鐵死亡在腫瘤免疫微環(huán)境中的研究進(jìn)展

徐 喆，張 芳，姜 俊(空軍軍醫(yī)大學(xué)：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員一大隊(duì)，西京醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，空軍衛(wèi)勤訓(xùn)練基地衛(wèi)生勤務(wù)教研室，陜西 西安 700)

鐵死亡是鐵依賴性的，由脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物累積引起的一種新型的非經(jīng)典程序性細(xì)胞死亡形式，不同于傳統(tǒng)的細(xì)胞凋亡、壞死和自噬死亡形式[1-2]。鐵死亡的主要發(fā)生機(jī)制包括鐵累積、谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)活性降低、活性氧自由基及脂質(zhì)過氧化物增多[3]。細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化防御鐵死亡機(jī)制主要包括GPX4-谷胱甘肽(glutathione，GSH)[4]、FSP1-CoQH2[5-6]及二氫乳清酸脫氫酶(dihydroorotate dehydrogenase，DHODH)[7]信號通路。特異性抑制鐵死亡防御機(jī)制、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡已經(jīng)成為癌癥治療的一個(gè)全新的靶向策略[8]。目前有多種臨床常規(guī)藥物能夠通過靶向鐵死亡關(guān)鍵信號通路，如抑制Xc-或GPX4功能來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞鐵死亡，例如肝癌靶向藥索拉非尼[9]、炎癥性腸病抗炎藥柳氮磺嘧啶[10-11]。其他小分子抑制劑實(shí)驗(yàn)藥物，如cyst(e)inase酶[12]、RAS選擇性致死分子3(RAS-selective lethal 3，RSL3)[4]、Brequinar[7]可分別靶向胱氨酸或半胱氨酸、GPX4、DHODH鐵死亡防御系統(tǒng)，促進(jìn)鐵死亡。

近年來，以免疫檢查點(diǎn)抑制劑及免疫細(xì)胞過繼療法為主的腫瘤免疫治療顯著提高了腫瘤患者的生存率。然而，只有小部分腫瘤患者對免疫療法有應(yīng)答，研究認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞的低免疫原性以及免疫抑制微環(huán)境的存在限制了免疫療法的抗腫瘤效應(yīng)[13]。腫瘤微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜而動(dòng)態(tài)的景觀，主要由腫瘤細(xì)胞與浸潤免疫細(xì)胞構(gòu)成。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages，TAM)、骨髓源性抑制細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T(regulatory T，Treg)細(xì)胞增多和細(xì)胞毒性T細(xì)胞減少能夠造成腫瘤細(xì)胞對免疫治療耐受或無應(yīng)答。而鐵死亡作為腫瘤細(xì)胞死亡的一種重要方式，與腫瘤浸潤免疫細(xì)胞存在多種聯(lián)系。因此，本文主要闡述鐵死亡在腫瘤免疫微環(huán)境中的作用，為鐵死亡療法在腫瘤免疫治療中的聯(lián)合應(yīng)用提供可行性理論基礎(chǔ)。

1 鐵死亡在腫瘤免疫微環(huán)境中發(fā)揮雙重作用

癌細(xì)胞中不穩(wěn)定鐵增加、脂質(zhì)過氧化、活性氧異常堆積及氧化還原系統(tǒng)失衡等都可能加速鐵死亡進(jìn)程。鐵死亡產(chǎn)生的代謝物與腫瘤免疫微環(huán)境中的各種免疫細(xì)胞與免疫分子存在多種相互作用，在腫瘤免疫中具有雙重作用。

損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)是內(nèi)源性細(xì)胞分子，在正常情況下參與不同的生理過程[14]。一旦腫瘤細(xì)胞受損或發(fā)生死亡，DAMP被釋放并獲得免疫原性，能夠與模式識別受體結(jié)合，如Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)和嘌呤受體P2X7，促進(jìn)炎癥和先天免疫系統(tǒng)的激活[2]。DAMP起源于細(xì)胞膜和線粒體，是細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)物。最常見的DAMP有三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)和鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CRT)，它們在免疫原性細(xì)胞死亡(immunogenic cell death，ICD)中作為佐劑發(fā)揮著重要作用。這些分子分別與P2X7受體、TLR4或低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1結(jié)合，通過激活免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)抗腫瘤免疫效應(yīng)[15]。

