中藥五倍子對牙體硬組織及樹脂材料表面變異鏈球菌的抑菌作用研究

李 娜，吳昊澤，范曉敏，仇 珺，梅笑寒，余 擎，程小剛(口頜系統(tǒng)重建與再生全國重點實驗室，國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，陜西省口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，空軍軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院牙體牙髓病科，陜西 西安 710032)

齲病是在口腔環(huán)境多種因素影響下，牙齒硬組織所發(fā)生的一種慢性進行性病損，是人類的常見病和多發(fā)病。隨著飲食的日臻精致，其發(fā)病率也不斷上升。變異鏈球菌、口鏈球菌、粘性放線菌等是引起齲病發(fā)生的主要病原菌，其中變異鏈球菌與齲病的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯系[1]。變異鏈球菌是齲病的首要致齲菌之一，它致齲需要依賴于形成菌斑生物膜這種特殊的結構。

許多中草藥都具有一定的抗菌性能，如五倍子、黃芪、艾葉、陳皮、蒲公英等，其毒副作用甚微[2]。五倍子為蛋倍蚜等倍蚜科昆蟲寄生在青麩或紅麩楊等漆樹科植物上形成的蟲癭，別名文蛤、百蟲倉、木附子等，因其所形成蟲癭的蚜蟲頭部觸角為五節(jié)，便形象地稱之為五倍子[3]。其用藥已有約1 400年的歷史，具有廣泛的藥理特性，如防齲、抗菌、抗病毒、抗氧化等作用[4]。五倍子的有效抗菌成分主要是一類水解性的植物單寧——五倍子單寧[5]。它是一種復雜化合物，對大腸桿菌等細菌有著顯著的抗菌作用，其機制可能與單寧酸對蛋白有凝固作用有關，從而影響細菌的生長代謝[6]。

以往，在口腔領域應用較多的抗菌防齲藥物有氯已定、氟化鈉等。氯已定又名洗必泰，是一種有機化合物，其作為陽離子型的廣譜殺菌劑，具有較強的抑菌、殺菌作用[7]，但長期使用會引起著色、味苦及口腔菌群紊亂等諸多不良反應，這些缺點在一定程度上限制了其臨床應用。五倍子作為中藥防齲藥物前期已有研究，實驗結果顯示其對相關口腔致病菌具有一定的抗菌作用[8-9]。本研究主要選取牙體硬組織磨片及臨床中常用的牙科材料，通過電鏡和激光共聚焦觀察五倍子對變異鏈球菌的作用及對菌斑生物膜形成的影響，從而對其在臨床防齲方面的功效進行研究，為其可能作為中藥防齲應用于臨床提供進一步的實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 材料

YJ-875型超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)；厭氧培養(yǎng)箱(YQX-Ⅱ型，上海博泰)；離子濺鍍系統(tǒng)(Ion Sputter E-1045，Hitachi，日本)；激光共聚焦顯微鏡(CLSM Fluo View 1000，奧林巴斯，日本)；干燥機(ES-2030，Hitachi，日本)；冷場發(fā)射電鏡(S-4800，Hitachi，日本)；超純水器(Milli-QUF Plus，Millipore，美國)；電子天平(Sartorius，德國)；24孔板(Corning，美國)；移液器(Eppendorf公司，美國)；變異鏈球菌UA159(空軍軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院實驗室提供)；洗必泰(Sigma公司，美國)；五倍子(空軍軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院藥劑科提供)；納米樹脂(Z350，3M ESPE，美國)；氯已定(Sigma公司，美國)；LIVE/DEAD?BacLightTM染色劑(Invitrogen Inc，美國)；腦心浸液瓊脂(brain heart infusion agar，BHI)培養(yǎng)基(Difco公司，美國)；瓊脂粉(Sigma公司，美國)；無水乙醇(Sigma公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 變異鏈球菌的培養(yǎng) 菌種的復蘇：將在-80 ℃凍存的變異鏈球菌菌種解凍后，接種于備好的BHI培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫厭氧箱中(850 mL/L N2，100 mL/L H2，50 mL/L CO2)培養(yǎng)24 h待用。

菌懸液的制備：將培養(yǎng)基上的單克隆菌株挑取后放入含有5 mL BHI培養(yǎng)液的試管內，繼續(xù)于37 ℃恒溫厭氧箱中培養(yǎng)24 h后待用。

