分枝桿菌對硝基苯甲酸實驗及其鑒別分枝桿菌的分子機制研究進展

李月 夏輝 李馬超 王瑞白

結核病是一種主要由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)感染引起的傳染性疾病,目前在全球范圍內(nèi)仍是一個重大的健康威脅。2021年約有1060萬例新發(fā)患者和160萬例死亡患者。新增患者例數(shù)和死亡例數(shù)相比2020年的1000萬和150萬均有所增加[1-2]。分枝桿菌的傳統(tǒng)分類中,除結核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌外,其余的分枝桿菌統(tǒng)稱為非結核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria,NTM)。近幾十年來,由于對NTM認知度的提高、合并HIV感染發(fā)病率的上升,以及實驗室檢測技術和診斷方法的顯著改進,NTM感染在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率不斷上升,也已經(jīng)成為一個重要的公共衛(wèi)生問題[3]。由于NTM感染在臨床表現(xiàn)、細菌學、病理學等方面與結核病相似,但NTM和MTB對抗結核藥物的敏感性差異顯著,因此,臨床治療方案和管理不盡相同。盡早、準確地進行MTB和NTM的鑒別診斷可有效治療疾病,降低疾病負擔。

1964年,Tsukamura和Tsukamora研發(fā)了對硝基苯甲酸(4-nitrobenzoic acid, PNB)和噻吩-2-羧酸聯(lián)氨(thiophene-2-carboxylic acid hydrazine,TCH)選擇性培養(yǎng)基用于分枝桿菌的鑒別[4-5],依據(jù)培養(yǎng)結果可將分枝桿菌分為牛型MTB、人型MTB和NTM三類[6]。在兩種培養(yǎng)基上的生長情況分別為:牛型MTB PNB(陰性)/TCH(陰性)、人型MTB PNB(陰性)/TCH(陽性)和NTM PNB(陽性)/TCH(陽性)。作為一種操作簡單、成本低廉和技術可靠的檢測方法,PNB/TCH實驗被臨床廣泛應用于分枝桿菌的鑒別,尤其是在廣大發(fā)展中國家或缺乏分子生物學菌種鑒定能力的實驗室中。在我國,PNB/TCH實驗被納入《全國結核病細菌學檢驗規(guī)程》(1984版)[7]、《結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》(1995版)[8]及《結核病實驗室檢驗規(guī)程》(2015版)[9],規(guī)定用于結核病的病原學檢測。實際應用中,牛型MTB僅對吡嗪酰胺天然耐藥,對其他藥物的敏感性與人型MTB相同,且總體牛型MTB占比非常少見[10],故多數(shù)情況下僅使用PNB實驗鑒定MTB和NTM。

一、PNB實驗方法的研究進展

傳統(tǒng)PNB實驗使用2～3周的新鮮分枝桿菌培養(yǎng)物進行試驗。0.01 ml 10-1mg/ml濃度的菌液均勻接種至中性改良羅氏斜面培養(yǎng)基和含PNB(500 μg/ml)的改良羅氏斜面培養(yǎng)基各1支,即10-3mg/管,37 ℃培養(yǎng)。每周觀察1次結果,同時記錄兩種培養(yǎng)基上菌落的生長情況直至孵育4周。實驗時設置堪薩斯分枝桿菌(Mycobacteriumkansasii)為陽性對照菌株,MTB標準菌株H37Rv為陰性對照菌株[9]。PNB生長陽性判斷為NTM,陰性判斷為MTB。PNB實驗的主要局限性在于這是一個基于培養(yǎng)的實驗方法,加上從樣本中進行菌株分離的培養(yǎng)時間,至少需要6～8周,非常耗時。為了縮短PNB實驗的檢測時間、提高檢測的敏感度,研究人員相繼對PNB實驗方法進行了改進。

