干姜飲片微生物限度檢查方法適用性研究

◎ 魏金梅，鐘國(guó)慶，謝美珍，胡 陽(yáng)，宋曉園，李桂琴，王 磊

（贛州市綜合檢驗(yàn)檢測(cè)院，江西 贛州 341000）

中藥飲片的品質(zhì)決定著中成藥的質(zhì)量，影響著用藥患者的健康安全[1]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典（2020年版）》四部通則1107 中對(duì)直接口服及泡服飲片的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了明確的規(guī)定，相較于2015 年版藥典對(duì)中藥飲片的規(guī)定，新增了需氧菌總數(shù)（限量105CFU·g-1或CFU·mL-1）、霉菌和酵母菌總數(shù)（限量103CFU·g-1或CFU·mL-1）等檢驗(yàn)項(xiàng)目，此外還規(guī)定每1 g 或1 mL供試品中不得檢出大腸埃希菌[2]。這表明，我國(guó)對(duì)中藥飲片的質(zhì)量把控日趨嚴(yán)格，但目前國(guó)內(nèi)仍有許多品種的中藥飲片尚未探究出合適的微生物限度檢查方法。

干姜是姜科植物姜（Zingiber officinaleRose.）的干燥根莖，味辛，性熱，其主要含有揮發(fā)油類、姜辣素類等化合物。干姜是藥食兩用的中藥，在食品和醫(yī)藥行業(yè)應(yīng)用廣泛，具有抗炎抑菌、抗氧化、保護(hù)肝臟和心血管等作用[3]。有研究表明干姜及其提取物姜精油、姜辣素乙醇提取物等具有很好的抑菌效果，其對(duì)銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌等具有較明顯的抑制作用[4-9]。但目前國(guó)內(nèi)并未對(duì)干姜飲片的微生物限度檢查方法進(jìn)行研究。本研究按照《中國(guó)藥典（2020 年版）》四部通則1107、1108 的要求探究中藥飲片干姜的微生物計(jì)數(shù)及控制菌的檢查方法，分析干姜飲片對(duì)不同菌株的抑制作用，為干姜飲品的品質(zhì)把控提供相關(guān)理論依據(jù)，同時(shí)可為含干姜的中成藥如透骨鎮(zhèn)風(fēng)丸、定坤丹等的微生物檢查提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102] 和乙型副傷寒沙門菌[CMCC(B)50094]均為定量質(zhì)控菌，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，經(jīng)菌種確認(rèn)驗(yàn)收合格。

1.2 試藥

干姜飲片購(gòu)買于3 家不同連鎖藥店共3 批藥材，產(chǎn)地均為云南，編號(hào)1、2、3，具體信息見表1。

表1 3 批干姜飲片信息表

1.3 稀釋劑及培養(yǎng)基

pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、腸道增菌液體培養(yǎng)基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基（MB）、RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MA）以及木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（XLD）均購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，經(jīng)培養(yǎng)基適用性檢查驗(yàn)收合格。

1.4 儀器與設(shè)備

101-3-BS 型鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；BKQ-B10011 型壓力蒸汽滅菌器，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；SW-CJ-2FD 型潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BSC-1300IIA2 型生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；IC613CW 型恒溫培養(yǎng)箱，雅馬拓科技貿(mào)易（上海）有限公司。

1.5 方法

1.5.1 菌液制備

（1）接菌培養(yǎng)，制備新鮮的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌的培養(yǎng)物，取新鮮培養(yǎng)物分別用pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液進(jìn)行10 倍系列稀釋，制成含菌數(shù)約為104CFU·mL-1的菌懸液。

（2）取黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加入含0.05%（V/V）吐溫80的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液3～5 mL，將孢子洗脫，并用pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液進(jìn)行10 倍系列稀釋，制成含孢子數(shù)約為104CFU·mL-1的孢子懸液。

