高效液相色譜法測定飲料中的葉黃素酯

◎ 穆姝夷，黃維皓，周朗君，李綺淇，劉夢妮，何敏恒

（1.廣州檢驗檢測認(rèn)證集團有限公司，廣東 廣州 511447；2.國家加工食品質(zhì)量檢驗檢測中心（廣東），廣東 廣州 511447；3.通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司廣州分公司，廣東 廣州 510663）

葉黃素是一種類胡蘿卜素，是存在于人眼視網(wǎng)膜黃斑區(qū)的主要色素，能夠幫助視網(wǎng)膜抵御紫外線，具有較強的抗氧化作用[1]。人體不能合成葉黃素，只能從食物中攝取[2]。葉黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有多個共軛雙鍵，容易被氧化失去生物活性[3]。葉黃素酯是葉黃素與長鏈不飽和脂肪酸形成的酯，是葉黃素在植物中的主要存在形式，在自然界中分布廣泛，經(jīng)人體吸收后分解為游離態(tài)葉黃素[3]。葉黃素酯是多種酯的混合物，包括單酯、雙酯和混合雙酯，其中二棕櫚酸酯是最主要的酯[4]。葉黃素酯的功效與葉黃素相當(dāng)，且對于溫度、光照的穩(wěn)定性更強，在運輸保存過程中損失較小，適合作為功效成分添加到食品中[5]。

食品添加劑聯(lián)合專家委員會在2004 年建議將提取自萬壽菊屬的純度為70%的游離葉黃素作為食品添加劑；美國食品藥品安全監(jiān)督管理局在1995 年已將葉黃素列入食物補充劑名單，于2008 年規(guī)定葉黃素補充劑量為20 mg·d-1[1]；我國已批準(zhǔn)將以萬壽菊油樹脂為原料的葉黃素作為食品添加劑[6]，并發(fā)布了國家標(biāo)準(zhǔn)《食品添加劑 葉黃素》（GB 26405—2011）[7]；我國衛(wèi)生部批準(zhǔn)葉黃素可添加到嬰幼兒配方食品中[8]。2008 年，國家衛(wèi)生部確立批準(zhǔn)葉黃素酯為功能性新資源食品[9]，含有葉黃素酯成分的飲料、軟糖、壓片糖果等在市場上越來越受歡迎，行業(yè)發(fā)展呈現(xiàn)穩(wěn)定上升的趨勢。

常用的檢測食品中葉黃素含量的方法有紫外-可見分光光度法、高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[10-16]。紫外-可見分光光度法是將樣品中的類胡蘿卜素全部提取出來并測定吸光度，計算總類胡蘿卜素含量，再經(jīng)過液相色譜分離確定總類胡蘿卜素組成，從而得出葉黃素組分的含量，該方法容易受樣品基質(zhì)的干擾，定量穩(wěn)定性差；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定葉黃素的含量對于常量添加定量不準(zhǔn)確，儀器價格昂貴；高效液相色譜法測定葉黃素含量穩(wěn)定性高，定量準(zhǔn)確，對儀器性能要求較低，是目前最常用的檢測方法。食品中葉黃素的檢測方法通常參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中葉黃素的測定》（GB 5009.248—2016）[17]，脂肪含量高的食品需經(jīng)氫氧化鉀溶液室溫皂化，以使葉黃素游離，再用混合溶劑提取，該條件并不能使葉黃素酯轉(zhuǎn)化成葉黃素，可能是飲料中存在的水使皂化效率降低，因此不適用于葉黃素酯的檢測，且國標(biāo)中沒有檢測葉黃素酯的方法。本文探究了一種飲料中葉黃素酯的檢測方法，對樣品中的葉黃素酯先進行預(yù)萃取，并比較了不同條件對測定結(jié)果的影響，可為葉黃素酯的測定研究和市場監(jiān)管提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、叔丁基甲醚（色譜純，美國飛世爾公司）；氯化鈉、無水乙醇、石油醚、正己烷、二氯甲烷、乙醚、氫氧化鉀（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%，Anpel）。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫1260 型液相色譜儀（美國安捷倫公司）；MS 3 數(shù)顯型渦旋振蕩器（德國IKA 公司）；百分之一分析天平（瑞士梅特勒-托利多國際股份有限公司）；超純水機（中國重慶艾科浦科技有限公司）；低速離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；恒溫振蕩水浴器（北京萊伯泰科儀器股份有限公司）；氮吹濃縮儀（瑞典Biotage 集團）。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：YMC 類胡蘿卜素色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A 為甲醇，B 為叔丁基甲醚，梯度洗脫程序見表1；流速：1.00 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進樣量：50 μL；檢測波長：445 nm。

表1 液相色譜梯度洗脫程序表

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取約2 mg 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL 棕色容量瓶中，用無水乙醇溶解后定容至刻度并混勻，即為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。移取適量體積的儲備液，用無水乙醇稀釋，配制成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，用于外標(biāo)法定量。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液校正