(一)液體法

液體法包括PNB-Mycobacteria Growth Indicator Tube(MGIT)法和微量肉湯培養(yǎng)法兩種方法。PNB-MGIT法是在BACTEC MGIT 960培養(yǎng)管中添加500 μg/ml的PNB進行鑒別培養(yǎng)。該方法利用BACTEC MGIT 960培養(yǎng)管底部植入的氧依賴性熒光淬滅感受器,提高敏感度的同時,將報告時間縮短至7～10 d[11],但高度依賴于專用大型儀器BACTEC MGIT 960/320全自動分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏檢測系統(tǒng)。

微量肉湯培養(yǎng)法是在96孔板中添加100 μl含PNB的Middlebrook 7H9(10% oleic acid-albumin-dextrose-catalase(OADC))液體培養(yǎng)基,PNB的鑒別濃度降為200 μg/ml;然后每個檢測孔再加入100 μl 10-3mg/ml的待測菌液,同時設無PNB的生長對照孔,培養(yǎng)7～10 d判讀結果[12]。該方法無需昂貴的專用設備,成本較低,適于基層實驗室進行大樣本量檢測。

(二)固體法

PNB-7H10法是在配制Middlebrook 7H10(10% OADC)固體瓊脂培養(yǎng)基時添加終濃度為500 μg/ml 的PNB。將1麥氏濁度的菌液1∶100稀釋后取10 μl接種PNB-7H10平板,根據(jù)生長情況判讀結果。報告時間在3～28 d,93%的MTB菌株培養(yǎng)后14 d可以報告結果。PNB-7H10法與PNB-MGIT的檢測結果完全一致,但每個樣本的檢測成本可以從PNB-MGIT的3.5美元下降至PNB-7H10的0.7美元。7H10固體培養(yǎng)基不使用羅氏培養(yǎng)基中的無抗生素蛋基,不含蛋白水解污染物,培養(yǎng)基呈半透明,更容易觀察菌落生長及污染的情況。同時,7H10培養(yǎng)基已被美國臨床實驗室標準協(xié)會(the US Clinical Laboratory Standards Institute,CLSI)推薦用于藥物敏感性試驗,在全球大多數(shù)實驗室中得到廣泛使用[13]。

使用PNB的改良直接硝酸還原酶實驗(Modified direct nitrate reductase assay using PNB,NRAp)[14-15]則利用分枝桿菌將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的能力[16]。在含1000 μg/ml KNO3的羅氏培養(yǎng)基上生長的分枝桿菌,可以將Griess試劑轉變?yōu)榉凵?。NRA和使用刃天青(resazurin)、Alarmblue等染料一樣,都是利用顏色的變化使生長結果更易判讀,以提高實驗的敏感度,縮短判讀時間。NRA方法2011年被世界衛(wèi)生組織推薦用于耐多藥結核病患者的快速藥敏檢測。在KNO3羅氏培養(yǎng)基添加500 μg/ml的PNB,并采用NRA法檢測即NRAp實驗。與其他PNB實驗不同的是,該方法可以直接檢測涂片陽性的痰液樣本。

(三)代謝產(chǎn)物檢測法

代謝產(chǎn)物檢測法是使用分光光度計或液相色譜-質譜聯(lián)用儀(liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS)直接對PNB的還原代謝物對氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid,PABA)進行濃度測定,無需培養(yǎng)。實驗時是將待測菌株的新鮮培養(yǎng)物制成20 mg/ml的菌液,每毫升菌液加入5 μl 5% PNB,37 ℃孵育過夜。0.2 μm濾膜過濾后的菌液可直接進行LC-MS檢測,PABA的質荷比瞬態(tài)為138→77.1,鑒定的cut-off 值為0.7[17]。濾液也可經(jīng)三氯乙酸、亞硝酸鈉和氨基磺酸氨依次處理,N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽顯色,在分光光度計上讀取540 nm的吸光度值。以PABA 濃度 0 μg/ml 定為 cut-of值,>0 μg/ml 判定為NTM,≤0 μg/ml 判定為 MTB。代謝產(chǎn)物法所需最低分枝桿菌菌量為1 mg,在細菌培養(yǎng)陽性后最短可以在8 h進行MTB 及NTM鑒定[18]。兩種檢測方法中LC-MS更靈敏,檢測過程僅需5 min,但對儀器條件和實驗技術要求更高。