1.5.2 供試液的制備

取供試品25 g，用無(wú)菌剪刀將其剪碎，置于滅菌三角瓶中，加滅菌TSB 至總體積為250 mL，充分振搖蕩洗（不少于15 min），取其液體作為1 ∶10 的供試液。取上述1 ∶10 供試液20 mL，置水浴100 ℃30 min處理后迅速冷卻，作為耐熱菌總數(shù)測(cè)定用供試液。

1.5.3 微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

（1）需氧菌總數(shù)、耐熱菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。試驗(yàn)組：分別取1.5.2 項(xiàng)下制備的1 ∶10 供試液及耐熱菌總數(shù)測(cè)定用供試液9.9 mL，加入1.5.1 項(xiàng)下制備好的5 種試驗(yàn)菌液0.1 mL，充分混勻，使每1 mL供試液中含菌量不大于100 CFU。供試品對(duì)照組：分別取1∶10供試液及耐熱菌總數(shù)測(cè)定用供試液9.9 mL，加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基0.1 mL 以代替菌液，充分混勻。菌液對(duì)照組：以胰酪大豆胨液體9.9 mL 替代供試液，加入1.5.1 項(xiàng)下制備好的5 種試驗(yàn)菌液0.1 mL，充分混勻。采用傾注平皿法測(cè)定各菌的回收率，取“試驗(yàn)組”的供試液2 mL，每1 mL 傾注于1 個(gè)滅菌平皿中。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌采用TSA 培養(yǎng)基35 ℃培養(yǎng)3 d，白色念珠菌、黑曲霉采用TSA 培養(yǎng)基平板25 ℃培養(yǎng)5 d，計(jì)數(shù)。按相同方法測(cè)定供試品對(duì)照組的菌落數(shù)及菌液對(duì)照組的菌落數(shù)，以算術(shù)均值作為計(jì)數(shù)結(jié)果。按下列公式計(jì)算回收率（比值）。

（2）霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。采用傾注平皿法。取1.5.2 項(xiàng)下制備的1 ∶10 供試液9.9 mL，分別加入1.5.1 項(xiàng)下制備的白色念珠菌菌液0.1 mL 及黑曲霉孢子懸液0.1 mL，充分混勻。取上述混勻的供試液2 mL，每1 mL 傾注至1 個(gè)平皿，傾注SDA 培養(yǎng)基，待其凝固后25 ℃培養(yǎng)5 d，計(jì)數(shù)。供試品對(duì)照組的菌落數(shù)及菌液對(duì)照組的菌落數(shù)按同法操作測(cè)定，以算術(shù)均值作為計(jì)數(shù)結(jié)果，計(jì)算回收率。

1.5.4 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)

（1）耐膽鹽革蘭陰性菌（定量試驗(yàn)）檢查方法適用性試驗(yàn)。取1.5.2 項(xiàng)下1 ∶10 的供試液在20 ～25 ℃培養(yǎng)約2 h 后，取1 ∶10 供試液進(jìn)行10 倍系列稀釋，稀釋成1 ∶100 和1 ∶1 000，取該3 個(gè)稀釋級(jí)樣品勻液1 mL，分別接種至10 mL 腸道菌增菌液中，并加入小于100 CFU 的銅綠假單胞菌菌液及大腸埃希菌菌液，作為試驗(yàn)組。依次做陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組，各組置于35 ℃ 培養(yǎng)48 h，再取培養(yǎng)物劃線于XLD 平板上，35 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，進(jìn)行鑒定實(shí)驗(yàn)。

（2）大腸埃希菌檢查方法適用性試驗(yàn)。取10 mL 1.5.2 項(xiàng)下制備的1 ∶10 的供試液于100 mL TSB 中，并加入小于100 CFU 的大腸埃希菌菌液，充分混勻，作為試驗(yàn)組，同時(shí)做陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照組。上述各組按《中國(guó)藥典（2020 年版）》四部通則1108 中控制菌檢查項(xiàng)下大腸埃希菌的檢查法進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)及鑒定。