除了能夠刺激腫瘤免疫外，有些DAMP分子卻能發(fā)揮促腫瘤作用。如胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，釋放KrasG12D到外泌體內(nèi)，可被巨噬細(xì)胞攝取，促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化與激活，促進(jìn)腫瘤生長[16]。

2 CD8+ T細(xì)胞與鐵死亡

2.1 CD8+ T細(xì)胞促進(jìn)腫瘤細(xì)胞鐵死亡

Xc-是一種胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要功能為將胱氨酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)輸出谷氨酸，參與GSH的生物合成，進(jìn)而影響鐵死亡。研究表明，免疫療法激活的CD8+T細(xì)胞通過分泌γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)，可下調(diào)腫瘤細(xì)胞膜上Xc-的亞單位SLC7A11和SLC3A2的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡、釋放DAMP[17-18](圖1)；DAMP進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞浸潤，可提高免疫療法的抗腫瘤療效。對比使用PD-1抑制劑納武利尤單抗的患者治療前和治療期間的轉(zhuǎn)錄組，分析顯示SLC3A2的表達(dá)降低和IFN-γ、CD8的表達(dá)上調(diào)與臨床患者療效改善相關(guān)，這強(qiáng)調(diào)了CD8+T細(xì)胞具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞鐵死亡作用，提示靶向Xc-/GSH/GPX4通路與抗PD-1/PD-L1抗體結(jié)合可能是一種有效的腫瘤免疫聯(lián)合治療策略。

Glu：谷氨酸；Cys：半胱氨酸；GSH：谷胱甘肽；LPO：脂質(zhì)過氧化物；HMGB1：高遷移率族蛋白1；IFN-γ：γ-干擾素；OxLDL：氧化低密度脂蛋白。圖1 CD8+T細(xì)胞與鐵死亡的聯(lián)系

T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞鐵死亡有助于抗PD-1/PD-L1抗體抑制腫瘤。有研究報(bào)道腫瘤細(xì)胞鐵死亡受抑制也是PD-1/PD-L1抑制劑耐藥的機(jī)制之一[19]。MIEN-CHIE HUNG團(tuán)隊(duì)研究在4T1乳腺癌小鼠模型中，TYRO3高表達(dá)上調(diào)SLC7A11、SLC3A2及GPX4，從而抑制乳腺癌細(xì)胞鐵死亡，造成腫瘤對PD-1抑制劑耐藥[19]。TCGA乳腺癌隊(duì)列研究也驗(yàn)證了鐵死亡相關(guān)SLC3A2蛋白與TYRO3表達(dá)呈正相關(guān)，TYRO3高表達(dá)與乳腺癌患者PD-1抑制劑耐藥有關(guān)。

近日，鄒偉平研究團(tuán)隊(duì)揭示了CD8+T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的新機(jī)制，該研究提出花生四烯酸和CD8+T細(xì)胞分泌的IFN-γ可通過增強(qiáng)?；o酶A合成酶長鏈家族成員4(Acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4)的表達(dá)，來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞鐵死亡和提高抗腫瘤免疫效應(yīng)[20]。ACSL4基因敲除小鼠模型證實(shí)，相對于ACSL4野生型，ACSL4敲除組能降低腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞的浸潤，降低IFN-γ和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的表達(dá)，減少瘤內(nèi)脂質(zhì)過氧化物水平，腫瘤體積顯著增大。該研究不僅為CTL殺傷機(jī)制提供了新思路，也為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡、增強(qiáng)抗腫瘤免疫效應(yīng)提供了新的聯(lián)合策略。

