新型異噻唑啉酮衍生物抑菌活性及作用機制研究

周 靜,閆林林,薛 超,宋曉寧,劉靖麗,張炳燭*

(1.陜西中醫(yī)藥大學藥學院,陜西 咸陽 712046;2.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學院,河北 石家莊 050026;3.西安近代化學研究所,陜西 西安 710065;4.河北工業(yè)大學化工學院,天津 300401)

異噻唑啉酮類化合物具有高效、易降解、環(huán)境友好等特點[1],其對細菌[2]、真菌[2]、藻類[3]都具有很高的抑制活性,還具有抗炎、止痛、解熱[4]、解痙[5]、抗血小板凝集[6]等生理活性,被廣泛應用于涂料、造紙、皮革、工業(yè)循環(huán)水、農(nóng)藥、海洋防污及化妝品等領(lǐng)域[7]。亞砜結(jié)構(gòu)具有重要的生理活性,在醫(yī)藥和農(nóng)藥領(lǐng)域被廣泛應用[8]。為了尋找抑菌活性更高、抑菌范圍更廣、毒性更低的抑菌劑,作者所在研究團隊[9]在五元環(huán)雙鍵上引入不同取代基,并引入2個羰基,以增加分子與靶點形成氫鍵的可能性,進而增強分子與靶點的結(jié)合度,合成了21個帶有亞砜結(jié)構(gòu)的多羰基新型異噻唑啉酮衍生物1a～1q、2、3、4(圖1)。

圖1 異噻唑啉酮衍生物Fig.1 Isothiazolinone derivatives

葡糖胺-6-磷酸合成酶(G-6-P合酶)催化D-果糖-6-磷酸和L-谷氨酰胺分別生成葡糖胺-6-磷酸和谷氨酸,是己糖胺代謝和細胞壁合成反應的第一步,終產(chǎn)物N-乙酰葡糖胺是細菌細胞壁構(gòu)建的基本模塊。因此,G-6-P合酶是抑菌劑的重要靶點[10]。

基于此,作者以金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、煙草青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)和大腸桿菌(Escherichiacoli)為供試菌,采用濾紙片擴散法測定20個新型異噻唑啉酮衍生物的抑菌活性;選取高抑菌活性衍生物,使用AutoDock軟件進行分子對接,分析其與G-6-P合酶的相互作用模式;運用密度泛函(DFT)方法對高抑菌活性衍生物的分子靜電勢進行理論計算,揭示化合物結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系。

1 實驗

1.1 供試菌、培養(yǎng)基與試劑

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、煙草青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)、大腸桿菌(Escherichiacoli),均由西北農(nóng)林科技大學農(nóng)藥研究所提供。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏5.0 g,蛋白胨10.0 g,氯化鈉15.0 g,蒸餾水800 mL,瓊脂15.0 g。

所用試劑均為市售分析純;液體試劑用前均按照標準操作進行純化處理。

1.2 方法

1.2.1 抑菌活性測定

采用濾紙片擴散法測定抑菌活性。將提前活化好的細菌用無菌水刷下來,制成菌懸液,然后和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基混勻,取3 mL于直徑9 mm的培養(yǎng)皿中,制成帶菌培養(yǎng)基。將20個新型異噻唑啉酮衍生物分別溶于丙酮,配制成1 000 μg·mL-1的衍生物溶液;吸取5 μL衍生物溶液,涂在直徑5 mm的濾紙片上,晾干,以相同濃度的鏈霉素為陽性對照、丙酮為空白對照,每組設(shè)置3個平行實驗;將晾干的濾紙片貼在帶菌培養(yǎng)基上,每皿貼3片,并確保濾紙片完全貼敷于培養(yǎng)基上,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時間(4～10 h),用十字交叉法測量抑菌圈直徑,觀察抑菌圈透明度。

1.2.2 分子對接模擬

從PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org)中選取Mouilleron等[11]報道的G-6-P合酶(PDB ID:2VF5)作為受體,選取高抑菌活性衍生物作為配體,使用AutoDock 4.2軟件進行分子對接研究,使用ChemDraw Ultra 19.0軟件進行三維定向繪制和優(yōu)化,并使衍生物能量最小化,使用PyMOL軟件對配體-蛋白質(zhì)相互作用進行可視化分析。

1.2.3 分子靜電勢計算

選取高抑菌活性衍生物為研究對象,采用DFT方法,在B3LYP/6-311++G**水平上進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和頻率計算。最優(yōu)結(jié)構(gòu)均無虛頻,說明優(yōu)化得到的是能量極小的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上計算衍生物的分子靜電勢和NBO(natural bond orbital)電荷。所有計算均由Gaussian 16程序完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 新型異噻唑啉酮衍生物的抑菌活性

采用濾紙片擴散法測定了20個新型異噻唑啉酮衍生物對5種供試菌的抑菌活性,結(jié)果見表1。

表1 20個新型異噻唑啉酮衍生物對5種供試菌的抑菌活性Tab.1 Antibacterial activities of 20 novel isothiazolinone derivatives to 5 tested bacteria

