蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素合成代謝網(wǎng)絡(luò)及其關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的研究進(jìn)展

曾家鵬，呂夢(mèng)迪，鄭倩望，林俊芳，葉志偉，魏韜

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510642）

蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris）又稱蟲(chóng)草花、北冬蟲(chóng)夏草，是蟲(chóng)草科、蟲(chóng)草屬真菌，是一種在東亞地區(qū)受到廣泛歡迎的食藥用真菌。蛹蟲(chóng)草在我國(guó)分布廣泛，野生的蛹蟲(chóng)草以寄生為主，常寄生于鱗翅目幼蟲(chóng)的繭和蛹上或者寄生于昆蟲(chóng)上，產(chǎn)生子座（子實(shí)體部分）形成蟲(chóng)蛹復(fù)合物，而其子實(shí)體是蛹蟲(chóng)草主要食藥用部位。蛹蟲(chóng)草中含有高豐度的蟲(chóng)草素（Cordycepin）、多糖、蟲(chóng)草酸等多種生物活性物質(zhì)，它們所具有的藥理特性使蛹蟲(chóng)草的應(yīng)用場(chǎng)景從食品行業(yè)擴(kuò)大到醫(yī)療保健品、醫(yī)藥行列中。蟲(chóng)草素作為蛹蟲(chóng)草產(chǎn)生的核心價(jià)值成分之一，也是重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有抗癌、抗腫瘤、抗病毒等多種生物活性功能。目前蟲(chóng)草素的原材料主要通過(guò)蛹蟲(chóng)草液體靜置發(fā)酵后提取純化獲得，相關(guān)菌種選育工作仍停留在采用自然選育等傳統(tǒng)研究策略的階段。經(jīng)過(guò)40余年的發(fā)展，蛹蟲(chóng)草子實(shí)體培養(yǎng)、液體靜置發(fā)酵技術(shù)已經(jīng)得到了較好的發(fā)展，但隨著工業(yè)化與產(chǎn)業(yè)化蟲(chóng)草素的需求逐漸增大，獲得高產(chǎn)蟲(chóng)草素的蛹蟲(chóng)草菌株成為了更高效、更可靠的途徑。近年，隨著組學(xué)分析技術(shù)和食用菌基因組編輯技術(shù)的發(fā)展，蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素代謝途徑得到了不同程度的解析，這為構(gòu)建蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素合成代謝網(wǎng)絡(luò)以及蛹蟲(chóng)草代謝工程的理性改造提供了研究基礎(chǔ)。因此，本綜述對(duì)目前已知的蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素合成代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了模塊化梳理，將其劃分為中心碳代謝途徑、單磷酸肌苷（Inosinate，IMP）途徑和蟲(chóng)草素底物合成途徑，并分析了前體物質(zhì)組成和多個(gè)分散途徑、關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)對(duì)蟲(chóng)草素合成的影響，系統(tǒng)闡述了IMP物質(zhì)的合成與流向，佐證了IMP的合成與代謝是蟲(chóng)草素合成的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，旨在為蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素代謝工程改造提供理論支持。

1 蟲(chóng)草素基本概述

蟲(chóng)草素又稱蛹蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草菌素，化學(xué)名為3'-脫氧腺苷，分子式為C10H13N5O3，最早于1951年由Bentley等[1]從蛹蟲(chóng)草中分離獲得。過(guò)往研究發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)草素具有多種生物活性功能，因而是蟲(chóng)草屬真菌所產(chǎn)生的最具價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物之一[2]。蟲(chóng)草素通過(guò)阻斷mRNA的延長(zhǎng)影響細(xì)胞周期正常運(yùn)轉(zhuǎn)，導(dǎo)致白血病、乳腺癌等疾病中的病變細(xì)胞凋亡（圖1a），從而表現(xiàn)出較好的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值[3]；蟲(chóng)草素還可通過(guò)抑制NF-κB途徑，激活蛋白酶B和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶，起到抗光老化的作用（圖1b）[4,5]?；谙嗤钄嘧饔茫x(chóng)草素可抑制病毒復(fù)制（圖1d）[6,7]。此外，蟲(chóng)草素還被發(fā)現(xiàn)可通過(guò)與LigA DNA連接酶的強(qiáng)結(jié)合作用，顯著抑制梭狀芽胞桿菌等腸道致病菌的增殖，卻不會(huì)對(duì)雙歧桿菌、植物乳桿菌等益生菌的增殖造成影響（圖1e）[6]，符合我國(guó)大健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需求?；谖付咀饔玫葷撛跈C(jī)制，蟲(chóng)草素還可對(duì)小菜蛾等夜蛾科的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)起到較強(qiáng)的殺滅作用（圖1f）[6]，有被開(kāi)發(fā)為針對(duì)草地貪夜蛾、甜菜夜蛾等其他種類農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的生防制劑的潛能。隨著市場(chǎng)上以蟲(chóng)草素為核心成分的保健產(chǎn)品逐漸被開(kāi)發(fā)，蟲(chóng)草素的價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)格近年來(lái)逐步攀升。目前，市場(chǎng)上純度為90%以上的蟲(chóng)草素的原料價(jià)格已高達(dá)25 000元/kg。

