基于丙二酸-酒石酸振蕩體系的紅花電化學指紋圖譜研究*

何昌芬，馬 玲，杜寶中，盧新義，康杰芳

(1 西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室，陜西師范大學生命科學學院，陜西 西安 710119；2 西安理工大學 應用化學系，陜西 西安 710048；3 陜西步長制藥有限公司，陜西 西安 710075)

紅花(Carthami Flos)是菊科植物紅花(CarthamustinctoriusL.)的干燥管狀花，是中國傳統(tǒng)的活血化瘀中藥材，具有活血通經(jīng)，散瘀止痛等功效[1]。紅花還是近五十年來新興的主要油料作物之一，因其含有高品質(zhì)的油脂，可用于降低血液中膽固醇水平，治療骨質(zhì)疏松癥和風濕病[2-3]?，F(xiàn)代藥理研究表明紅花對心腦血管疾病、冠心病有一定的治療作用[4]。紅花起源于南亞，在中國、印度、法國和埃及等國都有種植，在我國主要分布于新疆、云南和甘肅，其中新疆是紅花的最大栽培種植區(qū)，出產(chǎn)的紅花質(zhì)量好、療效高、品質(zhì)優(yōu)良，河南、浙江和四川等地也曾有大規(guī)模的栽培種植[5-7]。

近年來，市場上中藥的質(zhì)量參差不齊，紅花的摻假摻偽現(xiàn)象屢屢發(fā)生，傳統(tǒng)紅花鑒別及質(zhì)量評價方法有性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別、色譜鑒別和光譜鑒別等[8]，這些鑒別方法和實驗分析手段往往具有難以避免的缺陷。性狀鑒別、顯微鑒別和理化鑒別準確性欠佳、步驟繁瑣；色譜鑒別樣品前處理復雜且難以全面呈現(xiàn)中藥的整體特性，其中液相色譜適用于真溶液體系，氣相色譜適用于中藥揮發(fā)性成分的分析；光譜鑒別中，紫外吸收光譜適用于分析中藥中的不飽和組分，紅外光譜與拉曼光譜只呈現(xiàn)中藥的部分結(jié)構和官能團信息，核磁共振作為中藥的定量分析的手段，雖然專屬性強、準確度高，但其樣品前處理復雜、檢測分析成本高[9-10，22]。

1 材 料

1.1 儀器和試劑

HH-6B恒溫水浴鍋，江蘇常州國華電器有限公司；CHI660D電化學工作站，天津蘭力克科技有限公司；217型參比電極和902型工作電極，上海精密科學儀器有限公司；JJ-1電動攪拌器，江蘇常州國華電器有限公司；150 mL四口燒瓶，西安玻璃儀器有限公司。

硫酸，上海蘇懿化學試劑有限公司；丙二酸、酒石酸，國藥集團化學試劑有限公司；四水合硫酸高鈰，上海市化學試劑有限公司；溴酸鉀、硝酸鉀、氯化鉀，天津市光復精細化工研究所。所用試劑均為分析純，溶液均使用二次蒸餾水配制。

1.2 藥材樣品信息

紅花于2017年10月采自新疆、山東、河南、甘肅、青海和云南6個不同產(chǎn)地，均由陜西步長制藥有限公司提供，經(jīng)陜西師范大學生命科學學院張小卉教授鑒定為菊科植物紅花(CarthamustinctoriusL.)的干燥管狀花。樣品信息見表1。

表1 紅花樣品信息Table 1 Carthami Flos sample information

續(xù)表1

2 方 法

將電熱恒溫水浴鍋水溫恒定在37 ℃，在夾套反應器的150 mL四口燒瓶中加入干燥至恒重的1.0 g紅花粉末(粉末過100目，粒徑<0.15 mm)，分別依次加入15 mL硫酸溶液(2.0 mol·L-1)，10 mL硫酸高鈰溶液(0.01 mol·L-1)，10 mL酒石酸(0.011 mol·L-1)和10 mL丙二酸溶液(0.1 mol·L-1)。恒定浸出時間為15 min，轉(zhuǎn)速為400 r·min-1。蓋好夾套反應器蓋，開啟計算機及攪拌器，恒溫恒速攪拌5 min后，迅速用注射器加入濃度為0.2 mol·L-1的溴酸鉀溶液5 mL。用Origin軟件采集數(shù)據(jù)并記錄E-t曲線，直至電位振蕩消失，即得到紅花的電化學指紋圖譜。

