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    菌株YC-25 的分離鑒別及其對煙草的促生作用

    2023-10-09 08:43:06呂歡歡郝浩浩周俊學吳俊林孫會忠
    安徽農(nóng)學通報 2023年17期
    關(guān)鍵詞:病菌菌落煙草

    呂歡歡 郝浩浩 李 翔 周俊學 吳俊林 孫會忠

    (1河南科技大學農(nóng)學院,河南洛陽 471003;2河南煙草公司駐馬店市公司,河南駐馬店 463000;3河南省煙草公司洛陽市公司,河南洛陽 471003)

    獲得優(yōu)質(zhì)的促生菌是提高煙草品質(zhì)的切入點之一,目前已報道的植物生長促進菌(plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)主要包括假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)和伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)等[1-3],在煙草促生方面發(fā)揮了重要作用。但單一促生菌作用機制單一[4],受環(huán)境影響大[5]。因此,尋找多功能促生菌具有重要的理論和現(xiàn)實意義。皮特不動桿菌(Acinetobater pittii)為莫拉菌科(Bacillaceae)不動桿菌屬,是一類廣泛存在于水體和土壤的重要根際有益菌。皮特不動桿菌不僅能夠抑制煙草黑脛病[6],還能高效解磷解鉀[7],促進植物的生長,具有巨大的生物應用價值。

    煙草(Nicotiana tabacum)屬茄科一年生或有限多年生草本植物[8],是一種重要的經(jīng)濟作物。隨著種植面積的擴大和難以避免的多年連作,煙葉生產(chǎn)受煙草病害影響嚴重,造成的年平均產(chǎn)量損失達10%左右[9]。使用化學藥劑防治是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中快速防治病害的有效手段,但長期使用化學藥劑易導致煙草農(nóng)藥殘留、病害產(chǎn)生抗藥性等問題,對煙草質(zhì)量產(chǎn)生了不良影響[10-12]。微生物防治具有安全綠色、環(huán)境友好等優(yōu)勢,受到國內(nèi)外各方廣泛關(guān)注[13]。煙草病害防治菌劑的開發(fā)研究資源豐富,但目前有關(guān)廣譜抑制真菌的不動桿菌的報道不多,且不動桿菌對煙草促生作用的研究較少。

    為豐富促生煙草生長菌種資源,本研究從煙草根際土壤中分離可培養(yǎng)內(nèi)生細菌,篩選出對煙草生長具有促生作用的菌株,同時評估目的菌株的生物活性,明確目的菌株的分類信息,并通過盆栽試驗驗證目的菌株的促生效果,為煙草促生菌劑的開發(fā)提供菌種資源。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 土樣和煙草品種 土壤樣品采自河南省駐馬店市確山縣植煙區(qū)團棵期至成熟期健康煙株根際土壤,共10份。供試煙草品種為云煙87。

    1.1.2 供試培養(yǎng)基和試劑 采用肉湯培養(yǎng)基(LB)和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)進行細菌的分離與純化[14];采用馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)進行病原真菌的培養(yǎng)及平板對峙試驗[15];采用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)進行細菌懸液的制備及菌種的活化[16];采用蒙金娜有機磷培養(yǎng)基和無機磷培養(yǎng)基(PKO)進行菌株的溶磷活性鑒別;采用鉀長石培養(yǎng)基進行菌株的解鉀活性鑒別[17];采用羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基(CMC-Na)進行菌株的纖維素分解活性鑒別[18];采用TaKaRa MiniBEST細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA。

    1.1.3 供試病原真菌 指示病原真菌包括小麥根腐病菌(Fusarium culmorum)、番茄枯萎病菌(F.oxysporum)、牡丹黑斑病菌(Alternaria suffruticosae)、小麥灰霉病菌(F.graminearum)、牡丹灰霉病菌(Botrytis paeoniae)、牡丹黃斑病菌(Phyllosticta commonsii),均保存于河南科技大學農(nóng)學院微生物實驗室。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 菌株的分離純化 采用溫度篩選法和平板稀釋涂布法[19]從采集的土壤樣品中分離純化內(nèi)生細菌,將培養(yǎng)得到的表面褶皺程度不同、邊緣不同、大小不同、顏色不同的可培養(yǎng)植物內(nèi)生細菌依次編號,純化后放在終濃度15%甘油中于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 菌株抑菌譜的測定 采用平板對峙法,以6 種病原真菌為指示菌株,無菌條件下將待測菌株點接于病原菌相等距離十字交叉線的四端,28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d,3 次重復,以僅接病原真菌作為空白對照。當空白對照的病原菌長滿平板時,觀察并測量接種拮抗菌的培養(yǎng)皿中菌落直徑[20],計算相對抑制率,計算方法如下:相對抑制率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-5)×100。