與傳統(tǒng)的PNB方法相比,改進后的方法顯著縮短了結果報告的時間(表1)。但在使用PNB實驗進行分枝桿菌鑒定時還需要注意:(1)分枝桿菌對PNB的敏感性不是絕對的。約2%的MTB菌株可以在PNB培養(yǎng)基上生長,而NTM中也有部分菌種,或部分菌種中的少量菌株不能耐受500 μg/ml的PNB。PNB實驗的錯判率約為10%～20%[11, 19-22];(2)PNB實驗不適用于混合感染,NTM在PNB上的生長,會掩蓋混合感染樣本中MTB的檢出。

表1 傳統(tǒng)及改良PNB實驗主要參數(shù)比較

二、分枝桿菌PNB代謝及其催化酶的研究進展

PNB實驗的生化原理較為清晰,即PNB在硝基還原酶(nitroreductase,NR)的作用下,硝基還原為氨基,轉變?yōu)镻ABA(圖1)。PNB對于細菌是有毒性的,而PABA不僅無毒,而且是葉酸合成的中間產(chǎn)物,而葉酸對于細菌的存活是至關重要的。PNB鑒別MTB和NTM兩類菌株的機制可能是MTB中不存在參與此代謝的NR酶或酶活性低,PNB無法被轉化而抑制MTB的生長;而NTM中天然存在的NR能夠轉化PNB,使其自身生長代謝不被抑制。因此,PNB的鑒別機制研究主要在于參與反應的NR的鑒定及其在基因組上的定位。PNB的同分異構體鄰硝基苯甲酸(2-nitrobenzoic acid)與間硝基苯甲酸(3-nitrobenzoic acid)不能區(qū)分MTB與NTM,提示涉及的NR酶具有構象特異性。

圖1 對硝基苯甲酸代謝的生化反應

細菌的NR屬于硝基黃素單核苷酸還原酶[nitro flavin mononucleotide (FMN) reductase]超家族,利用非共價結合的FMN作為輔助因子,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸[nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NAD(P)H]作為電子供體進行強制性的雙電子轉移,催化硝基化合物的還原。

該酶家族的成員包括NAD(P)H:FMN氧化還原酶、氧不敏感硝基還原酶、黃素還原酶P、二氫蝶啶還原酶、NADH氧化酶和NADH脫氫酶等。NR編碼基因在細菌基因組中是廣泛存在的,在真核生物中也有發(fā)現(xiàn)。NR普遍存在的原因可能是硝基芳香族化合物通常是有毒和致突變的。許多微生物中都建立了降解和解毒這些化合物的酶代謝途徑。分枝桿菌不同種的基因組上攜帶有不同數(shù)量、種類的NR編碼基因,如膿腫擬分枝桿菌CF00207-00450基因組(NZ_CP089589.1)中就包含34個預測的NR家族蛋白。但迄今為止,分枝桿菌中以PNB為底物,確證能夠轉化PNB的NR包括僅有脂酰胺脫氫酶(lipoamide dehydrogenase,Lpd)和硝基還原酶/二氫蝶啶還原酶(nitroreductase/dihydropteridine reductase,NfnB)兩種。

(一)Lpd

由于硝基很容易接受電子,許多具有不同生理作用的酶也可以還原芳香硝基,盡管還原硝基不是這些酶的主要作用[23-25]。Lpd就是其中很典型的一種。Lpd是多酶α-酮酸脫氫酶復合物的一種成分,包括α-酮戊二酸和丙酮酸脫氫酶。多酶的作用是催化α-酮戊二酸轉化為琥珀酰輔酶A,丙酮酸轉化為乙酰輔酶A,隨后用于脂肪酸生物合成或轉化為檸檬酸鹽進入三羧酸循環(huán)中進行氧化。Lpd還能夠進行替代氧化劑的單電子或雙電子非生理性還原,其中就包括連接三羧酸循環(huán)和脂肪酸生物合成的糖酵解反應。脂肪酸代謝途徑對分枝桿菌是尤為重要的,合成的長支鏈脂質分枝菌酸整合入細胞壁,為菌體提供抗親水性溶質和藥物的非滲透性屏障,也使分枝桿菌的致病菌株如MTB、麻風分枝桿菌和鳥分枝桿菌可以在巨噬細胞的吞噬溶酶體中存活[26]。

