有關(guān),這與杜大釗等[23]采用SPME-GC-MS技術(shù)解析四川麩醋及其陳釀過程中揮發(fā)性成分的研究結(jié)果類似。

酸類的產(chǎn)生與醋酸發(fā)酵階段有關(guān),原料中的碳水化合物在酶和微生物的作用下轉(zhuǎn)化為酸,一部分氨基酸降解也會(huì)產(chǎn)生酸[24]。同時(shí)酸類也是食醋重要的組成部分,占祿豐香醋香氣成分的26%～41%,賦予祿豐香醋特定的風(fēng)味及感官屬性。其中含量最多的是乙酸、異戊酸,這與孫宗保等[25]采用基于GC-O-GC聯(lián)用技術(shù)分析4個(gè)醋齡鎮(zhèn)江香醋揮發(fā)性成分的研究結(jié)果一致,表明乙酸是食醋中的主要風(fēng)味物質(zhì)。其中在2020年的祿豐香醋中異戊酸的含量為(8.19±0.58) μg/L,其余年份的含量都在9 μg/L以上,這與簡(jiǎn)東振等[26]的研究結(jié)果類似,表明異戊酸的產(chǎn)生會(huì)受到陳釀時(shí)間的影響。

醛類物質(zhì)是在酒精發(fā)酵階段或陳釀階段由醇或酸的縮合反應(yīng)產(chǎn)生的[27],占祿豐香醋香氣成分的6%～9%,其中異戊醛、苯乙醛、糠醛的含量較多。在陳釀過程中,糠醛、異戊醛的產(chǎn)生與氨基酸脫氨、脫羧有關(guān),其含量與陳釀時(shí)間相關(guān),苯乙醛的形成與氨基酸的代謝密切相關(guān)[28]。

醇類物質(zhì)是酵母作用下氨基酸的代謝物[29],占祿豐香醋香氣成分的11%～16%,其中乙醇、苯乙醇、2-甲基丁醇、2,3-丁二醇的含量較多,由大多數(shù)微生物分解糖苷類、氨基酸和脂肪酸產(chǎn)生,大多發(fā)生在酒精發(fā)酵階段[30]。祿豐香醋中的主要醇類物質(zhì)與張奶英[31]采用SPME-GC-MS技術(shù)分析四川麩醋發(fā)酵及陳釀過程中揮發(fā)性物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化的研究結(jié)果一致,2,3-丁二醇能增加祿豐香醋的香味,由于醇類物質(zhì)是在微生物的作用下產(chǎn)生的,醇類物質(zhì)的生成與釀造、陳釀過程中微生物的豐富度有關(guān)。

酯類物質(zhì)的生成主要在酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵以及陳釀階段,由醇與相應(yīng)的酸或輔酶縮合而成,其中酯的含量受水分含量和酯類前體物質(zhì)濃度的影響[32],占祿豐香醋香氣成分的12%～21%,其中乙酸苯乙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、2-羥基-4-甲基戊酸乙酯、丙位壬內(nèi)酯含量較多。酯類物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生令人愉悅的水果香味[33],對(duì)醋的香氣成分起到重要的影響作用。

酮類物質(zhì)是一種發(fā)酵副產(chǎn)物,在酒精和醋酸發(fā)酵過程中產(chǎn)生[34—35],占祿豐香醋香氣成分的3%～12%,其中2,3-丁二酮、2,3-戊二酮、2-丁酮、2-呋喃酮、2-甲基-3辛酮含量較多,它們對(duì)醋的香味成分有著重要的貢獻(xiàn),2,3-丁二酮也是山西陳醋中的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì),是關(guān)鍵風(fēng)味化合物吡嗪的前體[36—37]。

雜環(huán)類及酚類物質(zhì)在祿豐香醋中的含量較少,形成過程較復(fù)雜,大部分來自釀造的原料,其中六甲基環(huán)三硅氧烷的含量較高,可能會(huì)與其他物質(zhì)雜糅,賦予祿豐香醋獨(dú)特的風(fēng)味,這與王棟等[38]采用HS-SPME-GC技術(shù)對(duì)鎮(zhèn)江恒順香醋香氣成分進(jìn)行分析的結(jié)果類似。