圖1 蟲(chóng)草素多樣化的生物學(xué)活性功能Fig.1 The biological activity function of cordycepin diversity

目前獲得蟲(chóng)草素的原材料主要有兩個(gè)途徑，一是化學(xué)合成，二是生物原材料提取。其中，化學(xué)合成法最早由Raylo化學(xué)有限公司于2000年成功開(kāi)發(fā)[8]。由于存在分離手段復(fù)雜、生物活度低、底物利用率低（僅為20%）等問(wèn)題，該法難以滿足原料市場(chǎng)的需求[9]。目前已知可天然合成蟲(chóng)草素的物種有蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris）[10,11]、九州蟲(chóng)草（Cordeceps kyusyuensis）[12,13]、雪峰蟲(chóng)草（Ophiocordyceps xuefengensis）[14,15]等。其中，目前對(duì)雪峰蟲(chóng)草轉(zhuǎn)錄組分析并沒(méi)有找到所有與蟲(chóng)草素生物合成途徑相關(guān)的基因[16]。蛹蟲(chóng)草在《衛(wèi)生部關(guān)于批準(zhǔn)蛹蟲(chóng)草為新資源食品的公告（2009年第3號(hào)）》和《關(guān)于批準(zhǔn)塔格糖等6種新食品原料的公告（2014年第10號(hào)）》中被認(rèn)定為新資源食品和新食品原料。同時(shí)，相關(guān)研究表明蛹蟲(chóng)草基因組中未發(fā)現(xiàn)任何對(duì)人有毒的霉菌毒素基因[17]，證實(shí)了其作為食品的安全性和可食用性。此外，在下表中展示了現(xiàn)有報(bào)道的蟲(chóng)草素發(fā)酵產(chǎn)量（見(jiàn)表1），不難發(fā)現(xiàn)，在靜置發(fā)酵的條件下，蛹蟲(chóng)草菌株蟲(chóng)草素產(chǎn)量最高可達(dá)6.84 g/L。相較于需要精密高密度發(fā)酵設(shè)備以及存在高額電費(fèi)、補(bǔ)料培養(yǎng)基費(fèi)用的常見(jiàn)代謝工程模式菌種[18]，蛹蟲(chóng)草在蟲(chóng)草素產(chǎn)量、生產(chǎn)成本、操作簡(jiǎn)便度等方面均具有較大的工業(yè)化生產(chǎn)潛力。目前，包括知名化學(xué)試劑供應(yīng)商Sigma和中國(guó)藥品生物制品檢定所所生產(chǎn)的蟲(chóng)草素產(chǎn)品，均是從蛹蟲(chóng)草中提取獲得[19]。

表1 現(xiàn)有報(bào)道的蟲(chóng)草素發(fā)酵產(chǎn)量Table 1 Fermentation yield of cordycepin in current studies

過(guò)往受制于寄生宿主的數(shù)目和生長(zhǎng)環(huán)境的特殊性，天然的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體是難以獲得的。直到80年代末，人工培養(yǎng)蛹蟲(chóng)草才獲得成功[19]。其后經(jīng)過(guò)40余年的發(fā)展，培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件等參數(shù)得到完善[32,33]，靜置菌絲體發(fā)酵、振蕩菌絲體發(fā)酵、固體子實(shí)體培養(yǎng)等多種蛹蟲(chóng)草人工培養(yǎng)技術(shù)趨于成熟[34,35]。至2015年，我國(guó)蛹蟲(chóng)草大規(guī)模工廠化種植產(chǎn)量已達(dá)到7.4萬(wàn)t[36]，并形成了全球75%的蛹蟲(chóng)草相關(guān)專利。