    1.2.3 菌株促生活性測定 (1)溶磷、解鉀菌活性篩選:將菌株分別接種到有機磷培養(yǎng)基、PKO和鉀長石培養(yǎng)基上,28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d,測量透明圈直徑D、菌落直徑d,根據(jù)D/d大小初步篩選溶磷、解鉀菌[21-22]。

    (2)產(chǎn)纖維素酶活性篩選:將菌株點接于CMCNa 培養(yǎng)基,28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d 后,0.1%剛果紅浸潤20 min,1 mol/L NaCl 沖洗,測定菌落直徑d和透明圈直徑D,并計算比值(D/d)[23]。

    (3)IAA能力測定:于1 000 r/min下離心菌株菌懸液10 min,取上清液,上清液與比色液按照1∶1加入白色陶瓷板上,室溫避光放置30 min 后觀察混合液顯色變化,以40 μg/mL IAA 標準溶液為陽性對照,不接菌的LB 液體培養(yǎng)基為陰性對照,混合液為粉色或紅色表明具有產(chǎn)IAA 活性,混合液為透明無色則表明不具有產(chǎn)IAA活性[24]。

    1.2.4 多相鑒定 (1)形態(tài)和生理生化鑒定:形態(tài)學觀察參照《不動桿菌屬》,觀察菌株的顏色、形體大小、表面黏稠度等特征并記錄,同時取少量菌體進行革蘭氏染色,電子顯微鏡下鏡檢并拍照。根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中介紹的不動桿菌屬生理生化試驗進行,以此對篩選出來的拮抗菌株進行初步鑒定[25]。

    (2)分子生物學鑒定:使用TaKaRa MiniBEST DNA 提取試劑盒提取菌株的基因組,細菌通用引物27F(5′-AGTT-TGATCMTGTCCAG-3′)和1492R(5′-GGTT-ACCTTTACGCTT-3′)進行擴增。1.5%瓊脂糖凝膠電泳后純化PCR產(chǎn)物,并送公司測序[26]。采用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,確定菌株的分類地位。

    1.2.5 菌株對煙草的促生作用 采用盆栽試驗,設(shè)3 個處理,分別為:CK,空白對照處理;處理T1,每株均用等量的1×108CFU/mL 微生物菌株發(fā)酵液灌根;處理T2,枯草芽孢桿菌菌劑灌根。各處理除微生物菌劑不同以外,其余的栽培管理措施均相同。每個處理3次重復。在煙草生長前后每7 d處理1次,共處理3 次,最后一次處理42 d 后開始調(diào)查植株的株高、莖圍、節(jié)距、最大葉面積等生物量指標,并觀測植株的光合速率等指標,統(tǒng)計和評估不同處理對煙草植株生長的影響[27]。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,采用SPSS 27.0進行差異顯著性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌株分離篩選結(jié)果

    從10 份煙草根際土樣中共分離到35 株菌株,以6 株病原菌為指示菌進行篩選,得到菌株YC-25。試驗結(jié)果表明,菌株YC-25 對番茄枯萎病菌抑制效果最好(圖1L),對小麥灰霉病菌和牡丹黃斑病菌抑制效果稍弱(圖1B、H),對小麥根腐病菌、牡丹灰霉病菌和黑斑病菌抑制效果最弱(圖1D、F、J),平均抑菌率達到48%(圖2)。光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),正常未受抑制菌絲密集交織,分枝豐富,菌絲完整、表面平滑(圖1M);受抑制菌絲通常表現(xiàn)出局部膨大、集結(jié),幼嫩菌絲數(shù)量減少,分枝稀疏或密集(圖1N、O、P)。

    圖1 菌株YC-25對6種病菌的拮抗作用

    2.2 菌株YC-25的促生功能活性

    (1)溶磷、解鉀活性:菌株在無機磷培養(yǎng)基和鉀長石培養(yǎng)基上均出現(xiàn)明顯透明圈(圖3A、B),菌株YC-25的溶磷可溶性指數(shù)為1.33,解鉀指數(shù)為1.31。

    圖3 菌株YC-25的促生功能活性鑒別

    (2)分解纖維素活性:菌株YC-25可在CMC-Na培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈(圖3C),D/d=1.9。

    (3)產(chǎn)吲哚乙酸(IAA)特性:定性與定量結(jié)果分析,菌株YC-25具有分泌IAA的能力,顯色反應為粉紅色,分泌量為39.05 μg/mL(圖4C)。