3 結(jié)果與討論

3.1 振蕩體系原理

3.2 空白體系的穩(wěn)定性

在中藥電化學指紋圖譜的研究中，調(diào)試空白體系的穩(wěn)定性至關重要。本實驗按照“2”項下的方法，以B-Z空白體系圖譜特征參數(shù)誘導時間(t0)、振蕩期(td)、振蕩周期(T)、最大振幅(ΔE)、最高電位(Emax)、最低電位(Emin)和平衡電位(Ea)為考察指標，平行測定3次，結(jié)果見圖1和表2。圖1顯示該空白體系的誘導曲線、振蕩曲線和停振曲線良好，每次空白測定中指紋圖譜的各個特征參數(shù)基本穩(wěn)定。表2顯示圖譜特征參數(shù)的RSD<1.55%，表明該B-Z空白振蕩體系具有良好的穩(wěn)定性，有利于圖譜特征參數(shù)信息的分析。

圖1 空白體系電化學圖譜Fig.1 The electrochemical fingerprint of blank system

表2 空白體系電化學圖譜穩(wěn)定性Table 2 The stability of electrochemical fingerprint of blank system (n=3)

3.3 酸度對空白體系穩(wěn)定性的影響

按照“2”項下的方法，在溫度為37 ℃時，考察不同濃度硫酸溶液(0.5 mol·L-1、0.7 mol·L-1、1.1 mol·L-1、1.5 mol·L-1、2.0 mol·L-1)對空白體系穩(wěn)定性的影響。由表3可知，當c(H+)為 0.5 mol·L-1時，未檢測到各圖譜特征參數(shù)；隨著濃度增加，誘導時間逐漸縮短，振蕩周期、振蕩期、平衡電位和最高電位增大，最終確定振蕩體系的最佳濃度c(H+)為 2 mol·L-1。進一步通過單因素對比實驗篩選出振蕩體系其它組分的最佳濃度：丙二酸溶液濃度為0.1 mol·L-1、硫酸高鈰溶液濃度為0.01 mol·L-1、酒石酸溶液濃度為0.011 mol·L-1、溴酸鉀溶液濃度為0.8 mol·L-1。

表3 酸度對空白體系電化學圖譜穩(wěn)定性的影響Table 3 The influence of acidity on the stability of electrochemical fingerprint of blank system

3.4 不同溫度對振蕩體系的影響

精密稱取干燥至恒重的1.0 g紅花粉末(粒徑<0.15 mm)，按照“2”項下的方法，測定在溫度為25 ℃、29 ℃、33 ℃、37 ℃、41 ℃時的紅花電化學指紋圖譜，考察不同溫度對紅花指紋圖譜的影響，見表4。結(jié)果顯示，隨著溫度升高，紅花中有效成分溶出量增加，反應速率加快，誘導期、振蕩周期和振蕩期變短，最大振幅、平衡電位、最高電位和最低電位增大，綜合分析確定最佳溫度為37 ℃。

表4 不同溫度下紅花電化學圖譜參數(shù)Table 4 Electrochemical fingerprint parameters of Carthami Flos at different temperatures

3.5 不同浸出時間對振蕩體系的影響

精密稱取干燥至恒重的1.0 g紅花粉末(粒徑<0.15 mm)，按照“2”項下的方法，在37 ℃恒溫水浴下浸泡5 min、10 min、15 min、20 min、25 min，考察不同浸出時間對紅花指紋圖譜的影響，測定結(jié)果見表5。隨著浸出時間延長，紅花有效成分溶出率增加，對體系的干擾增強，誘導期明顯延長，振蕩期、振蕩周期和最大振幅明顯減小。對中藥圖譜信息數(shù)據(jù)分析有利的各個參數(shù)基本特征是：較短的誘導時間和振蕩周期，較大的振蕩幅度以及較為合適的振蕩期?？紤]紅花具有最大溶出率，為獲得振蕩波形特異且穩(wěn)定的紅花指紋圖譜，確定最佳浸出時間為15 min。