蛹蟲(chóng)草子實(shí)體是作為終端商品銷售的主要形式，但其栽培過(guò)程存在培養(yǎng)周期長(zhǎng)、培養(yǎng)基配制成本高、光照培養(yǎng)周期切換模式復(fù)雜等問(wèn)題[37]。利用人工栽培的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體來(lái)提取蟲(chóng)草素的綜合成本仍較高。而蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵技術(shù)在維持接近室溫的恒溫條件下培養(yǎng)處于菌絲體狀態(tài)的蛹蟲(chóng)草，具有培養(yǎng)基配制成本低、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、培養(yǎng)周期短、不涉及光照周期誘導(dǎo)“菌絲體-子實(shí)體”生長(zhǎng)形態(tài)切換等優(yōu)點(diǎn)，可在較短時(shí)間內(nèi)高效生產(chǎn)蟲(chóng)草素。因此，蛹蟲(chóng)草液體靜置發(fā)酵是目前蟲(chóng)草素原料的主要獲得方式。

為了進(jìn)一步提高蛹蟲(chóng)草的蟲(chóng)草素合成效率，蟲(chóng)草素合成代謝網(wǎng)絡(luò)的解析至關(guān)重要。1976年，Kunhorm等[38]利用基于[U-14C]腺苷和[3-3H]的同位素示蹤法分析了蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素上游生物合成路徑，明確了腺苷是蟲(chóng)草素合成的關(guān)鍵前體物。其后，Zheng等[17]在2011年首次對(duì)蛹蟲(chóng)草進(jìn)行了全基因組序列測(cè)定及標(biāo)注，CM01菌株從此成為蛹蟲(chóng)草基因組研究的模式株系。在此基礎(chǔ)上，有學(xué)者[39,40]不僅通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、蛋白質(zhì)組測(cè)定、代謝組測(cè)定等多種組學(xué)方法，獲得了以葡萄糖、木糖等基礎(chǔ)性碳源為前體的蟲(chóng)草素上游及中游合成途徑，還通過(guò)構(gòu)建光響應(yīng)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，驗(yàn)證了光對(duì)蟲(chóng)草素合成關(guān)鍵基因的影響。然而即便如此，從腺苷到蟲(chóng)草素的關(guān)鍵底物合成途徑在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)仍是未知的。直到2017年，Xia等[10]通過(guò)在蛹蟲(chóng)草中進(jìn)行基因敲除，并結(jié)合靶DNA序列在酵母中的異源表達(dá)等多種策略，才完成了以腺苷為前體的蟲(chóng)草素底物通道解析，成功補(bǔ)完蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素合成代謝網(wǎng)絡(luò)。

隨著代謝工程與合成生物學(xué)的發(fā)展，基于天然合成代謝網(wǎng)絡(luò)的自上而下的菌株改造研究已成為熱點(diǎn)。近年來(lái)，以蛹蟲(chóng)草為材料的DNA元件挖掘、基因編輯技術(shù)及基因組代謝模型的開(kāi)發(fā)已取得一定程度的進(jìn)步[41-43]。這使得基于蛹蟲(chóng)草和蟲(chóng)草素為核心的代謝工程研究成為可能。而在代謝工程研究中，代謝網(wǎng)絡(luò)的模塊化分割是協(xié)助理解和后續(xù)改造的核心底層策略。其中，模塊間及模塊內(nèi)部引起前體物質(zhì)分流的分散途徑、反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的作用位點(diǎn)、易受培養(yǎng)條件改變所影響的柔性節(jié)點(diǎn)等，都是菌種改造中的關(guān)鍵目標(biāo)。本綜述結(jié)合過(guò)往大量的蟲(chóng)草素合成代謝網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，首次結(jié)合代謝工程策略，對(duì)蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素合成代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行人為分割，并針對(duì)各個(gè)分隔模塊及其中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析和闡述，并對(duì)其未來(lái)的改造工作進(jìn)行了展望。

2 蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素合成代謝網(wǎng)絡(luò)解析

根據(jù)現(xiàn)有的大量蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素合成代謝網(wǎng)絡(luò)研究結(jié)果，本綜述將蟲(chóng)草素合成代謝網(wǎng)絡(luò)分為3個(gè)模塊進(jìn)行闡述（圖2），分別是中心碳代謝途徑（紅色）、IMP途徑（藍(lán)色）和蟲(chóng)草素底物合成途徑（金色）。

