蛋白質(zhì)的圓二色光譜測量中圓二色值不確定度評估
——以細(xì)胞色素C為例

程 紅,嚴(yán)定策*,武利慶,徐 俊

1. 華中科技大學(xué)分析測試中心,湖北 武漢 430074 2. 中國計量科學(xué)研究院前沿計量科學(xué)中心,北京 100029 3. 華中科技大學(xué)能源與動力工程學(xué)院,湖北 武漢 430074

引 言

在自然界中,手性是生物分子如蛋白質(zhì)、氨基酸、碳水化合物、核酸等本身固有的屬性[1-2]。圓二色(circular dichroism,CD)光譜作為一項用于研究手性分子的光譜技術(shù),在這些物質(zhì)的研究中被廣泛應(yīng)用,其中以蛋白質(zhì)尤為突出。通過CD光譜學(xué)對蛋白質(zhì)進行分析,可以鑒定和評估其二級結(jié)構(gòu)[3-4],檢測細(xì)微或顯著的構(gòu)象變化,研究蛋白質(zhì)動態(tài)變化和/或配體結(jié)合效應(yīng)等[5-6],以獲得關(guān)于所研究蛋白質(zhì)的快速和全局結(jié)構(gòu)信息,因此CD光譜學(xué)被世界各地的研究人員用作結(jié)晶學(xué)、核磁共振和分子動力學(xué)的補充技術(shù)[7]。

在CD光譜中,遠紫外區(qū)域(通常為180～260 nm)的光譜可以給出蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量的總體指示,因為該區(qū)域的主要生色團是分子的肽主鏈。在蛋白質(zhì)的規(guī)則二級結(jié)構(gòu)中,肽鍵是高度有規(guī)律排列的,排列的方向性決定了肽鍵能級躍遷的分裂情況[8]。對遠紫外CD光譜進行解卷積,可以提供二級結(jié)構(gòu)組成的定量估計,但普通生物制藥緩沖液和賦形劑可能會產(chǎn)生干擾,糖基化、聚糖綴合、其他翻譯后變化或異常氨基酸組成也會影響[9]。用CD方法獲得的結(jié)構(gòu)信息有時會受到原始CD數(shù)據(jù)質(zhì)量的影響。正如Miles和Wallace所述,在任意兩臺儀器中進行的CD測量,即使在可比較的條件下,相同樣品的光譜幅度(elipticity橢圓度,CD scale,也稱圓二色值)或波長也可能存在細(xì)微差異。光源、最終的光度輸出和各個儀器之間入射光偏振的微小差異是導(dǎo)致圓二色值或波長產(chǎn)生差異的可能原因。為了避免這些差異導(dǎo)致數(shù)據(jù)的不可比性,在采集CD數(shù)據(jù)之前,必須對CD儀器進行校準(zhǔn),包括圓二色值和波長,因為CD解卷積分析強烈依賴于圓二色值。

最近,人們認(rèn)識到蛋白質(zhì)的高階結(jié)構(gòu)要得到更好的表征,必須重視這些數(shù)據(jù)的客觀比較[10-11]。要輸出統(tǒng)計上有效的數(shù)據(jù),就需要清楚地了解光譜不確定性的來源、如何糾正它們以及其對結(jié)果有效性的影響。Maurice等[12]采用一次國際比對的數(shù)據(jù)利用摩爾橢圓度討論了蛋白質(zhì)的圓二色光譜譜圖的不確定度;Jones[13]比較了一個公共數(shù)據(jù)庫(protein circular dichroism data bank,PCDDB)中108個d-10-樟腦磺酸的校準(zhǔn)數(shù)據(jù),對這些光譜位于290和190 nm附近的峰進行了統(tǒng)計評估,發(fā)現(xiàn)儀器之間峰波長的平均值差異顯著;Victor等[14]采用蒙特卡羅模型(Monte Carlo-like model)評估了使用CDSSTR、Selcon 3和ContinLL算法對肌紅蛋白的理論CD譜進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的不確定度。本工作以一種α-螺旋為主導(dǎo)的蛋白質(zhì)—細(xì)胞色素C為實驗對象,考察了圓二色光譜測定蛋白質(zhì)實際測試過程中圓二色值θ的不確定度。圓二色光譜是為一段波長下橢圓度θ的測量值,通常θ的單位用mdeg表示。一般情況下,θ值和CD吸光度的差值(ΔA)不在實驗室之間或?qū)嶒炇覂?nèi)進行比較[12],但是本實驗中考慮所用比色皿的光程長度、儀器的校準(zhǔn)狀態(tài)和溶液的濃度,期望通過特定蛋白質(zhì)在特定濃度下的θ值不確定度的評估,找出影響測量結(jié)果的主要因素,可以設(shè)法消除或降低這些因素的影響,改進測量方法,提高CD數(shù)據(jù)的可比性和可靠性,為進一步進行實驗室間比對提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器設(shè)備