葉黃素標(biāo)準(zhǔn)儲備液使用前需要校正，取1 mL 標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用無水乙醇稀釋定容至10 mL，紫外分光光度計測定其吸光度，測定3 次，取平均值，根據(jù)式（1）計算標(biāo)準(zhǔn)儲備液的實際濃度。

式中：X為標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度，mg·L-1；A為標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度；2 550 為無水乙醇中葉黃素的吸光系數(shù)，dL·g-1；10 為稀釋倍數(shù)；10 000 為單位轉(zhuǎn)換系數(shù)，g·dL-1轉(zhuǎn)換為mg·L-1；F為校正系數(shù)，用液相色譜分析標(biāo)準(zhǔn)工作液后計算得出，反式葉黃素峰面積除以順式與反式葉黃素峰加合總峰面積所得值為校正系數(shù)。

1.3.4 樣品前處理

稱取飲料樣品5 g（精確至0.01 g）于50 mL 塑料離心管中，加入10 mL 超純水渦旋混合，加入約5 g 氯化鈉，渦旋30 s 破壁，再加入10 mL 無水乙醇，渦旋30 s，使體系分散均勻。分3次加入石油醚（15 mL+15 mL）進行萃取，渦旋1 min 后靜置分層，收集合并上層溶液至氮吹管中，36 ℃氮吹至近干。向氮吹管中加入異丙醇復(fù)溶，轉(zhuǎn)移至25 mL 棕色容量瓶，并加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的氫氧化鉀溶液，用異丙醇定容至刻度，搖勻后轉(zhuǎn)移至塑料離心管，60 ℃避光水浴振蕩皂化30 min。冷卻后取1 mL 皂化液于15 mL 塑料離心管，加入2 mL 正己烷渦旋振蕩1 min，再加入約10 mL 超純水，上下輕輕振搖3 次水洗，等待分層后吸取上層溶液，用無水乙醇稀釋，0.45 μm 濾膜過濾后經(jīng)高效液相色譜儀測定。由于葉黃素對光敏感，所有實驗操作應(yīng)在無500 nm 以下紫外光的黃色光源或紅色光源環(huán)境中進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 加入淀粉酶的影響

為了探究飲料中添加的葉黃素酯微囊粉原料壁材是否存在淀粉影響預(yù)萃取效率的情況，對樣品進行了淀粉酶酶解30 min 與不加淀粉酶的比較。數(shù)據(jù)對比發(fā)現(xiàn)加入淀粉酶的葉黃素酯測定結(jié)果比不酶解的低32.7%，說明加入淀粉酶不能提高萃取效率，而且還會造成損失。因此，飲料基質(zhì)不需要淀粉酶酶解。

2.2 加入氯化鈉和無水乙醇的影響

根據(jù)美國藥典中葉黃素制劑的方法，添加氯化鈉對葉黃素酯微囊粉破壁有作用[5]，加入無水乙醇可以使葉黃素酯在溶液中分散得更加均勻，因此對是否加入氯化鈉和無水乙醇進行了對比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不加氯化鈉比加入氯化鈉的葉黃素酯測定結(jié)果低58.8%，不加無水乙醇比加入無水乙醇的葉黃素酯測定結(jié)果低83.1%。因此，選擇萃取前加入氯化鈉和無水乙醇對體系進行破壁分散。

2.3 萃取溶劑的選擇

根據(jù)葉黃素酯在有機溶劑中的溶解性，選擇以下試劑對比萃取效果，結(jié)果見圖1。其中，二氯甲烷萃取葉黃素酯測定結(jié)果最低，石油醚、乙醚、正己烷葉黃素酯測定結(jié)果接近，但乙醚對人體和環(huán)境危害較大，且易制毒，受到公安部門管制，正己烷沸點較高，氮吹時不如石油醚易吹干。綜合考慮，選擇石油醚作為萃取溶劑。

圖1 不同萃取溶劑結(jié)果對比圖

2.4 萃取體積的選擇

確定石油醚作為萃取溶劑后比較不同體積、萃取次數(shù)的萃取效果，結(jié)果見圖2。其中，使用30 mL、20 mL石油醚單次萃取結(jié)果偏低，說明只進行一次萃取的效率較低，應(yīng)該選擇多次萃取。當(dāng)萃取次數(shù)增加到6次時，結(jié)果與萃取3 次相同，說明萃取次數(shù)過多不能提高回收率。綜合試劑、時間成本考慮，選擇萃取條件為萃取2 次、每次15 mL。