圖2 蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素合成代謝網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Cordycepin metabolic network in C.militaris

2.1 中心碳代謝途徑

現(xiàn)有研究表明，蛹蟲(chóng)草可利用多種糖類分子，如葡萄糖、木糖、核糖等作為前體，經(jīng)由糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑等途徑，最終轉(zhuǎn)化形成蟲(chóng)草素[39,44]。參照代謝工程細(xì)分學(xué)科的慣用命名方式，我們將蛹蟲(chóng)草以葡萄糖、核糖和木糖為碳源進(jìn)行分解代謝獲得5-磷酸核糖的過(guò)程，命名為中心碳代謝途徑[45]。

2.1.1 糖酵解途徑

現(xiàn)有大量研究結(jié)果顯示，蟲(chóng)草素合成代謝途徑的初始前體為葡萄糖[39,44]。葡萄糖被轉(zhuǎn)運(yùn)至蛹蟲(chóng)草胞內(nèi)，經(jīng)磷酸化反應(yīng)生成6-磷酸葡萄糖。形成6-磷酸葡萄糖后，其有兩個(gè)流向，一部分進(jìn)入了磷酸戊糖途徑，另一部分6-磷酸葡萄糖經(jīng)磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸果糖（Fructose-6-Phosphate，F(xiàn)6P）。F6P進(jìn)一步磷酸化生成1,6-二磷酸果糖后，酶催化生成3-磷酸甘油醛，再通過(guò)糖酵解途徑中的唯一一個(gè)脫氫反應(yīng)，氧化為1,3-二磷酸甘油酸。1,3-二磷酸甘油酸脫去磷酸基形成3-磷酸甘油酸，并經(jīng)過(guò)基團(tuán)轉(zhuǎn)移形成2-磷酸甘油酸。2-磷酸甘油酸脫水形成磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvate，PEP），PEP在丙酮酸激酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)楸幔M(jìn)入三羧酸循環(huán)，為蛹蟲(chóng)草細(xì)胞生長(zhǎng)提供能量。

2.1.2 磷酸戊糖途徑

在糖酵解途徑中間生成的另一部分6-磷酸葡萄糖進(jìn)入了磷酸戊糖途徑，并且進(jìn)行脫氫生成6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯，并進(jìn)一步水解生成6-磷酸葡糖酸。以NADP+作為氧化反應(yīng)受體，6-磷酸葡糖酸氧化脫羧生成5-磷酸核糖。

除了葡萄糖向5-磷酸核糖的多步驟直接轉(zhuǎn)化外，蛹蟲(chóng)草還可以從外界吸收核糖，并通過(guò)一步磷酸化反應(yīng)，直接轉(zhuǎn)化為磷酸戊糖途徑的中間產(chǎn)物5-磷酸核糖[39]。此外，Raethong等[46]研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲(chóng)草可從外界吸收木糖，經(jīng)過(guò)木糖醇脫氫酶、木酮糖激酶等催化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化獲得另一磷酸戊糖代謝途徑的中間代謝產(chǎn)物5-磷酸核酮糖（Ribulose 5-Phosphate，RL5P）。雖然以木糖作為前體時(shí)，蛹蟲(chóng)草生長(zhǎng)受限，生物量相比以葡萄糖為碳源時(shí)較低，但是蟲(chóng)草素產(chǎn)量顯著提高[46]。這一結(jié)果提示，轉(zhuǎn)化步驟更少、分支途徑更少、代謝流通量更為集中的蟲(chóng)草素合成途徑，可能具備更高的蟲(chóng)草素合成效率。

2.2 IMP途徑

本綜述將上游的磷酸戊糖途徑代謝產(chǎn)物5-磷酸核糖逐步轉(zhuǎn)化為單磷酸肌苷的過(guò)程，以及下游的IMP代謝分散途徑，統(tǒng)稱為IMP途徑。IMP經(jīng)多步轉(zhuǎn)化，可形成腺苷，進(jìn)入蟲(chóng)草素底物合成途徑。而IMP在形成腺苷的同時(shí)，還可能被分流至GTP合成途徑和肌苷合成途徑。因此，掌握IMP途徑的代謝分流情況，有助于通過(guò)改造其分支途徑提高蟲(chóng)草素合成水平。