（3）沙門菌檢查方法適用性試驗(yàn)。取干姜飲片10 g，用無(wú)菌剪刀將其剪碎，加入至100 mL TSB 中，并加入小于100 CFU 的乙型副傷寒沙門菌，充分混勻，作為試驗(yàn)組，同時(shí)做陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照組。上述各組按《中華人民共和國(guó)藥典（2020 年版）》四部通則1108 中控制菌檢查項(xiàng)下沙門菌的檢查法進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)及鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 需氧菌總數(shù)、耐熱菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法（1 ∶10）適用性試驗(yàn)結(jié)果見表2，耐熱菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法（1 ∶10）適用性試驗(yàn)結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，若采用1 ∶10 傾注平皿法測(cè)定需氧菌總數(shù)，銅綠假單胞菌及枯草芽孢桿菌的回收率不能達(dá)到《中華人民共和國(guó)藥典（2020 年版）》四部0.5 ～2.0 的要求；采用1 ∶10 傾注平皿法進(jìn)行耐熱菌總數(shù)的測(cè)定時(shí)，銅綠假單胞菌的回收率不能達(dá)到要求，故將供試液分別稀釋至1 ∶50 和1 ∶100 再次進(jìn)行該項(xiàng)目的方法適用性試驗(yàn)，結(jié)果見表4 及表5。結(jié)果顯示，采用1 ∶50 及1 ∶100 傾注平皿法時(shí)，各菌種回收率均能達(dá)到0.5～2.0的要求，故可采用1∶50傾注平皿法進(jìn)行需氧菌總數(shù)及耐熱菌總數(shù)的計(jì)數(shù)。

表2 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法（1 ∶10）適用性試驗(yàn)結(jié)果表

表3 耐熱菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法（1 ∶10）適用性試驗(yàn)結(jié)果表

表4 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法（1 ∶50/1 ∶100）適用性試驗(yàn)結(jié)果表

表5 耐熱菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法（1 ∶50/1 ∶100）適用性試驗(yàn)結(jié)果表

2.1.2 霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法（1 ∶10）適用性試驗(yàn)結(jié)果見表6。結(jié)果顯示，霉菌和酵母菌總數(shù)的測(cè)定采用1 ∶10 傾注平皿法測(cè)定時(shí)，各試驗(yàn)菌的回收率（比值）均在0.5 ～2.0，此方法可行。

表6 霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法（1 ∶10）適用性試驗(yàn)結(jié)果表

2.2 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 耐膽鹽革蘭陰性菌（定量試驗(yàn)）檢查方法適用性試驗(yàn)

耐膽鹽革蘭陰性菌（定量試驗(yàn)）檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果見表7。由表7 可知，采用10 mL 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，銅綠假單胞菌試驗(yàn)組未檢出，故此方法不可行。采用增加腸道菌增菌液體培養(yǎng)基的方法再次進(jìn)行試驗(yàn)，將該培養(yǎng)基體積增至15 mL，陰性對(duì)照組未檢出試驗(yàn)菌，而試驗(yàn)組及陽(yáng)性對(duì)照組均可檢出，表明此方法可行。

表7 耐膽鹽革蘭陰性菌（定量試驗(yàn)）檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果表

2.2.2 大腸埃希菌、沙門菌檢查方法適用性試驗(yàn)

大腸埃希菌、沙門菌檢查方法的適用性試驗(yàn)結(jié)果見表8。由表8 可知，采用100 mL TSB 培養(yǎng)基進(jìn)行增菌培養(yǎng)適用于大腸埃希菌的檢查，但沙門菌的檢查采用同體積TSB 時(shí)試驗(yàn)組無(wú)法檢出沙門菌，故該法不適用于干姜飲片沙門菌的檢查。因而采用增加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的方法重新進(jìn)行試驗(yàn)。將10 g 干姜飲片用無(wú)菌剪刀將其剪碎，加入200 mL TSB 中進(jìn)行沙門菌檢查方法適用性試驗(yàn)。結(jié)果陰性對(duì)照組未檢出沙門菌，而試驗(yàn)組及陽(yáng)性對(duì)照組均可檢出此菌，表明使用200 mL TSB 培養(yǎng)基進(jìn)行增菌培養(yǎng)適用于干姜飲片沙門菌的檢查。