Lpd是一種多催化功能活性酶[27],來自豬心、分枝桿菌和克氏錐蟲的Lpd是僅有的三種具有NR活性的脂酰胺脫氫酶[28],其中豬心來源的Lpd是最早確定具有NR活性的[23]。Lpd是分枝桿菌中最早確定具有NR活性的酶[29]。1994年,Rafii等[29]從屬于NTM的范巴倫分枝菌酸桿形菌(Mycolicibacteriumvanbaalenii)環(huán)境株Pyr-1的胞內(nèi)蛋白中分離到一種NR活性酶,可以在體外將PNB轉化為PABA。檢測結果顯示,其是對氧不敏感的胞內(nèi)酶,可由硝基化合物1-硝基芘誘導表達,酶活性是菌量依賴性的,可以被還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)增強,被對氯苯甲酸、鄰碘異苯甲酸、甲萘醌、雙香豆素和抗霉素A抑制。1997年,Marcinkeviciene和Blanchard[26]從恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)Mc2155菌體蛋白中分純了一個相對分子質量49 000的蛋白,Edman氨基末端測序顯示為Lpd。但在該項研究中,Lpd的硝基還原酶活性是用硝基呋喃衍生物硝基呋喃酮(nitrofurazone)進行測定的。2001年Rafii等[28]完成了Pyr-1菌株中NR酶的純化及氨基酸測序,結果顯示,N端20個氨基酸殘基中18個與恥垢分枝桿菌Lpd蛋白相同(90%同源性),確定也為Lpd蛋白。2005年,Rajashankar等[30]報道了MTB的Lpd蛋白(Rv0462基因編碼)的晶體結構及功能,結果顯示,MTB的Lpd是二聚體,和其他生物的Lpd具有相似的結構形式,Arg-93、His-98、Lys-103和His-386 是其保守的活性位點,但酶活性分析中僅檢測了脂酰胺脫氫酶、丙酮酸脫氫酶和二硫代硝基苯還原酶活性,沒有進行硝基還原酶活性檢測。

(二)Nrd/NfnB

大腸桿菌中的NfnB是原核生物中硝基還原酶的原型物。這種酶通過將硝基還原為氨基,激活抗腫瘤藥物中含硝基前藥,從而被用于抗癌化學療法的研究[31]。2010年,Manina等[32]進行了恥垢分枝桿菌中NfnB的結構、生物特性及其在苯并噻嗪酮(benzothiazinone,BTZ)耐藥中的作用研究。BTZ是靶向分枝桿菌癸烯基磷酸-β-D-核糖2′-差向異構酶(decaprenylphosphoryl-β-d-ribose 2′-epimerase,DprE1)亞單位的新型抗結核藥物,其硝基基團是抗分枝桿菌活性所必需的。恥垢分枝桿菌中的NfnB催化其硝基完全還原為氨基,失活而產(chǎn)生分枝桿菌對該藥物的耐藥性。在MTB和恥垢分枝桿菌中過表達NfnB,都可以導致對BTZ043的耐藥,但需要在有氧條件下,說明NfnB是氧依賴型。而MTB中預測的NR酶的過表達,包括acg、Rv0306、moeY、fbiB、Rv3131、Rv3127、Rv3368c、Rv3547、Rv1558、Rv1261c、Rv3178和lpdC,都不能影響B(tài)TZ043對分枝桿菌最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentrations,MIC)[32]。