磷酸戊糖途徑的產(chǎn)物5-磷酸核糖，在酶的作用下生成5-磷酸核糖-1-焦磷酸，再與谷胺酰胺反應(yīng)生成5-磷酸核糖胺[17,39]。5-磷酸核糖胺由ATP供能，與甘氨酸結(jié)合生成甘氨酰胺核糖核苷酸。甘氨酰胺核糖核苷酸經(jīng)甲?；杉柞８拾滨０泛颂呛塑账?，并由谷氨酰胺提供酰胺基及由ATP供能，轉(zhuǎn)變?yōu)榧柞８拾彪吆颂呛塑账幔‵ormylglycinamidine Ribonucleotide，F(xiàn)GAM）。FGAM同樣在ATP存在的條件下，經(jīng)氨基咪唑核糖核苷酸酶的的作用轉(zhuǎn)變?yōu)?-氨基咪唑核糖核苷酸（5-Aminoimidazole Ribonucleotide，AIR）。AIR在咪唑環(huán)上進(jìn)一步裝配嘌呤第二個(gè)環(huán)，生成羧基氨基咪唑核糖核苷酸后，進(jìn)一步反應(yīng)生成N-琥珀酸-5-氨基咪唑-4-羧胺核糖核苷酸（N-succino-5-Aminoimidazole-4-Carboxamide，SAICAR）。SAICAR脫去延胡索酸，生成5-氨基咪唑-4-羧酰胺核糖核苷酸（5-Aminoimidazole-4-Carboxamide Ribonucleotide，AICAR），并經(jīng)甲?；?-氨基咪唑-4-甲酰胺-核糖酸（N-Formanidoimidazole-4-Carboxamide Ribonucleotide，F(xiàn)AICAR）。FAICAR在次黃嘌呤核苷酸合酶作用下脫水環(huán)化生成單磷酸肌苷。

IMP合成后，分別進(jìn)入腺苷酸琥珀酸、肌苷和黃苷酸（Xanthylic Acid，XMP）三條分散途徑[44,47]。在單磷酸黃苷（Xanthoside Monophosphate，XMP）途徑中，IMP轉(zhuǎn)化為XMP后，會(huì)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為單磷酸鳥(niǎo)苷（Guanosine Monophosphate，GMP）和二磷酸鳥(niǎo)苷（Guanosine Diphosphate，GDP），并最終被轉(zhuǎn)化為三磷酸鳥(niǎo)苷（Guanosine Triphosphate，GTP）。由于GTP是細(xì)胞內(nèi)部的能源物質(zhì)，為蛋白合成等生理生化反應(yīng)供能，無(wú)法作為底物直接參與蟲(chóng)草素的合成。因此，XMP途徑是蟲(chóng)草素合成途徑的旁支途徑，將分流部分前體IMP。此外，IMP可轉(zhuǎn)化為腺苷酸琥珀酸，并最終在蟲(chóng)草素底物通道的催化下，轉(zhuǎn)化為蟲(chóng)草素。IMP還可被轉(zhuǎn)化為肌苷。由于肌苷可重新被轉(zhuǎn)化為IMP，形成循環(huán)環(huán)路，因此肌苷途徑在蟲(chóng)草素合成代謝網(wǎng)絡(luò)中起到“蓄水池”的作用，并不會(huì)分流IMP。

2.3 蟲(chóng)草素底物合成途徑

在真核生物基因組中，物理距離上鄰近的合成基因簇并不常見(jiàn)，而cns123基因簇均處在蛹蟲(chóng)草第Ⅶ號(hào)染色體的1707816至1717012區(qū)間內(nèi)，其編碼的酶蛋白可最終將腺苷轉(zhuǎn)化為蟲(chóng)草素。因此，我們將腺苷至蟲(chóng)草素的多反應(yīng)催化步驟合稱為“蟲(chóng)草素底物合成途徑”。