圖2 不同萃取體積、萃取次數(shù)結(jié)果對比圖

2.5 皂化溶劑的選擇

選取與流動相相溶的異丙醇、無水乙醇、甲醇作為皂化溶劑，對比皂化效果，結(jié)果見圖3。復(fù)溶試劑采取分3 次加入轉(zhuǎn)移的方式，實驗過程中發(fā)現(xiàn)復(fù)溶時無水乙醇和甲醇的溶解度較差，第1 次加入溶劑時氮吹管壁上附著的黃色沉淀超聲處理后不能完全溶解，第3 次加入溶劑洗滌時仍有黃色；異丙醇對氮吹管內(nèi)固體溶解效果較好，第3 次加入溶劑洗滌時基本無色。在皂化溶劑為甲醇時，渦旋萃取后很快分層，下層黃色更深，加入水振搖靜置后上層有機相也比其他皂化溶劑體系顏色淺。對比數(shù)據(jù)，甲醇作為皂化溶劑的測定結(jié)果比異丙醇低80.7%，無水乙醇的測定結(jié)果比異丙醇低10.6%。因此，選擇異丙醇作為皂化溶劑。

圖3 皂化溶劑結(jié)果對比圖

2.6 皂化堿液加入體積的選擇

本實驗選擇50%氫氧化鉀水溶液作為皂化用堿液，對比加入不同堿液體積對結(jié)果的影響，結(jié)果見圖4。當(dāng)堿液加入體積為0.5 mL 和2.0 mL 時，測定結(jié)果相同；體積為1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL 時，測定結(jié)果接近且偏高一些。但除體積0.5 mL 以外，其他體積均出現(xiàn)堿液與異丙醇分層的情況，溶液分成兩相后計算含量可能不準(zhǔn)確。因此，應(yīng)盡量減少堿液體積，選擇1 mL為皂化堿液加入體積。

圖4 不同堿液體積結(jié)果對比圖

實驗還對比了皂化液用乙醇稀釋后直接上機測定和萃取后再上機的結(jié)果，選擇了4 個不同條件的皂化液，皂化液稀釋上機測定結(jié)果均比萃取后上機測定結(jié)果高102%～109%。但皂化液堿性較強，如果不經(jīng)過水洗脫堿步驟直接上機，可能會對儀器管路造成損壞，降低儀器使用壽命。因此，不建議將皂化液直接上機。

2.7 皂化時間的選擇

皂化條件為60 ℃避光水浴振蕩，對比不同水浴皂化時間對結(jié)果的影響，結(jié)果見圖5。15 ～120 min的水浴時間區(qū)間內(nèi)測定結(jié)果基本相同，說明延長水浴皂化時間至120 min 不能提高測定結(jié)果，也沒有降解造成損失。與皂化30 min 水浴相比，水浴30 min 后室溫放置過夜再萃取測定結(jié)果降低，可能是長時間放置導(dǎo)致葉黃素降解，但考慮到基質(zhì)組成不同時，水浴15 min 皂化反應(yīng)可能不完全，因此選擇皂化時間為水浴30 min。

圖5 不同皂化方式結(jié)果對比圖

2.8 檢測波長的選擇

吸取葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液于350 ～600 nm 處進行波長掃描，波長掃描圖見圖6，葉黃素于445 nm 處有最大吸收峰。因此，選擇445 nm 作為測定和校正波長。

圖6 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液波長掃描圖

2.9 線性范圍和檢出限

分別吸取適量校正好的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用無水乙醇定容，配制成0.051 5 ～5.150 0 mg·L-1的6 水平系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用液相色譜儀分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，以上機濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為y=369.69x+3.164，相關(guān)系數(shù)為0.999 98，線性關(guān)系良好。葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖7。

圖7 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

根據(jù)空白加標(biāo)的信噪比，計算得出葉黃素酯的方法檢出限為5.35 mg·kg-1，方法定量限為17.80 mg·kg-1。

2.10 方法回收率和精密度

準(zhǔn)確稱取6 份均勻飲料試樣，進行相同水平的加標(biāo)，按照優(yōu)化后的前處理方法分別對樣品進行測定，結(jié)果見表2，加標(biāo)回收率為93.7%～101.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為2.39%。

表2 加標(biāo)回收實驗結(jié)果表

準(zhǔn)確稱取6 份均勻飲料試樣，按照優(yōu)化后的前處理方法分別對樣品進行精密度測定，結(jié)果見表3，平均值為200 mg·kg-1，精密度為2.24%。

表3 精密度結(jié)果表

3 結(jié)論

本文建立了飲料中葉黃素酯含量的檢測方法，采用YMC 類胡蘿卜素色譜柱，甲醇和叔丁基甲醚為流動相，高效液相色譜儀測定，并對關(guān)鍵步驟進行優(yōu)化，確定一種最佳試驗條件：樣品加入氯化鈉和無水乙醇分散破壁，經(jīng)15 mL 石油醚萃取2 次后吹干溶于異丙醇，加入1 mL 的50%氫氧化鉀溶液，于60 ℃水浴皂化30 min，冷卻后再經(jīng)正己烷萃取，超純水洗滌后無水乙醇稀釋上機測定。該方法具有良好的回收率、重現(xiàn)性和精密度，針對性強，適用于飲料中葉黃素酯含量的檢測，可為葉黃素酯的測定研究和市場監(jiān)管提供參考。