表8 大腸埃希菌、沙門菌檢查方法的適用性試驗(yàn)結(jié)果表

綜上所述，采用1 ∶10 平皿法進(jìn)行需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)時(shí)，枯草芽孢桿菌的回收率以及銅綠假單胞菌的回收率不能達(dá)到要求，需稀釋至1 ∶50 才能滿足回收率0.5 ～2.0 的要求。采用1 ∶10 平皿法進(jìn)行耐熱菌總數(shù)計(jì)數(shù)時(shí)，銅綠假單胞菌的回收率不能達(dá)到要求，需稀釋至1 ∶50 才能滿足要求。耐膽鹽革蘭陰性菌檢查使用10 mL 腸道增菌液時(shí)，銅綠假單胞菌試驗(yàn)組無(wú)法檢出，需使用15 mL 腸道增菌液進(jìn)行增菌培養(yǎng)。沙門菌檢查使用100 mL TSB 時(shí)試驗(yàn)組無(wú)法檢出沙門菌，需增加該培養(yǎng)基至200 mL。因此，確定干姜飲片的微生物限度檢查方法如下。①需氧菌總數(shù)及耐熱菌總數(shù)計(jì)數(shù)采用1 ∶50 傾注平皿法。②采用1 ∶10 傾注平皿法進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)的測(cè)定。③耐膽鹽革蘭陰性菌分別取相當(dāng)于0.1 g、0.01 g 和0.001 g 供試品的預(yù)培養(yǎng)物接種至15 mL 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中進(jìn)行檢查。④大腸埃希菌檢查取相當(dāng)于1 g 供試品的供試液加入至100 mL TSB 中進(jìn)行增菌培養(yǎng)。⑤沙門菌檢查將10 g 樣品加至200 mL TSB 中進(jìn)行增菌培養(yǎng)。

2.3 干姜飲片的抑菌性分析

從本研究試驗(yàn)結(jié)果可知，干姜飲片對(duì)銅綠假單胞菌及枯草芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抑菌性，且對(duì)金黃色葡萄球菌也有一定的抑制作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，新鮮生姜和干姜的精油對(duì)銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌等均有抑菌效果[[4-5]]，EL-BAROTY 等[6]發(fā)現(xiàn)，姜精油對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有良好的抑制作用。另有文獻(xiàn)報(bào)道，姜產(chǎn)品對(duì)上述3 種菌均有抑制作用[7]，這些研究結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有相通之處，或可用于解釋干姜飲片對(duì)上述菌株的抑菌作用。干姜的抑菌作用可能源于其精油或姜辣素等成分的抑菌效果[8-9]。干姜對(duì)沙門菌的抑制作用[10]，在本研究中也得到了驗(yàn)證。有研究表明，姜皮精油對(duì)大腸埃希菌具有抑制作用[11]，本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)干姜對(duì)大腸埃希菌有抑菌作用，考慮是按藥典的規(guī)定，檢測(cè)大腸埃希菌時(shí)加入的樣品量為1 g，該樣品量不足以對(duì)大腸埃希菌產(chǎn)生抑菌性。本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)干姜對(duì)白色念珠菌及黑曲霉有抑制作用。

3 結(jié)論

干姜飲片藥食兩用，應(yīng)用廣泛。藥理學(xué)研究表明，干姜及其單體化學(xué)成分具有抗炎抑菌、抗氧化、抗癌、保護(hù)肝臟、心血管等作用[3]。本研究探究出了適合干姜飲片的微生物限度檢查方法，并在此基礎(chǔ)上分析了干姜飲片對(duì)不同菌株的抑制作用，這有益于干姜飲片的質(zhì)量控制，同時(shí)可為含干姜飲片的中成藥如透骨鎮(zhèn)風(fēng)丸、定坤丹等的微生物限度檢查提供一定的參考。