在上述提到的IMP的其中一條分散途徑中，IMP將與天冬氨酸結(jié)合，并在XMP途徑最終轉(zhuǎn)化生成的GTP供給能量的情況下，生成了腺苷酸琥珀酸，并進(jìn)一步反應(yīng)生成單磷酸腺苷（Adenosine Monophosphate，AMP）。除了來(lái)源于腺苷酸琥珀酸，AMP還可以由ATP轉(zhuǎn)化為二磷酸腺苷（Adenosine Diphosphate，ADP）后，再進(jìn)一步脫去磷酸基團(tuán)生成。在此過(guò)程中，磷酸基團(tuán)從ATP上二次脫離釋放的能量，也可為腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)激酶促進(jìn)ADP向AMP的轉(zhuǎn)變供能。AMP經(jīng)可逆酶促反應(yīng)生成腺苷和腺嘌呤，而后再度進(jìn)入分散途徑。生成的腺苷可分別轉(zhuǎn)化為肌苷、噴司他丁和3'-AMP。3'-AMP由Cns3蛋白的NK結(jié)構(gòu)域催化獲得，后經(jīng)Cns2轉(zhuǎn)化生成2'-C-3'-dA，再經(jīng)Cns1轉(zhuǎn)化獲得蟲(chóng)草素。Cns3的HisG結(jié)構(gòu)域則完成另一反應(yīng)，將腺苷轉(zhuǎn)化為噴司他丁?；舸杭t等[48]通過(guò)異源表達(dá)Cns1和Cns2、陳柏雄等[49]通過(guò)敲除Cns1-3基因簇，驗(yàn)證了Cns1-3對(duì)蟲(chóng)草素合成的關(guān)鍵作用。

3 蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素代謝工程改造關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)

現(xiàn)有研究表明，通過(guò)改變培養(yǎng)條件中的單一因素，即可顯著改變蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素的產(chǎn)量[44,50]。這一發(fā)酵表征提示，蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素合成代謝網(wǎng)絡(luò)易受外部條件擾動(dòng)，因而可能存在柔性節(jié)點(diǎn)和關(guān)鍵的代謝節(jié)點(diǎn)。依照現(xiàn)有的代謝工程策略，目標(biāo)產(chǎn)物的代謝網(wǎng)絡(luò)中常見(jiàn)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)主要包括限速步驟、分流節(jié)點(diǎn)和反饋抑制節(jié)點(diǎn)等。然而，蛹蟲(chóng)草本身具有極易退化、魯棒性較差的特點(diǎn)，會(huì)造成的代謝流分析結(jié)果不穩(wěn)定、通過(guò)異源基因表達(dá)難驗(yàn)證等問(wèn)題。因此，目前尚難以確定蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素代謝網(wǎng)絡(luò)中的限速步驟。相對(duì)而言，基于組學(xué)分析所得的分流節(jié)點(diǎn)和反饋節(jié)點(diǎn)較為明確，本文將其視為蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素合成代謝網(wǎng)絡(luò)中潛在的關(guān)鍵改造節(jié)點(diǎn)。

3.1 分流節(jié)點(diǎn)

3.1.1 前體物質(zhì)組成的分流效應(yīng)

除以葡萄糖為前體外，核糖（Ribose）、木糖（Xylose）等多種單糖也可作為蛹蟲(chóng)草合成蟲(chóng)草素的前體[39,46]。這一相對(duì)較寬的前體譜可能與蛹蟲(chóng)草自然生境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成分的復(fù)雜性是對(duì)應(yīng)的。然而，多樣化的前體譜可能同時(shí)造成更多的副反應(yīng)終端產(chǎn)物積累、非必須合成代謝負(fù)擔(dān)和關(guān)鍵合成途徑通量下降，這對(duì)于提高蟲(chóng)草素產(chǎn)量的目標(biāo)是不利的。換句話說(shuō)，多樣化的前體、轉(zhuǎn)化步驟冗余復(fù)雜的前體，都會(huì)在蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素合成代謝網(wǎng)絡(luò)的源頭上造成不必要的分流，這也提示了，阻斷代謝負(fù)荷較大的前體途徑，或提高核心前體途徑的通量，有望減少菌體代謝負(fù)擔(dān)，提高蟲(chóng)草素的單位產(chǎn)量。

3.1.2 IMP分流節(jié)點(diǎn)

SAICAR經(jīng)酶促反應(yīng)獲得的AICAR，是蟲(chóng)草素關(guān)鍵前體物質(zhì)IMP的前體。但是，現(xiàn)有研究也表明，在培養(yǎng)基中添加的多種氨基酸被轉(zhuǎn)化為組氨酸后，可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化生成AICAR，參與蟲(chóng)草素的合成[22]。因此，AICAR的合成是由多種前體物質(zhì)匯聚得到的。