日本Jasco公司J-810型圓二色光譜儀;波蘭RADWAG公司AS 60/220 R2型分析天平(經(jīng)湖北省計量測試技術(shù)研究院檢定合格,在檢定合格有效期內(nèi)使用);法國Millipore公司Milli-QAcademic型純水機(經(jīng)湖北省計量測試技術(shù)研究院檢定合格,在檢定合格有效期內(nèi)使用);德國Eppendorf公司Researchplus單道可調(diào)式移液器,20～200 μL,100～1 000 μL(經(jīng)湖北省計量測試技術(shù)研究院檢定合格,在檢定合格有效期內(nèi)使用);光程長為10 mm的石英比色皿1支、光程長為1 mm的石英比色皿3支 (Starna Scientific Ltd. Hainault,Essex IG6 3UT,UK);10 mL容量瓶一支(經(jīng)湖北省計量測試技術(shù)研究院檢定合格,在檢定合格有效期內(nèi)使用)。

1.2 樣品

d-10-樟腦磺酸銨(ACS,購自日本Jasco公司,部件號:0730-0358,純度99%);細(xì)胞色素C(5 mg,棕色玻璃瓶裝,購自中國國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源共享平臺,中國計量科學(xué)研究院研制二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),GBW(E)100153。在樣品有效期內(nèi)使用。)實驗用水為超純水(電阻率為18 MΩ·cm)。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

精確稱取樟腦磺酸銨樣品6.77 mg,使用移液器精密加入1.13 mL超純水,完全溶解后,使用移液器精密移取1 mL,置10 mL容量瓶,使用超純水定容至刻度線,濃度為0.6 mg·mL-1。

在細(xì)胞色素C樣品瓶中精密加入超純水1 mL,完全溶解后精密移取100 μL至離心管,再精密加入900 μL超純水稀釋,搖勻,精密移取該溶液400 μL至離心管,再精密加入3 600 μL超純水,搖勻,濃度為0.05 mg·mL-1,平行配制兩次。

將所有樣品溶液放置在冰箱(4 ℃)中。在進行CD測量之前,讓溶液在此溫度下平衡至少一整夜。

1.3.2 儀器校準(zhǔn)

從冰箱中取出樟腦磺酸銨樣品溶液,在室溫[(23±2)℃]下平衡1 h,并在進行CD測量之前將樣品裝入光程長為10 mm的石英比色皿內(nèi),根據(jù)如下參數(shù)測量樣品的CD光譜:

掃描范圍:200～400 nm

累積次數(shù):1次

響應(yīng)時間:1 s

帶寬:1 nm

靈敏度:Standard(100 mdeg)

步長:1 nm

掃描速度:50 nm·min-1

根據(jù)樟腦磺酸銨溶液的出峰情況調(diào)整儀器,使291 nm附近譜峰的圓二色值為(190.4±1) mdeg。記錄6個重復(fù)光譜。

1.3.3 樣品溶液的測試

在完成儀器校準(zhǔn)當(dāng)天,將細(xì)胞色素C樣品溶液從冰箱中取出,在室溫[(23±2)℃]下平衡1小時。在進行CD測量之前,先測試溶劑空白-超純水在光程長為1 mm的石英比色皿的圓二色光譜圖,然后將樣品裝入同一個比色皿內(nèi)進行CD測量,測試中保持樣品測試與空白測試時比色皿的方向一致。根據(jù)如下參數(shù)測量樣品的遠紫外CD光譜。記錄樣品的6個重復(fù)光譜(連續(xù)測定,重復(fù)測量不重新裝樣)。2個平行溶液分別使用3支比色皿測試,共測試36次。