    圖4 菌株的IAA顯色反應

    2.3 菌株YC-25形態(tài)特征

    2.3.1 菌株的形態(tài)和生理生化特征 菌株YC-25在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d后觀察,單菌落呈淡黃色,不透明,表面光滑濕潤,中間略微凸起菌落較為黏稠,邊緣不規(guī)則(圖5A)。革蘭氏試劑染色后鑒定為革蘭氏陰性菌株(圖5B),菌體呈短桿狀,直徑為0.3~0.5 μm,長1.3~2.2 μm,無芽孢,無莢膜,無鞭毛(圖5C)。

    圖5 菌株YC-25的形態(tài)特征

    生理生化結(jié)果顯示,不可水解蛋白酶和果膠酶,能水解尿素,氧化酶反應、硝酸鹽還原試驗、V-P 試驗、明膠液化試驗、接觸酶試驗為陰性。糖醇類發(fā)酵試驗結(jié)果顯示,蔗糖、阿拉伯糖、葡萄糖、木糖和乳糖為陰性。依據(jù)試驗結(jié)果,菌株YC-25 符合不動桿菌屬種群特征描述。

    2.3.2 菌株YC-25的16S rRNA序列分析特征 測序結(jié)果顯示菌株YC-25的基因序列長度為1 030 bp,提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫(登錄號為OR125558)。通過比對發(fā)現(xiàn),菌株YC-25 與Acinetobacter pittiiLMG1035(NR 117930.1)聚在同一分支,相似度達到99%。綜合菌株YC-25 的形態(tài)、生理生化及基因序列分析,鑒定為不動桿菌(Acinetobater pittii),暫命名為Acinetobater pittiiYC-25(圖6)。

    圖6 YC-25的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹

    2.4 菌株YC-25對煙草的促生效果驗證

    盆栽試驗驗證菌株發(fā)酵液(1×108CFU/mL)對煙草的促生效果顯示,處理42 d 后,處理T1的凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率略高于處理T2,顯著高于CK,胞間CO2濃度低于CK 和處理T2(表1),說明菌株處理后的煙株生理活性較強。處理T1煙株各項農(nóng)藝性狀均高于CK 和處理T2,與CK 相比,處理T1煙草株高增加了26.29%,莖圍增加了27.54%,最大葉面積增加了17.26%(表2)。圖7 顯示,處理T1煙草葉片寬厚、濃綠,新生根系更加發(fā)達,說明菌株YC-25對煙草生長產(chǎn)生了較好的促進作用。

    表1 不同處理的生理參數(shù)

    表2 不同處理農(nóng)藝性狀的比較

    圖7 不同處理煙株生長狀況

    3 結(jié)論與討論

    周亞男等[28]研究表明,從煙草根際土壤分離出來的假單胞菌(P.koreensisHCH2-3)、淺黃綠假單胞菌(P.luridaFGD5-2)和貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensisEM-1)對煙苗呈現(xiàn)不同程度的促生作用。本研究從煙草根際土壤中篩選出的一株高效促生菌株,對6 種病原真菌平均抑菌率為48%,經(jīng)多相鑒定屬于皮特不動桿菌,豐富了煙草促生菌種資源庫。大多數(shù)研究表明,皮特不動桿菌主要功能為降解纖維素[29-30]和高效分解有機磷及無機磷[31]。煙草促生過程中,關(guān)于皮特不動桿菌促進煙草生長的相關(guān)產(chǎn)品較少,本試驗篩選獲得的促生菌不動桿菌YC-25,為煙草促生及生物菌劑開發(fā)提供了重要的資源。菌株在防治枯萎病菌的同時,對黃斑病菌、黑斑病菌等其他植物病菌也具有生物防治作用,抑菌譜較廣。菌株YC-25分泌IAA的同時,兼具解磷、解鉀活性和產(chǎn)纖維素酶能力,對煙草發(fā)育產(chǎn)生促進作用。因此,菌株YC-25 作為促生菌開發(fā)潛力巨大,在后期的研究中,可對菌株的發(fā)酵特性和次生產(chǎn)物進行開發(fā)。不動桿菌在防控植物病害、促進植物生長等方面發(fā)揮著重要作用,但其在植物體內(nèi)的代謝過程、調(diào)控機制和對植物的作用效果等還需要更多的研究,以明確不動桿菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應用效果,并為其發(fā)展和推廣提供理論基礎(chǔ)。當下,不動桿菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應用研究相對較少,但隨著其生物防治效果和環(huán)境安全性越來越受到人們關(guān)注,不動桿菌將會有更廣闊的發(fā)展前景。

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