當(dāng)AICAR經(jīng)兩步反應(yīng)被轉(zhuǎn)化為IMP后，由于IMP會(huì)進(jìn)入三條分散途徑，且僅有部分IMP會(huì)被用于蟲(chóng)草素的合成，因此本綜述將5-磷酸核糖經(jīng)多步反應(yīng)轉(zhuǎn)化進(jìn)入三條分散途徑的整體途徑模塊重命名為IMP途徑。三條分散途徑中，XMP途徑合成供能物質(zhì)，與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)；腺苷酸琥珀酸途徑經(jīng)多步反應(yīng)轉(zhuǎn)化為蟲(chóng)草素，是蟲(chóng)草素底物合成途徑的上游核心途徑；肌苷途徑內(nèi)部循環(huán)，并不與細(xì)胞生長(zhǎng)或蟲(chóng)草素合成直接相關(guān)，因此，IMP是蟲(chóng)草素合成的一個(gè)關(guān)鍵分流節(jié)點(diǎn)。

而在宏觀發(fā)酵層面，蛹蟲(chóng)草的細(xì)胞生長(zhǎng)與蟲(chóng)草素合成已被證實(shí)是部分偶聯(lián)關(guān)系[51]。在菌絲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，蟲(chóng)草素合成較為緩慢；待細(xì)胞干重越過(guò)峰值拐點(diǎn)后，腺苷、IMP等前體物質(zhì)快速消耗，蟲(chóng)草素快速積累[24,44]。這一特性提示，在菌絲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，蛹蟲(chóng)草可能采取了優(yōu)先保證菌絲生長(zhǎng)的策略，將大部分IMP分流至GMP途徑；而在對(duì)數(shù)期結(jié)束后，細(xì)胞整體代謝轉(zhuǎn)為以蟲(chóng)草素合成為主。然而，目前三條分散途徑在不同培養(yǎng)方式、不同培養(yǎng)時(shí)間時(shí)的代謝流通量及變化機(jī)制尚屬未知。

3.2 反饋節(jié)點(diǎn)

3.2.1 IMP的雙重反饋抑制機(jī)制

在XMP途徑中，XMP作為IMP轉(zhuǎn)化獲得GTP的中間產(chǎn)物，會(huì)抑制IMP環(huán)化脫水酶活性，從而抑制IMP的合成（圖3）[52]。此外，高豐度的谷氨酰胺也會(huì)進(jìn)一步抑制IMP脫水酶GuaB的活性，使得XMP無(wú)法轉(zhuǎn)化為GMP，鎖死IMP的合成，從而減少蟲(chóng)草素的合成[52]。由于上述雙重反饋抑制機(jī)制是由蛹蟲(chóng)草天然演化獲得的，且三大分散途徑分別與細(xì)胞生長(zhǎng)和次級(jí)代謝產(chǎn)物合成有關(guān)，因此推測(cè)IMP的合成與代謝可能是蛹蟲(chóng)草調(diào)節(jié)自身蟲(chóng)草素合成速率的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[1]。

圖3 蛹蟲(chóng)草IMP分散途徑分子調(diào)節(jié)機(jī)制圖Fig.3 Molecular regulation mechanism of IMP dispersion pathway in C.militaris

此外，現(xiàn)有研究表明，人、酵母等物種中，IMP環(huán)化脫水酶為IMP途徑中的關(guān)鍵限速步驟[53,54]。但由于缺少代謝流檢測(cè)、異源表達(dá)等實(shí)驗(yàn)證明，該結(jié)論尚未在蛹蟲(chóng)草得到驗(yàn)證。

3.2.2 蟲(chóng)草素合成的Protector-Protégé反饋機(jī)制

在蛹蟲(chóng)草生長(zhǎng)周期的大部分時(shí)間里，噴司他丁在胞內(nèi)通過(guò)抑制脫氨酶的活性，保證蟲(chóng)草素的合成及其在胞內(nèi)的低豐度存在[10,55]。現(xiàn)有研究表明，蛹蟲(chóng)草合成所得的蟲(chóng)草素，大部分會(huì)排至胞外，因此胞內(nèi)蟲(chóng)草素濃度相對(duì)較低。但當(dāng)蛹蟲(chóng)草胞內(nèi)蟲(chóng)草素積累過(guò)多，產(chǎn)生胞內(nèi)毒性時(shí)，細(xì)胞啟動(dòng)對(duì)噴司他丁的外排[10]。隨著胞內(nèi)噴司他丁含量的下降，脫氨酶活性恢復(fù)，脫去蟲(chóng)草素的氨基并轉(zhuǎn)化獲得3'-dl，從而降低蟲(chóng)草素胞內(nèi)含量過(guò)高所產(chǎn)生的胞內(nèi)毒性[1]。蛹蟲(chóng)草利用噴司他丁調(diào)節(jié)蟲(chóng)草素胞內(nèi)濃度的機(jī)制，與抗生鏈霉菌中的機(jī)制相似，被稱為Protector-Protégé機(jī)制[10]。