1.2.2 牙體硬組織及樹脂材料試件的制作 牙體硬組織的制作是采用慢速切割機將離體牙制成厚度約1 mm的牙釉質磨片和牙本質磨片，高溫高壓消毒后備用；牙本質與樹脂相交界面的制作方法為在離體牙的合面用快速手機磨出直徑約5 mm且厚度約3 mm的Ⅰ類洞型，消毒干燥后涂布粘接劑光照，隨后用光固化納米樹脂進行分層充填固化，再用慢速切割機切成厚度約2 mm的試件，高溫高壓消毒后備用；樹脂材料試件的制作是將光固化納米樹脂用載玻片壓制為厚度約1 mm的圓形薄片后光照固化40 s，放置在含950 mL/L乙醇溶液中浸泡消毒，并在紫外線燈照射30 min后備用。

1.2.3 牙體硬組織及與樹脂材料界面上變異鏈球菌的培養(yǎng) 將牙釉質磨片、牙本質磨片及牙本質與樹脂相交界面的試件分別用無菌鑷子夾入24孔板中，實驗分為4組，根據李娜等[10]前期的實驗研究，五倍子組濃度設定為8 g/L(8 g/L五倍子組)和16 g/L(16 g/L五倍子組)，另兩組為空白對照組和2 mL/L洗必泰的陽性對照組(2 mL/L洗必泰組)，磨片和試件每組均為9個。將培養(yǎng)好的變異鏈球菌濃度調至105CFU/mL后，分別在各孔中加入200 μL菌液后靜置30 min，各組再分別加入1 mL BHI培養(yǎng)液、含五倍子終末濃度為8 g/L的BHI培養(yǎng)液、含五倍子終末濃度為16 g/L的BHI培養(yǎng)液及2 mL/L洗必泰的BHI培養(yǎng)液，隨后放置于37 ℃的恒溫厭氧箱中培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)結束取出后吸出培養(yǎng)液，用三蒸水進行輕柔洗滌，將配置好的25 mL/L戊二醛加入各孔中固定24 h，采用不同濃度的乙醇溶液進行梯度脫水，干燥噴金后使用掃描電鏡觀察各組變異鏈球菌的形態(tài)及生物膜的形成。

1.2.4 樹脂材料表面上變異鏈球菌的培養(yǎng) 將樹脂試件磨片用無菌鑷子夾入24孔板中，將培養(yǎng)好的變異鏈球菌濃度調至108CFU/L后，分別在各孔中加入200 μL菌液，靜置30 min后放入厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)結束取出后吸出培養(yǎng)液，用三蒸水進行輕柔洗滌，然后在各孔中分別加入1 mL BHI液、8 g/L五倍子液、16 g/L五倍子液及2 mL/L洗必泰，讓各組與生物膜作用10 min，輕柔洗滌后各孔中分別加入200 μL新鮮配制的LIVE/DEAD染色劑，染色20 min后再用三蒸水輕柔洗滌3次，通過激光共聚焦顯微鏡觀察各組死菌和活菌染色情況并計算活菌百分比。

2 結果

2.1 牙體硬組織表面的電鏡觀察

通過掃描電鏡觀察牙釉質和牙本質表面，空白對照組變異鏈球菌形成了串珠樣結構且有菌斑生物膜的形成，五倍子組未形成較致密的菌斑生物膜，且變異鏈球菌形態(tài)有一定的改變，形態(tài)學觀察不同濃度(8，16 g/L)五倍子組間無明顯區(qū)別，2 mL/L洗必泰組未形成菌斑生物膜并可見部分細菌破碎；各實驗組在牙釉質與牙本質表面細菌形態(tài)表現相類似(圖1)。

圖1 牙釉質及牙本質上各組形成變異鏈球菌生物膜形態(tài)(掃描電鏡觀察，×5 000)

2.2 牙本質與樹脂界面的電鏡觀察

圖2所示上方均為樹脂材料，下方為牙本質，在牙本質與樹脂相交界面處，空白對照組形成了致密的菌斑生物膜，尤其在界面處較為聚集，兩組五倍子組界面處未形成菌斑生物膜，可見散在的細菌存在，2 mL/L洗必泰組界面處亦無生物膜的形成，僅有少量破碎細菌散在。

A：空白對照組；B：8 g/L五倍子組；C：16 g/L五倍子組；D：2 mL/L洗必泰組。掃描電鏡觀察(×1 000)。圖2 牙本質與樹脂材料相交界面處各組形成變異鏈球菌生物膜的形態(tài)