表5 不同浸出時間紅花電化學圖譜參數(shù)Table 5 Electrochemical fingerprint parameters of Carthami Flos at different leaching time

3.6 樣品加入量對電化學圖譜的影響

分別加入干燥至恒重的紅花粉末(粒徑<0.15 mm)0.5 g、1.0 g、1.5 g、2.0 g、2.5 g，按照“2”項下的方法考察不同紅花粉末加入量對電化學指紋圖譜的影響，結(jié)果見圖2、圖3和表6。圖2和圖3顯示，紅花加入量分別與誘導時間和振蕩周期呈線性關系，回歸方程分別為t誘導=164.6 m+1024、T=-4.042 m+155.7，相關系數(shù)分別為0.9298、0.9522，線性范圍為 0.5～2.5 g。表6顯示，隨著紅花加入量增多，誘導時間延長，振蕩周期、振蕩期、最大振幅和最高電位減小。當體系中樣品濃度超過振蕩體系負載的最佳濃度以后，逐漸表現(xiàn)出對振蕩體系的抑制作用。本實驗最終確定紅花加入量為1.0 g，該條件下振蕩期和振蕩幅度適中，誘導期較短，圖譜參數(shù)信息顯著。

圖2 紅花加入量與誘導時間的線性關系Fig.2 Linear relationship between Carthami Flos addition dosage and induction time

圖3 紅花加入量與振蕩周期的線性關系Fig.3 Linear relationship between Carthami Flos addition dosage and oscillation period

表6 不同樣品加入量紅花電化學圖譜參數(shù)Table 6 Electrochemical fingerprint parameters of Carthami Flos at different addition dosage

3.7 電化學指紋圖譜的圖譜重現(xiàn)性

任意取一份紅花樣品，按照“2”項下的方法平行測定3次，結(jié)果見表7。表7顯示，3次結(jié)果中誘導時間、振蕩周期、振蕩期、平衡電位、最大振幅、最低電位和最高電位雖有所變化，但均在誤差允許的范圍內(nèi)上下浮動，7個特征參數(shù)的RSD≤2.09%，表明在該振蕩體系下，紅花電化學指紋圖譜具有良好的重現(xiàn)性。

表7 紅花的電化學圖譜重現(xiàn)性Table 7 Reproducibility of electrochemical fingerprint of Carthami Flos

3.8 不同產(chǎn)地紅花的電化學指紋圖譜測定

精密稱取32批紅花粉末各1.0 g，按照“2”項下的方法測定紅花的電化學指紋圖譜，并獲取相應的圖譜特征參數(shù)和E-t曲線，見圖4和表8。結(jié)果顯示各個產(chǎn)地紅花指紋圖譜E-t曲線的誘導時間、平衡電位、振蕩周期、振蕩期、起始電位、最大振幅和最高電位各有差異，表明由于受環(huán)境、氣候、地理位置和土壤因素等多種條件的影響，紅花中所含化學成分的種類和含量各有差異，加入B-Z振蕩體系后對體系的干擾強度不一，從而導致各個產(chǎn)地紅花的誘導曲線、振蕩曲線和振蕩波形各不相同，這些特征均有助于對紅花質(zhì)量進行評價，對不同品種、不同產(chǎn)地的紅花進行鑒別區(qū)分。

圖4 不同產(chǎn)地紅花電化學指紋圖譜Fig.4 Electrochemical fingerprints of Carthami Flos from different areas

表8 不同產(chǎn)地紅花電化學圖譜參數(shù)Table 8 Electrochemical fingerprint parameters of Carthami Flos from different areas

4 結(jié) 論