由表1可知:與鏈霉素相比,11個衍生物(1a、1c、1d、1f、1g、1i、1j、1k、1l、1q、4)對蠟狀芽孢桿菌具有一定的抑制作用,說明衍生物分子空間結(jié)構(gòu)對抑菌活性有一定影響,且R2不宜為強吸電子基團;3個衍生物(1c、1g、1i)對枯草芽孢桿菌具有一定的抑制作用,說明當五元環(huán)氮原子上連有苯環(huán)且苯環(huán)上沒有吸電子基團時,抑菌活性較高;3個衍生物(1a、1c、1h)對煙草青枯病菌具有一定的抑制作用,說明當R1為苯或取代苯、五元雜環(huán)上有甲基酮時,抑菌活性較高;3個衍生物(1a、1c、1i)對大腸桿菌具有一定的抑制作用,說明當五元環(huán)氮原子上連有苯環(huán)且苯環(huán)上為弱給電子基團、五元雜環(huán)上有甲基酮時,抑菌活性較高;衍生物1a和1c對蠟狀芽孢桿菌、煙草青枯病菌和大腸桿菌的抑制作用尤為突出;衍生物1g對5種供試菌均具有一定的抑制作用,尤其是對蠟狀芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用較強;衍生物1h、1i對蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、煙草青枯病菌和大腸桿菌均具有一定的抑制作用,其中1i對蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑制作用均高于鏈霉素。

2.2 新型異噻唑啉酮衍生物的抑菌機制

為了研究新型異噻唑啉酮衍生物的抑菌機制,驗證配體-受體結(jié)合,選取高抑制活性的異噻唑啉酮衍生物1a、1c、1g、1h、1i作為配體,分別與受體G-6-P合酶進行分子對接,其對接結(jié)合能與氫鍵見表2,作用模式見圖2。

圖2 分子對接作用模式Fig.2 Action mode of molecular docking

由表2和圖2可知,5個高抑菌活性衍生物與G-6-P合酶口袋中的不同氨基酸均有較好的結(jié)合。其中抑菌活性最高的衍生物1c與G-6-P合酶的結(jié)合模式三維圖如圖3所示。

由圖3可知,衍生物1c通過氫鍵、π-烷基、π-S、碳氫相互作用等多種方式與受體G-6-P合酶很好地對接。衍生物1c分別與受體G-6-P合酶的Gln348(d=2.0 ?)、Ser303(d=1.8 ?)、Thr302(d=2.1 ?、2.7 ?)形成4個氫鍵,這些氫鍵的形成使得它們的結(jié)合更緊密;此外,各種疏水作用力也使得衍生物1c能以較小的能量穩(wěn)定結(jié)合在G-6-P合酶口袋中。表明,新型異噻唑啉酮衍生物尤其是1c可以與G-6-P合酶很好地結(jié)合,其抑菌機制可能是新型異噻唑啉酮衍生物很好地抑制了G-6-P合酶活性。

2.3 新型異噻唑啉酮衍生物的分子靜電勢

分子的靜電勢可以預測藥物分子的活性位點,揭示藥物分子與受體蛋白之間的相互作用,闡明藥物分子的結(jié)構(gòu)與藥理活性之間的關(guān)系。在B3LYP/6-311++G**水平上計算5個高抑菌活性異噻唑啉酮衍生物的分子靜電勢,結(jié)果如圖4所示。

注:深色區(qū)域代表負的靜電勢區(qū)域,是衍生物親電反應的活性位點;淺色區(qū)域代表正的靜電勢區(qū)域,是衍生物親核反應的活性位點。圖4 5種高抑菌活性異噻唑啉酮衍生物的分子靜電勢Fig.4 Molecular electrostatic potential of 5 isothiazolinone derivatives with high antibacterial activity

藥物分子周圍的靜電勢映射的差異反映其活性位點與受體結(jié)合的強弱。由圖4可知,負的靜電勢區(qū)域(深色區(qū)域)分布在衍生物的羰基和亞砜基團上,正的靜電勢區(qū)域(淺色區(qū)域)分布在苯環(huán)上,表明這些區(qū)域是衍生物的活性位點,可以與受體G-6-P合酶發(fā)生相互作用。這一結(jié)論與分子對接結(jié)果一致。

3 結(jié)論

采用濾紙片擴散法測定了20個新型異噻唑啉酮衍生物對5種常見細菌的抑菌活性,篩選到5個高抑菌活性衍生物,這5個衍生物均能通過氫鍵、π-烷基、π-S和碳氫相互作用等多種方式與G-6-P合酶較好地結(jié)合,多個羰基和亞砜結(jié)構(gòu)的存在起到了關(guān)鍵作用。分子靜電勢分析表明,負靜電勢的羰基和亞砜基團區(qū)域是衍生物的活性位點,可以與受體G-6-P合酶發(fā)生相互作用。新型異噻唑啉酮衍生物的抑菌機制可能是很好地抑制了G-6-P合酶活性。該類多羰基含亞砜結(jié)構(gòu)的異噻唑啉酮衍生物具有進一步研究的意義和潛在的應用價值。