掃描范圍:190～260 nm

累積次數(shù):6次

響應(yīng)時間:1 s

帶寬:1 nm

靈敏度:Standard(100 mdeg)

步長:1 nm

掃描速度:50 nm·min-1

1.4 測試結(jié)果

1.4.1 儀器校準(zhǔn)結(jié)果

根據(jù)291 nm附近的譜峰圓二色值的情況調(diào)整后,重復(fù)六次的結(jié)果見表1。

表1 0.6 mg·mL-1樟腦磺酸銨水溶液的圓二色值Table 1 CD magnitude of ammonium d-10-camphorsulfonate (ACS) with a concentration of 0.6 mg·mL-1 in pure water

由于儀器測得的圓二色值不是絕對值,本文只考慮這些值的可比性的實際要求。雖然我們將CD儀器使用樟腦磺酸銨校準(zhǔn)到參考CD值(190.4±1) mdeg @(290±1) nm,但這個賦值沒有相關(guān)不確定度,且不可溯源。CD測量的可溯源性至今仍是一個挑戰(zhàn),不在本文討論的范圍。此外,即使是在參考波長291 nm對儀器進行了充分校準(zhǔn),也無法斷定在所有波長下的響應(yīng)都是相同的,因此受到當(dāng)前方法的限制,假設(shè)儀器響應(yīng)曲線為平直線,即響應(yīng)值與波長無關(guān)。在以下建立的不確定度模型也是基于這樣的假設(shè)。

1.4.2 細(xì)胞色素C的測試結(jié)果

對2個平行樣品溶液使用3支光程長1 mm比色皿裝樣,每個重復(fù)6次測量,總計測量36次,得到的CD譜圖經(jīng)過平滑處理后,以250～260 nm附近的平直譜線為基線,記錄譜圖中222 nm附近的峰高值,即為圓二色值,見表2,單位用mdeg表示,數(shù)據(jù)精確到小數(shù)點后兩位。

表2 0.05 mg·mL-1細(xì)胞色素C水溶液的圓二色值Table 2 CD magnitude of Cytochrome C with a concentration of 0.05 mg·mL-1 in pure water

2 結(jié)果與討論

2.1 模型的建立

光學(xué)活性物質(zhì)對于左旋圓偏振光和右旋圓偏振光的吸收是不同的,吸光度的差值與吸光度同樣符合Beer-Lambert定律。

ΔA=c×l×Δε

(1)

式(1)中,ΔA為左、右吸光度值的差值;c為溶液濃度,單位為mol·dm-3;l為比色皿光程長,單位為cm;Δε為左、右摩爾吸光系數(shù)的差值,單位為mol-1·dm3·cm-1。

儀器給出的原值即圓二色值,是光學(xué)活性物質(zhì)吸收左、右圓偏振光后形成的橢圓偏振光的橢圓度,與吸光度差值的關(guān)系為

θ=32.982×ΔA

(2)

聯(lián)合式(1)和式(2),可以得出式(3)

θ=32.982×c×l×Δε

(3)

θ的單位為毫度(millidegree,縮寫為mdeg),是一種非標(biāo)準(zhǔn)的平面角單位,被廣泛用于CD光譜學(xué)領(lǐng)域[15]。1 mdeg等于10-3度或約17.4 μrad。

2.2 不確定度來源分析

根據(jù)式(3)中的函數(shù)關(guān)系,圓二色值的不確定度來源主要有以下幾個方面:測量重復(fù)性;樣品溶液濃度;比色皿光程長;左、右摩爾吸光系數(shù)的差值。2.3節(jié)對以上幾個方面的不確定度進行計算。

2.3 A類不確定度評定

與CD相關(guān)測量的不確定度很大程度來源于儀器本身,潛在的噪聲源包括光源、光電倍增管、光電調(diào)制器、鎖定放大器等,這些與儀器性能相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度可以通過多次重復(fù)測試使用統(tǒng)計學(xué)方法進行評估。環(huán)境溫、濕度的影響也包含在重復(fù)性測量中,下述不再考慮該因素。