2.2 鐵死亡促進(jìn)CD8+ T細(xì)胞耗竭

鐵死亡不僅出現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中，免疫抑制腫瘤微環(huán)境中的浸潤T細(xì)胞也可能發(fā)生鐵死亡。CD8+T細(xì)胞耗竭與脂質(zhì)攝取增加、胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化堆積有關(guān)[21-22]。近期，崔國梁研究團(tuán)隊(duì)揭示了一種新的腫瘤免疫抑制機(jī)制[23]。腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生大量的氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，OxLDL)，被高表達(dá)CD36(脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)分子)的CD8+耗竭T細(xì)胞攝取，胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化上調(diào)觸發(fā)應(yīng)激反應(yīng)蛋白p38的激活及T細(xì)胞鐵死亡，進(jìn)而導(dǎo)致IFN-γ、TNF-α的表達(dá)下降，引起CD8+T細(xì)胞功能失調(diào)及抗腫瘤效應(yīng)下降。并且該研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)CD36表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)PD-1、TIM-3表達(dá)呈正相關(guān)，而過表達(dá)GPX4則能夠抑制OxLDL引起的脂質(zhì)過氧化，拯救T細(xì)胞免于鐵死亡，挽救其抗腫瘤功能。

3 Treg細(xì)胞與鐵死亡

Treg細(xì)胞是維持腫瘤細(xì)胞免疫耐受和逃逸的關(guān)鍵抑制性細(xì)胞。有研究報(bào)道，GPX4在抗腫瘤免疫中能防止Treg細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化和鐵死亡，從而維持其免疫抑制功能[24]。在T細(xì)胞受體/CD28共同刺激下，敲除GPX4能夠引起Treg細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物增多，引起Treg細(xì)胞發(fā)生鐵死亡；而中和脂質(zhì)過氧化物可挽救GPX4敲除的Treg細(xì)胞介導(dǎo)的鐵死亡。另外，Treg細(xì)胞敲除GPX4增強(qiáng)白細(xì)胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)的分泌，促進(jìn)Th17細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，并可激活樹突狀細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞功能。在MC38結(jié)腸癌及B16F10黑色素瘤動(dòng)物模型中證實(shí)了特異性敲除Treg的GPX4表達(dá)會抑制腫瘤的生長。以上結(jié)果提示GPX4能維持Treg細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，可免其受脂質(zhì)過氧化、鐵死亡的影響，從而維持其免疫抑制功能，揭示了誘導(dǎo)Treg細(xì)胞鐵死亡可成為改善癌癥治療的有效策略。

4 TAM與鐵死亡

TAM是腫瘤微環(huán)境中的主要免疫細(xì)胞，其浸潤程度與患者預(yù)后不良有關(guān)[25]。在大多數(shù)腫瘤中，表達(dá)Arg-1、CD206為特征的M2型抗炎促腫瘤TAM主要通過產(chǎn)生IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子β，促進(jìn)血管生成、基質(zhì)重塑和免疫抑制來維持腫瘤細(xì)胞生長；而表達(dá)CD86、iNOS的M1型促炎抗腫瘤TAM主要通過IL-1α/β、IL-6、TNF-α及活性氧來限制腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展[26]。

4.1 M1、M2型巨噬細(xì)胞對鐵死亡敏感性不同

有研究表明，巨噬細(xì)胞對鐵死亡誘導(dǎo)劑表現(xiàn)出不同的敏感性[27]。高表達(dá)iNOS的促炎M1型巨噬細(xì)胞對鐵死亡耐受；然而M2型巨噬細(xì)胞對鐵死亡相對敏感。NO能夠抑制M1型巨噬細(xì)胞中15-脂氧化酶催化的多不飽和脂肪酸過氧化作用，從而阻止M1型巨噬細(xì)胞發(fā)生鐵死亡(圖2)。因此，鐵死亡誘導(dǎo)劑(GXP4抑制劑RSL3)不能誘導(dǎo)高表達(dá)iNOS的M1型巨噬細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，卻能夠殺死促腫瘤的M2型巨噬細(xì)胞，從而消除其免疫抑制作用，發(fā)揮抗腫瘤協(xié)同效應(yīng)。

DC：樹突狀細(xì)胞；iNOS：誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；PD-1：程序性死亡受體1；LPO：脂質(zhì)過氧化物；Glu：谷氨酸；Cys：半胱氨酸；GSH：谷胱甘肽；HMGB1：高遷移率族蛋白1。圖2 鐵死亡調(diào)節(jié)骨髓系免疫細(xì)胞的分化與成熟