2013年,丁朋舉[33]利用大腸桿菌對耐PNB的膿腫分枝桿菌ATCC19977中注釋為NR的基因(YP_001703395)進行了體外表達及酶活性測定。蛋白純化復性后測定酶活性證實產(chǎn)物確實能夠還原PNB而發(fā)生顯色反應,酶的活力單位是0.21,比活性為32.2 U/mg。YP_001703395和WP_005111198的序列100%相同,而后者的注釋為“PnbA_NfnB-like,nitroreductase similar toMycobacteriumsmegmatisNfnB;cd02136”,正是恥垢分枝桿菌中的NfnB基因。MTB基因組中不存在NfnB的直系同源物(http://tuberculist.epfl.ch/),因此,可能是兩類分枝桿菌對PNB、BTZ等化合物敏感性不同的原因。

三、現(xiàn)有研究的局限性

關于分枝桿菌PNB耐藥機制的研究較少。雖然除Lpd和NfnB外,分枝桿菌中已經(jīng)確定具有NR活性的蛋白及其編碼基因還包括:Rv3547,一種硝基咪唑并噁嗪特異性硝基還原酶,對重要的雙環(huán)硝基咪唑類抗結核新藥PA-824(pretomanid)前藥的激活至關重要[28, 32, 34-37];Rv2466c,MTB氧化應激反應中的一種放線硫醇依賴型硝基還原酶(mycothiol-dependent nitroreductase,MSH),其過表達會增加MTB野生型和耐藥突變株對噻吩嘧啶衍生物類新型抗分枝桿菌藥物TP053的敏感性,表明TP053是由Rv2466c激活的前藥[38];Acg/Rv2032,一種罕見的FMN結合蛋白,是MTB的必需毒力因子[39],acg的缺失無論是靜止和激活的巨噬細胞還是急性和持續(xù)性小鼠感染模型中毒力和生長力都會減弱,不能作為NR酶還原活化前藥,但有可能還原降解呋喃妥因和硝基呋喃類藥物[40];Rv3131和acg同樣屬于受控于DosR調(diào)控子的48個基因[41],是一個含F(xiàn)MN結合結構域的硝基還原酶蛋白,可誘導TLR2介導促炎細胞因子分泌,有助于MTB的肉芽腫形成并影響先天免疫應答[42],但在以上這些蛋白或基因的研究中沒有進行PNB的代謝能力測定。而已有的Lpd和NfnB研究中,多是在大腸桿菌中進行克隆、表達、蛋白純化后測定的NR酶活性?，F(xiàn)有文獻表明,以PNB為底物的體外活性測定是NR活性測定的常用方法,但體外檢測并不能說明目標蛋白在分枝桿菌內(nèi)的實際表達情況;同時,已有研究均缺乏MTB和NTM間的差異性對比及基因替代等確證性實驗,因此,難以確定其在PNB區(qū)分兩類分枝桿菌中的作用。

綜上所述,分枝桿菌中確定的PNB轉化NR酶,以及兩類分枝桿菌對PNB敏感性差異產(chǎn)生的原因迄今并未闡明。因為內(nèi)在共同代謝酶NR的關聯(lián),PNB實驗可能與分枝桿菌的滯留性、低氧環(huán)境應激和抗結核藥物的耐藥性等重要生物學功能存在相關性。例如,恥垢分枝桿菌中過表達MTB-LpdC蛋白可延長其在巨噬細胞內(nèi)的存活能力[43]。NfnB的過度表達是一種新的苯并噻嗪酮類藥物耐藥機制,可能在同樣靶向DprE1的二硝基苯甲酰胺類化合物藥物耐藥性形成中起作用[32]。而且分枝桿菌不同菌種間存在的硝基化合物的代謝差異,決定了BTZ043、TP053及PA-824等抗結核新藥應用于不同分枝桿菌菌種的潛力[32, 44],這與PNB區(qū)分兩類分枝桿菌的原理是相同的。因此,對PNB的相關代謝機制存在重要的意義,需要進一步闡明。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻李月:查閱文獻、匯總資料、撰寫文章初稿;夏輝和李馬超:對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱;王瑞白:指導研究、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、獲取研究經(jīng)費