對表2中的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,36次平行測試0.05 mg·mL-1的細(xì)胞色素C的圓二色值平均值為-4.527 mdeg,A類標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

由重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.4 B類不確定度評定

2.4.1 蛋白溶液濃度的不確定度

細(xì)胞色素C樣品溶液濃度的不確定度由細(xì)胞色素C的含量不確定度以及配置儲備液及稀釋過程引入,以下分別進行計算。

(1) 查細(xì)胞色素C標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書,相對分子量標(biāo)準(zhǔn)值為12 355,擴展不確定度為16,通過相對分子量推算得其純度的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

(2) 溶液配置過程為:在細(xì)胞色素C樣品瓶中精密加入超純水1 mL,完全溶解后精密移取100 μL至離心管,再精密加入900 μL超純水稀釋,搖勻,精密移取該溶液400 μL至離心管,再精密加入3 600 μL超純水,最終濃度0.05 mg·mL-1。查單道可調(diào)式移液器檢定證書,得1 000 μL容量允差為±1.0%,200 μL容量允差為±1.5%,100 μL容量允差為±2%。配置過程中使用1 000 μL移液器6次,使用200 μL移液器2次,100 μL移液器1次,按三角形分布計算標(biāo)準(zhǔn)不確定度,配置過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

=0.015 6

(3) 蛋白樣品溶液濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

=0.015 6

2.4.2 左、右摩爾吸光系數(shù)差值的不確定度

儀器經(jīng)過校準(zhǔn),假定校準(zhǔn)因子與波長無關(guān),引入校準(zhǔn)因子后的溶液吸光度值公式為:

ΔΑ0=xc0l0Δε0

(4)

ΔΑi=xciliΔεi

(5)

式(4)和式(5)中,校準(zhǔn)因子x相等,因此可得蛋白樣品溶液左、右摩爾吸光系數(shù)差值Δεi為

(6)

式(6)中,Δε0為校準(zhǔn)樣品d-10-樟腦磺酸銨的左、右摩爾吸光系數(shù)差值,是一個指定的文獻值,沒有相關(guān)不確定度[12]。

ΔA0和ΔAi分別為校準(zhǔn)樣品和蛋白樣品的左、右摩爾吸光度,其標(biāo)準(zhǔn)不確定度是由儀器性能決定的,因此是一個統(tǒng)計值,在重復(fù)性的不確定度中已經(jīng)進行評估。

c0和ci分別表示校準(zhǔn)溶液的濃度和蛋白樣品的濃度,溶液濃度的不確定度由樣品的純度及稀釋過程引入,分別進行計算。ci的相對不確定度上文已經(jīng)給出,同理計算c0的不確定度為

l0和li分別為校準(zhǔn)溶液和蛋白溶液的比色皿光程長,其相對不確定度使用數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,li含有3個比色皿的數(shù)據(jù),取其中最大值進行計算。

=0.057

2.5 0.05 mg·mL-1細(xì)胞色素C水溶液的圓二色值的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

上述測定中各不確定度分量互不相關(guān),則0.05 mg·mL-1細(xì)胞色素C水溶液的圓二色值的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uθ(X)為

=0.270 mdeg

2.6 擴展不確定度U

取置信概率P=95%,包含因子kp=2,則其擴展不確定度為U=kp×uθ(X)=2×0.270=0.54 mdeg。

2.7 測定結(jié)果的表示

結(jié)果保留小數(shù)點后兩位,0.05 mg·mL-1細(xì)胞色素C水溶液的圓二色值表示為:θ=(-4.53±0.54) mdeg,k=2,P=95%。將以上不確定度分量列于表3。