4.2 腫瘤細(xì)胞鐵死亡促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化

腫瘤細(xì)胞鐵死亡除了能夠釋放經(jīng)典的ATP、HMGB1和CRT等DAMP，還能釋放其他DAMP分子，如KrasG12D和8-羥基鳥苷。這些分子可影響腫瘤微環(huán)境中固有免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)的功能。例如，自噬依賴的鐵死亡能夠通過AGER/RAGE途徑和STAT3依賴的脂肪酸氧化作用來調(diào)節(jié)TAM的極化與激活。胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞釋放KrasG12D，被巨噬細(xì)胞吸收并使其本身向促腫瘤的M2型巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化[16]。

此外，有研究報(bào)道高鐵飲食或GPX4消耗，均可促進(jìn)8-羥基鳥苷(DNA損傷的主要產(chǎn)物)的釋放，從而激活TMEM173/STING信號通路，引起TAM遷移和活化，促進(jìn)Kras驅(qū)動(dòng)的胰腺導(dǎo)管癌的發(fā)生[28]。高鐵飲食或GPX4消耗可引起胰腺腺泡上皮細(xì)胞化生及上皮內(nèi)瘤變。TAM在Kras驅(qū)動(dòng)的小鼠中隨著GPX4消耗或高鐵飲食而增加；氯磷酸鹽脂質(zhì)體消耗TAM后，小鼠胰腺癌變及死亡率相對減輕，以上結(jié)果提示鐵死亡相關(guān)分子是胰腺腫瘤微環(huán)境中TAM浸潤和活化的重要調(diào)節(jié)因子。

5 骨髓源性抑制細(xì)胞與鐵死亡

骨髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)是腫瘤微環(huán)境中抑制T細(xì)胞功能的主要免疫抑制細(xì)胞類型之一[29]。而關(guān)于MDSC的鐵死亡機(jī)制研究報(bào)道較少。LIU KEBIN課題組發(fā)現(xiàn)N-?；拾贝减０访?N-acylsphingosine amidohydrolase，ASAH2)在結(jié)腸癌的MDSC中高表達(dá)。ASAH2在腫瘤微環(huán)境中通過降低p53穩(wěn)定性，上調(diào)Hmox1的表達(dá)，抑制脂質(zhì)活性氧的產(chǎn)生，從而減少M(fèi)DSC鐵死亡[30]。NC06作為ASAH2抑制劑，抑制神經(jīng)酰胺酶的活性，可以誘導(dǎo)MDSC鐵死亡。動(dòng)物模型證實(shí)了NC06通過促進(jìn)MDSC鐵死亡抑制MDSC在移植瘤內(nèi)的浸潤，抑制腫瘤生長。因而，用NC06靶向ASAH2誘導(dǎo)MDSC鐵死亡，有可能是免疫治療抑制瘤內(nèi)MDSC浸潤的有效途徑。

6 樹突狀細(xì)胞與鐵死亡

早期腫瘤細(xì)胞鐵死亡能夠促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟與激活，提升其抗原提呈作用，進(jìn)而刺激效應(yīng)T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[31]。EFIMOVA等[32]在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)了GPX4抑制劑RSL3引發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生ICD來激活樹突狀細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的新機(jī)制。該作者首先證實(shí)RSL3通過鐵死亡，而不是凋亡和壞死，誘導(dǎo)小鼠纖維肉瘤MCA205細(xì)胞死亡，并比較RSL3處理MCA205細(xì)胞1 h(早期腫瘤細(xì)胞鐵死亡)和24 h(晚期腫瘤細(xì)胞鐵死亡)對小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞(bone-marrow derived dendritic cell，BMDC)成熟的影響。結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞早期鐵死亡能夠誘導(dǎo)BMDC的成熟，而晚期的鐵死亡腫瘤細(xì)胞被BMDC介導(dǎo)的吞噬作用所消除。隨后，在免疫功能正常的C57BL/6J小鼠上皮下接種早期或晚期鐵死亡MCA205細(xì)胞，在第7日注射正常MCA205細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)早期注射過的鐵死亡癌細(xì)胞能夠減弱正常MCA205細(xì)胞的增殖，提示早期鐵死亡癌細(xì)胞能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)。用oxiATP對ATP受體(P2X7)進(jìn)行藥物阻斷，可以逆轉(zhuǎn)早期鐵死亡癌細(xì)胞接種的抗腫瘤保護(hù)作用，提示ATP是早期鐵死亡癌細(xì)胞引起的ICD所必需的。

