HPLC-UV 法同時(shí)測定胡蘿卜中5 種有機(jī)酸的含量

◎ 呂文超，周春紅，沈瑩萍，楊 陽，段筱筠，令賓強(qiáng)，馬芮萍

（甘肅省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730050)

胡蘿卜（Daucus carotavar.sativaHoffm.），屬傘形科胡蘿卜屬胡蘿卜種的一年生或二年生雙子葉草本植物，亦稱紅蘿卜、金筍或甘荀，在全球范圍內(nèi)種植面積很廣。胡蘿卜屬于根菜類蔬菜，生熟皆可食用，含有多種維生素、氨基酸、微量元素等，其性平、味甘，具有保護(hù)呼吸道等的上皮細(xì)胞組織的功能，降低慢性疾病的發(fā)生率和增強(qiáng)人體免疫力，預(yù)防肺癌、強(qiáng)心、降壓等功效，因此也稱胡蘿卜為“土人參”[1-3]。

有機(jī)酸是植物的重要組成成分，常用的檢測方法有離子色譜法[4-5]、氣相色譜法[6]、毛細(xì)管電泳法[7]、液相色譜法[8]等。氣相色譜法上機(jī)分析測試前需要進(jìn)行衍生化處理，操作煩瑣，重現(xiàn)性較差；毛細(xì)管電泳法速度較快、成本低，但相比于液相色譜法，精密度和靈敏度較差[9-10]。液相色譜法由于操作簡單、準(zhǔn)確度高、精密度好而廣泛應(yīng)用于食品中有機(jī)酸的測定。

目前對胡蘿卜的研究主要集中在不同工藝、不同種植方式對胡蘿卜品質(zhì)的影響方面，而對其有機(jī)酸的含量的研究較少。本研究旨在建立胡蘿卜中5 種有機(jī)酸的液相色譜檢測方法，為加強(qiáng)胡蘿卜的質(zhì)控及后續(xù)的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

U3000 高效液相色譜儀及二極管陣列檢測器，賽默飛世爾公司；C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），北京迪馬科技有限公司；TLE204E 分析天平（精密度為0.000 1 g），梅特勒公司；MS3D 渦旋振蕩器，IKA 公司；KQ-600DE 臺式數(shù)控超聲清洗器，科橋超聲波設(shè)備有限公司。

酒石酸（CAS：133-37-9）、蘋果酸（CAS：6915-15-7）、乳酸（CAS：50-21-5）、檸檬酸（CAS：77-92-9）、丁二酸（CAS：110-15-6）標(biāo)準(zhǔn)品，酒石酸、蘋果酸純度均≥99%，檸檬酸、乳酸、丁二酸濃度為100 μg·mL-1，購于天津阿爾塔科技有限公司；甲醇、甲酸均為色譜純，sigma 公司；其他試劑均為色譜純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 μg·mL-1）：準(zhǔn)確稱取10 mg 標(biāo)準(zhǔn)品，加入甲醇使其溶解并用甲醇定容至10 mL。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制（10 μg·mL-1）：將標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋至10 μg·mL-1。

1.2.2 樣品前處理

參考馬芮萍等[11]的方法，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求略有修改：稱取粉碎試樣2.0 g（精確至0.000 1 g）置于50 mL離心管中，加入20 mL 70%乙醇水溶液，充分勻漿1 min，40 ℃超 聲 提 取30 min，4 000 r·min-1離 心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，在殘?jiān)屑尤?0 mL 70%乙醇水溶液復(fù)提一次，合并上清液，用70%乙醇水溶液定容后過0.22 μm 濾膜，待上HPLC 測定。

1.2.3 儀器條件

色譜條件。色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL，檢測波長210 nm；流動相：甲醇-0.1%甲酸水。

1.2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

參考傅志豐等[10]的方法，從線性關(guān)系、檢出限、定量限、精密度、回收率等方面驗(yàn)證方法的可行性。

（1）線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)及檢出限。將1.2.1 配制好的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液按照色譜條件進(jìn)樣測定，以對照品濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y）做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到5 種有機(jī)酸的線性方程、相關(guān)系數(shù)。以信噪比（S/N）約為3、信噪比（S/N）約為10 得到各成分的檢出限（LOD）、定量限（LOQ）。

（2）精密度和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。精密稱取胡蘿卜樣品1 共6 份，加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用1.2.2 進(jìn)行處理，按照色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算添加水平的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）。

2 結(jié)果與分析

2.1 5 種有機(jī)酸檢測方法的建立

將一定濃度的5 種有機(jī)酸的混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液在波長190 ～400 nm 的波段下進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果如圖1所示。由圖1 可知，酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、丁二酸在210 nm 附近均有較大吸收，結(jié)合參考文獻(xiàn)及國家標(biāo)準(zhǔn)選擇5 種有機(jī)酸的檢測波長為210 nm。

圖1 5 種有機(jī)酸在190 ～400 nm 波段的掃描圖

依據(jù)色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用HPLC 法得到的5 種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜圖如圖2 所示。由圖2可知，5 種有機(jī)酸在10 min 內(nèi)具有較好的分離度。

圖2 5 種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的HPLC 圖

2.2 方法學(xué)考查

2.2.1 線性關(guān)系考查

將系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)依次進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，以待測物濃度為橫坐標(biāo)，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，5 種有機(jī)酸的線性關(guān)系見表1。由表1 可知，在10 ～200 ng·mL-1，5 種有機(jī)酸的響應(yīng)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均≥0.999 12，檢出限（S/N=3）在0.015 8 ～0.060 7 g·kg-1，定量限（S/N=10）在0.052 6 ～0.202 4 g·kg-1。

表1 5 種有機(jī)酸的線性關(guān)系考察表

2.2.2 回收率和精密度

在胡蘿卜樣品1 中添加有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)水平做6 次平行實(shí)驗(yàn)，回收率及精密度結(jié)果見表2。由表2 可知，5 種有機(jī)酸的回收率范圍為85%～115%，RSD 范圍為0.46%～3.20%。方法的準(zhǔn)確性較好，可用于蔬菜中有機(jī)酸的測定。

表2 5 種有機(jī)酸的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表（n=6）

2.3 樣品含量測定

采用建立的方法分別測定了胡蘿卜樣品6 份，結(jié)果如表3 所示。由表3 可知，6 份胡蘿卜樣品中均含有5 種有機(jī)酸，酒石酸含量在0.020 5 ～0.405 0 g·kg-1，蘋 果 酸 含 量 在0.009 3 ～2.265 9 g·kg-1，乳 酸 含 量在0.034 1 ～2.493 9 g·kg-1，檸檬酸含量在0.012 5 ～2.901 1 g·kg-1，丁二酸含量在0.062 1 ～1.214 8 g·kg-1。該方法可準(zhǔn)確地測定胡蘿卜中的酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、丁二酸。

表3 胡蘿卜中5 種有機(jī)酸的含量表 單位：g·kg-1

3 結(jié)論

本研究建立了HPLC-UV 法同時(shí)測定胡蘿卜中5 種有機(jī)酸的方法，其在10 ～200 ng·mL-1，相關(guān)系數(shù)r2均≥0.999，線性關(guān)系良好，檢出限在0.015 8 ～0.060 7 g·kg-1，定量限在0.052 6 ～0.202 4 g·kg-1，回收率范圍為85%～115%，RSD 范圍為0.46%～3.20%。該方法的準(zhǔn)確性較好，操作較簡單，可用于胡蘿卜中5 種有機(jī)酸的測定。