表3 不確定度分量列表Table 3 List of uncertainty components

通過表3可以看出,不確定分量最大的是1 mm比色皿光程長不確定度,在本文中該值使用測試數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差進行計算,涉及譜圖中譜峰強度和基線噪音,譜圖的平滑等。真實的光程長可以用兩種方法來測量[10,12],一是使用鉻酸鉀溶液在273 nm的吸收,二是干涉法,將比色皿放置在光譜儀中,并計算兩個波長和之間的完整干涉條紋的數(shù)量。無論哪種方法測得,最終的光程長會受到樣品粘度的影響。比色皿基線可能會受到殘留的蛋白污染,如果譜圖中基線偏移大于5 mdeg,則需要清洗比色皿后再行測試。30%鹽酸+70%乙醇溶液,發(fā)煙硝酸或重鉻酸鉀-硫酸洗液均可以用來清洗比色皿中殘留蛋白污染物[10]。選擇高質(zhì)量的比色皿也是獲得高質(zhì)量譜圖的關(guān)鍵。

為了降低1 mm比色皿光程長不確定度,首先要使用高質(zhì)量的或者有計量合格證書的比色皿;第二,在測試蛋白樣品前,先測試空白溶液的CD譜,確認(rèn)比色皿干凈、基線偏移小于5 mdeg后再開始測試蛋白樣品溶液;第三,選擇合適的蛋白溶液濃度,不能過高也不宜過低。過高的濃度導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間的聚集,但如果太稀,在樣品溶液與玻璃移液管和試管接觸中可能會因吸附在玻璃表面而導(dǎo)致蛋白質(zhì)損失,影響測試的準(zhǔn)確性。一般CD測量是在相對稀釋的蛋白質(zhì)溶液(0.01～0.2 mg·mL-1)上進行的,樣品在感興趣波長范圍內(nèi)的最大吸光度值不得超過2,最佳值為在信噪比最大的波長處吸光度值0.87;第四,保持CD光譜采集參數(shù)一致且合適,為了防止光譜變形,推薦經(jīng)驗的儀器參數(shù)設(shè)置選擇為:掃描速度×響應(yīng)時間<帶寬(band width)<光譜特征寬度(一般蛋白質(zhì)的寬度為15 nm)/ 10。比如本文采用的測試參數(shù)為:掃描速度50 nm·min-1,響應(yīng)時間1 s,帶寬1 nm。第五,保持處理CD光譜的參數(shù)一致。直接采集到無需處理的高質(zhì)量CD光譜耗時較長,一般情況下,CD光譜需要經(jīng)過平滑降噪處理后進行二級結(jié)構(gòu)計算、解卷積分析或其他的比較。

另外一個較大的分量為溶液的不確定度,其中貢獻占比大的是校準(zhǔn)溶液和蛋白溶液的配置和稀釋過程。在這個溶液配置過程中,盡量減少稀釋次數(shù),使用檢定合格的容量瓶或移液器等可以減少其對不確定度的貢獻。

3 結(jié) 論

CD光譜學(xué)是一種廣泛使用的評估蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)的技術(shù),計算結(jié)果的可靠性與CD原始光譜圖的質(zhì)量直接相關(guān)。建立了CD光譜測試的簡單模型,并使用它來評估一個α-螺旋主導(dǎo)蛋白質(zhì)—細(xì)胞色素C在固定濃度0.05 mg·mL-1下的圓二色值的不確定度。這些不確定度既與隨機因素有關(guān),可以從重復(fù)測量中得出(A型評估),也與測試過程相關(guān),只能采用非統(tǒng)計學(xué)方法進行評估(B型評估)?？傮w考慮了儀器性能、蛋白溶液濃度、校準(zhǔn)溶液濃度、比色皿的光程長、左、右摩爾吸光系數(shù)帶來的不確定度,并使用可靠的校正因子k=2,在對儀器進行校準(zhǔn)的情況下,評估了0.05 mg·mL-1細(xì)胞色素C在波長為222 nm處的圓二色值不確定度,為±0.54 mdeg。通過不確定度的評定,找出影響測量結(jié)果準(zhǔn)確性的主要因素,其中較為顯著的不確定度分量為1 mm比色皿光程長不確定度和溶液配置、稀釋過程引入的不確定度,設(shè)法消除或降低這些因素的影響,可以改進測量方法。以測量不確定度的評定為工具,解剖分析測量過程,探討CD數(shù)據(jù)的可比性和可靠性,為準(zhǔn)確評估蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ),并為進一步開展CD光譜的實驗室間比對提供實驗參考。