7 鐵死亡與免疫治療

腫瘤細(xì)胞鐵死亡能夠加強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中抗腫瘤反應(yīng)，因此誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡與免疫療法聯(lián)合的治療策略在癌癥治療中具有良好的應(yīng)用前景。既往研究發(fā)現(xiàn)，在單獨(dú)使用PD-L1阻斷劑或Cyst(e)inase酶的小鼠中，腫瘤細(xì)胞生長相對降低，但在聯(lián)合使用PD-L1阻斷劑或Cyst(e)inase酶的小鼠中，腫瘤生長受到強(qiáng)烈抑制[17]。聯(lián)合治療顯著增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化作用，提高了IFN-γ、TNF-α、CD8+T及CD4+T細(xì)胞的比例，增加了免疫細(xì)胞的抗腫瘤作用。然而近期有學(xué)者報(bào)道，在黑色素瘤PD-1抑制劑治療過程中，雖然腫瘤細(xì)胞的Xc-功能受抑制，卻能通過分泌含有高水平的PD-1外泌體，刺激M2型巨噬細(xì)胞極化，從而對PD-1抑制劑產(chǎn)生抵抗耐藥特性[33]。因此，抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)高水平的PD-1外泌體的產(chǎn)生，是解決該耐藥問題的關(guān)鍵。

通過納米遞藥系統(tǒng)將鐵死亡誘導(dǎo)劑及外泌體抑制劑導(dǎo)入腫瘤微環(huán)境中，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡并且恢復(fù)T細(xì)胞功能，成為增強(qiáng)腫瘤免疫療法的新型治療策略。代云路課題組通過構(gòu)建GW4869外泌體抑制劑和Fe3+鐵死亡誘導(dǎo)劑偶聯(lián)的HGF納米單元，抑制B16F10黑色素瘤細(xì)胞分泌外泌體，能夠間接抑制PD-L1的表達(dá)，恢復(fù)CD8+T的功能，促進(jìn)IFN-γ的分泌；IFN-γ則能夠降低腫瘤細(xì)胞膜表面SLC7A11和SLC3A2的表達(dá)，破壞腫瘤細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡[34]。

8 結(jié)束語

腫瘤細(xì)胞鐵死亡可引起胞內(nèi)DAMP的釋放，在抗腫瘤免疫中具有雙重作用。一方面DAMP誘發(fā)ICD，增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞抗腫瘤功能，同時(shí)CD8+T細(xì)胞反過來又可以通過分泌IFN-γ來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生；另一方面，腫瘤細(xì)胞釋放特殊的DAMP，以及分泌含有高水平PD-1的外泌體，刺激TAM向M2型抗炎促腫瘤表型轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生與進(jìn)展。除了腫瘤細(xì)胞能夠發(fā)生鐵死亡影響免疫應(yīng)答，微環(huán)境中的免疫細(xì)胞也可能發(fā)生鐵死亡，是免疫治療耐藥抵抗的機(jī)制之一。例如，耗竭T細(xì)胞高表達(dá)CD36可促進(jìn)胞內(nèi)氧化脂質(zhì)體增多，引起T細(xì)胞鐵死亡，產(chǎn)生免疫治療抵抗；另外，不同分型巨噬細(xì)胞由于能量代謝不同，對鐵死亡耐受性不同，例如M1型巨噬細(xì)胞由于高表達(dá)iNOS而免于鐵死亡。因而通過對巨噬細(xì)胞能量代謝進(jìn)行重編組，可促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞發(fā)生鐵死亡或促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞極化與激活，從而提高腫瘤免疫治療的療效。

綜上所述，鐵死亡與腫瘤微環(huán)境錯(cuò)綜復(fù)雜的聯(lián)系影響到免疫治療的療效。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞、免疫抑制細(xì)胞(M2型巨噬細(xì)胞、Treg細(xì)胞及MDSC)發(fā)生鐵死亡，以及減少CD8+T細(xì)胞鐵死亡是有效的治療策略，可減少免疫檢查點(diǎn)抑制劑耐藥的發(fā)生。同時(shí)，免疫療法聯(lián)合針對鐵死亡信號的藥物可以協(xié)同增強(qiáng)免疫治療的效果，并有望通過納米遞藥系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)高效低毒的抗腫瘤效應(yīng)。