2.3 不同年份祿豐香醋揮發(fā)性成分PCA及OPLS-DA分析

建立OPLS-DA對(duì)不同年份的祿豐香醋進(jìn)行分析比較,OPLS-DA模型中R2X和R2Y表示所建模型對(duì)X和Y矩陣的解釋率,Q2表示模型的預(yù)測(cè)能力,R2和Q2反映模型的好壞。由圖3可知,4組樣品之間有明顯的分開趨勢(shì),其中2017年、2018年聚為一類,表明這2組樣品中揮發(fā)性風(fēng)味化合物對(duì)祿豐香醋整體香氣貢獻(xiàn)相似,而2019年、2020年分開聚類,表明這2組樣品的風(fēng)味化合物對(duì)香氣總體貢獻(xiàn)不同于其他2組,可能與風(fēng)味物質(zhì)含量較多有關(guān)。由圖4可知,累計(jì)R2X(cum)=0.7,R2Y(cum) =1,Q2(cum)=0.982,累計(jì)R2X(cum)=0.706,R2Y(cum)=1,Q2(cum)=0.975,累計(jì)R2X(cum)=0.72,R2Y(cum)=0.999,Q2(cum)=0.976,表明不同年份的祿豐香醋OPLS-DA模型具有良好的穩(wěn)定性和較好的預(yù)測(cè)能力。

圖3 不同年份祿豐香醋揮發(fā)性成分PCA圖

圖4 不同年份祿豐香醋揮發(fā)性成分OPLS-DA圖

2.4 不同年份祿豐香醋揮發(fā)性成分VIP 分析

由圖5可知,變量投影重要性(VIP)可以量化OPLS-DA的每個(gè)變量對(duì)各組樣本分類的判別,當(dāng)VIP>1時(shí),表明對(duì)組間分離具有重要貢獻(xiàn),其值越大,變量在不同年份祿豐香醋組間的差異性越明顯。通過分析,共篩選出12種代謝物作為潛在的揮發(fā)性特征標(biāo)志物,包括酮類2種、酯類4種、醇類1種、酸類3種、醛類2種,與史玉等[39]的研究結(jié)果類似。其中,酯類物質(zhì)的種類較多,酯類物質(zhì)一般具有令人愉悅的水果香味,對(duì)原醋最終的風(fēng)味有著極顯著的影響[40]。其次是酸類物質(zhì),它與其他成分相互作用、相互調(diào)節(jié),共同構(gòu)成祿豐香醋獨(dú)特的風(fēng)味[41]。

3 結(jié)論

本研究分析和比較了不同年份祿豐香醋的理化特性和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。結(jié)果表明,不同年份祿豐香醋的還原糖含量和總酸含量無顯著性差異,pH、氨基酸態(tài)氮含量存在差異。4個(gè)不同年份的樣品中共檢測(cè)到120種化合物,包括9種醇類物質(zhì)、21種醛類物質(zhì)、7種酸類物質(zhì)、24種酯類物質(zhì)、17種酮類物質(zhì)、7種酚類物質(zhì)、11種烷烴類物質(zhì)、3種烯烴類物質(zhì)以及21種雜環(huán)類物質(zhì),各組分含量占比存在差異,但組分含量最多的包括乙酸、異戊酸、異戊醛、苯乙醛、糠醛、乙醇、苯乙醇、2-甲基丁醇、2,3-丁二醇、乙酸苯乙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、2-羥基-4-甲基戊酸乙酯、丙位壬內(nèi)酯、2,3-丁二酮、2,3-戊二酮、2-丁酮、2-呋喃酮以及2-甲基-3辛酮。PLS-DA結(jié)合VIP值判斷乙醇、2,3-丁二酮、異戊酸、苯乙醛、乙酸乙酯、乙酸異戊酯是造成不同年份祿豐香醋風(fēng)味差異的物質(zhì)。