分別由IMP和腺苷轉(zhuǎn)化得到的肌苷，既可經(jīng)酶促反應(yīng)生成次黃嘌呤（Hypoxanthine），也可由次黃嘌呤重新轉(zhuǎn)化為腺苷，并最終合成蟲(chóng)草素[39]。由于尚未有確切的代謝流分析數(shù)據(jù)表明肌苷轉(zhuǎn)化所得的次黃嘌呤和腺苷的比例，因此上述分散途徑仍可被視為前體途徑。

3.3 蟲(chóng)草素底物合成途徑中的多反應(yīng)動(dòng)態(tài)平衡

在IMP轉(zhuǎn)化獲得蟲(chóng)草素的多步反應(yīng)中，AMP與腺苷、腺苷與腺嘌呤（Adenine）、肌苷與腺苷等物質(zhì)之間的轉(zhuǎn)化均為可逆反應(yīng)[39]。然而同樣的是，此類途徑信息是由組學(xué)比對(duì)分析所得到的。在缺乏代謝流檢測(cè)、基因敲除、異源表達(dá)等實(shí)驗(yàn)結(jié)果的情況下，上述可逆反應(yīng)在蛹蟲(chóng)草中的平衡偏好性是未知的。這些可逆反應(yīng)的存在，造成了蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素合成網(wǎng)絡(luò)的魯棒性低下。在培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件出現(xiàn)變化時(shí)，前體合成途徑中的多步反應(yīng)都可能成為柔性節(jié)點(diǎn)，從而使得代謝流變化較大。這一情況在生產(chǎn)工藝的擴(kuò)大化和異地重現(xiàn)方面是不利的。因此，簡(jiǎn)化蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素底物合成途徑，增大核心途徑的通量，可能是構(gòu)建穩(wěn)定高產(chǎn)的產(chǎn)蟲(chóng)草素蛹蟲(chóng)草菌株的重要方式。

4 結(jié)論與展望

蟲(chóng)草素現(xiàn)已被證實(shí)具有抗病毒、抗癌、抗腫瘤等多種生物活性功能，是蟲(chóng)草屬真菌最受關(guān)注的次級(jí)代謝產(chǎn)物。本綜述對(duì)蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了模塊化，劃分為中心碳代謝途徑、IMP途徑和蟲(chóng)草素底物合成途徑3個(gè)模塊，并對(duì)每個(gè)模塊進(jìn)行了分段式闡述，細(xì)致描繪和分析了蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素代謝網(wǎng)絡(luò)的代謝流走向。此外，本文還對(duì)蟲(chóng)草素代謝網(wǎng)絡(luò)中的多個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，如分流節(jié)點(diǎn)和反饋節(jié)點(diǎn)進(jìn)行了深入的剖析，為蛹蟲(chóng)草代謝工程改造提供理論性指引。

隨著根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、split-marker、CRISPR-Cas9等蛹蟲(chóng)草基因組編輯技術(shù)的建立，蛹蟲(chóng)草基因組精準(zhǔn)編輯已成為了可能，這也為繼續(xù)深入探究及改造蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素代謝網(wǎng)絡(luò)鋪平了道路。前期同位素示蹤及組學(xué)研究中獲得的蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素合成代謝網(wǎng)絡(luò)中上游潛在基因靶點(diǎn)，均可利用新近開(kāi)發(fā)的蛹蟲(chóng)草CRISRP-Cas9-TRAMA基因組編輯技術(shù)，通過(guò)典型的“三部曲”基因功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（靶基因的敲除、過(guò)表達(dá)和回補(bǔ)）進(jìn)行“基因型-表型”關(guān)系分析。而通過(guò)迭代基因編輯，有望構(gòu)建高產(chǎn)蟲(chóng)草素或其他腺苷衍生物的蛹蟲(chóng)草工程菌株，從而發(fā)揮蛹蟲(chóng)草液體靜置培養(yǎng)體系的生產(chǎn)成本及操作簡(jiǎn)便性優(yōu)勢(shì)，將蛹蟲(chóng)草進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成新型食品安全級(jí)的細(xì)胞工廠。