2.3 樹脂表面的激光共聚焦觀察

樹脂材料表面細菌生物膜經各實驗組處理后，空白對照組中視野內大多為綠色熒光，活菌百分比最高；8 g/L五倍子組紅色熒光增多，相比空白對照組死菌的數量增多，活菌百分比降低；16 g/L五倍子組綠色熒光較8 g/L五倍子組減少，視野內大多紅色熒光，活菌百分比較低；2 mL/L洗必泰的陽性對照組幾乎全為紅色熒光，僅有少量活菌(圖3)。用ImageJ軟件進行熒光強度分析后計算出各實驗組的活菌百分比，空白對照組(78.33±13.71)%，8 g/L五倍子組(45.89±12.84)%，16 g/L五倍子組(20.33±6.34)%，2 mL/L洗必泰組(7.67±4.03)%，經統(tǒng)計軟件分析后每兩組比較，其活菌百分比均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

A：空白對照組；B：8 g/L五倍子組；C：16 g/L五倍子組；D：2 mL/L洗必泰組。激光共聚焦顯微鏡觀察(×600)。圖3 樹脂材料表面各組處理后死菌活菌染色菌斑生物膜

3 討論

中醫(yī)理論注重整體平衡，在抑制細菌的同時，不對機體形成較大的毒副作用，主張祛邪扶正，從而自主提高機體抵抗力。中藥歷史悠久，是我們中華民族的瑰寶，中藥防齲是基于中醫(yī)理論提出的[11]。我國中藥防齲方面的研究已有數十年，從資源較豐富的中草藥中對有防齲能力的藥物進行了大量的研究[12]。

齲齒形成的主要原因是口腔內多種細菌在牙齒表面附著并形成了菌斑生物膜，其中變異鏈球菌與齲病的發(fā)生發(fā)展密切相關[13]，對齲病的發(fā)生發(fā)展起著重要的作用，變異鏈球菌以食物為底物，可通過細菌分解產酸、黏附等作用，使牙菌斑內的pH值降低后局部脫礦，使牙體組織的結構破損后形成齲壞。因此，通過藥物作用抑制變異鏈球菌的生長繁殖、黏附和產酸等，發(fā)揮防齲的作用，從而降低齲病發(fā)生率，因此變異鏈球菌仍是人們對齲病研究的重點之一。

齲齒治療除了Carisolv凝膠結合手術顯微鏡的微創(chuàng)化學去腐方案外[14]，臨床上常規(guī)用樹脂進行充填，充填后牙面與充填物相交的界面處易有大量致齲菌，繼發(fā)齲的發(fā)生往往是由于充填物的邊緣與窩洞周圍的牙體組織相交處不密合或者微滲漏導致的，實驗中觀察充填后牙體與樹脂界面處的菌斑生物膜，不同濃度的五倍子和洗必泰均能有效減少界面處菌斑生物膜的形成，可能是五倍子的收斂作用有效減少了菌斑生物膜的形成。激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示材料表面經五倍子處理后，不僅破壞了菌斑生物膜的完整性，還可殺滅細菌，隨著五倍子濃度的增大其活菌百分比越低。隨著藥物作用時間的延長，五倍子是否對細菌會有持續(xù)的作用效果，這部分內容需進一步研究。

五倍子在口腔中的應用較廣，主要有防齲和促進再礦化兩方面的作用。研究顯示五倍子可作為牙本質再礦化的有效替代方法[15]，五倍子在動物模型中可促進牙釉質的齲損再礦化[16]；在防齲方面的研究顯示五倍子的粗提物和提純的一些主要成分有顯著的防齲功效[17]。本研究電鏡觀察到五倍子組的變異鏈球菌形態(tài)發(fā)生了改變，且細菌體積稍大，可能是細菌在生長繁殖過程中受到了五倍子有效成分的影響，使細菌的基因調控或表達發(fā)生了改變，進而影響了細菌形態(tài)，可能的機制是五倍子提取液能抑制變鏈菌生長，并降低葡糖基轉移酶的活性，從而減少了細菌的黏附，進而減少了黏附在早期菌斑生物膜表面細菌的數量[18-19]，但具體的作用機制仍有待進一步實驗研究。

綜上所述，天然藥物五倍子在我國盛產，其資源豐富且取材方便，已有廣泛的臨床應用基礎，在口腔領域的研究具有抗菌防齲等特點，有著較好的應用前景。