可注射濃縮生長因子凝膠在恒牙牙髓再生中應用的實驗研究

王明浩，郭 倩，張軼丹，朱小苗，蔣文凱，王勝朝，何文喜(口頜系統(tǒng)重建與再生全國重點實驗室，國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，陜西省口腔醫(yī)學重點實驗室，空軍軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，陜西 西安 7003；空軍特色醫(yī)學中心口腔科，北京 004)

牙體牙髓病是一類不可逆性牙體組織疾病，病變波及牙髓時可能引發(fā)牙髓炎癥，繼而導致感染壞死，給患者帶來極大的疼痛感，影響生活質(zhì)量。目前臨床治療中對于不可復性牙髓炎和根尖周炎仍以根管治療為主要手段，經(jīng)過機械性根管預備后，根管壁變薄，根折風險變大[1-2]，同時，由于治療過程中患牙牙髓被完全拔除，牙齒失去了牙髓的營養(yǎng)功能[3-4]，更加大了這一風險。

基于干細胞、支架材料和生長因子的牙髓再生是目前組織工程領(lǐng)域的研究熱點之一。在早期探索中，研究者通過血運重建的方法誘導牙髓再生[5-6]，但根管鈣化阻塞是導致其失敗的重要原因之一。近年來，許多研究嘗試通過牙髓干細胞直接移植誘導牙髓再生[7-12]，并在乳牙牙髓再生中取得了較好的效果[8，12]，但移植牙髓干細胞對恒牙牙髓再生的效果并不理想[7，9-11]。同時，盡管牙髓干細胞是較易獲得的干細胞來源，但在實際的臨床應用中仍存在體外培養(yǎng)及干細胞來源的倫理問題。因此，僅通過移植支架材料和生長因子誘導牙髓再生的細胞歸巢方法成為了新的研究熱點，并有研究證明細胞歸巢誘導牙髓再生具有可行性[13-14]。

濃縮生長因子(concentrated growth factors，CGF)是第三代自體血小板凝聚物，由外周血變速離心獲得，血液中的纖維成分和生長因子在離心后位于離心管的上清液層，富集的纖維成分成為牙髓再生的天然支架，其對生長因子的儲留可以起到緩釋生長因子的作用。本研究中所使用的CGF為可注射的液態(tài)凝膠，同時添加了離心后血細胞層與上清液層之間少量的CD34+細胞，具有促進組織再血管化的作用，而新生血管的長入更有利于組織再生[15-17]。

本研究通過采集比格犬自體外周靜脈血制備可注射CGF凝膠，將其應用于犬恒牙牙髓再生，既保留了CGF作為牙髓再生天然支架、緩釋生長因子的作用，又簡化了牙髓再生的操作。同時，CGF的應用與根尖引血聯(lián)合，探索在恒牙牙髓再生中新生組織礦化與牙髓樣組織再生之間的平衡。

1 材料與方法

1.1 材料

iRoot-BP Plus(IBIOCERAMIX，加拿大)；流動樹脂(3M，美國)；HE染色試劑盒(碧云天，中國)。根管預備機(啄木鳥，中國)；CGF離心機(Silfradent，意大利)；倒置顯微鏡(Leica，德國)。

13月齡雄性比格犬，前牙已萌出，牙根發(fā)育完全。實驗動物購自北京瑪斯生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2021-0002，動物使用許可證號為SYXK(陜)2020-004。實驗動物倫理已獲得空軍軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院倫理委員會批準[許可證號：2021倫審字(kq-007)號]。

1.2 方法

1.2.1 比格犬牙髓感染模型建立 比格犬術(shù)前禁食、水12 h，以速眠新(846合劑，60 μL/kg)與戊巴比妥鈉(30 g/L，0.5 mL/kg)復合肌肉注射麻醉，術(shù)前拍攝上下頜前牙X射線片(12顆前牙)。噴水條件下，使用高速渦輪機將比格犬前牙頰側(cè)面磨除部分牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)，可見透紅后停止，保持7 d建立牙髓感染模型。

1.2.2 可注射CGF凝膠制備 可注射CGF凝膠制備前啟動Medifuge離心機自消毒程序，進行紫外消毒。用負壓采血管取犬前肢靜脈血9 mL，配平后置于Medifuge離心機中，在CGF程序下通過一次變速離心(2 700、2 400、2 700、3 000 r/min)分離血液成分。用3 mL注射器抽取綠色采血管中紅黃交界處0.5 mL CD34+，用1 mL注射器抽取最上層2 mL貧血小板血漿(platelet-poor plasma，PPP)備用。取下三通中的較長端堵頭備用，將三通帽安裝在1 mL注射器上，置于已預熱好的恒溫儀中，在75 ℃條件下加熱10 min，降溫后將放涼的凝膠和0.5 mL CD34+導入5 mL注射器中，安裝另一個5 mL注射器進行混勻，約30次，最終得到可注射CGF凝膠。

1.2.3 比格犬牙髓再生治療 實驗分為4組，分別為空管組、根尖引血組、CGF組、根尖引血+CGF組。

比格犬上下頜前牙上橡皮障，消毒后在沖水條件下開髓，用拔髓針將比格犬牙髓完整拔除(圖1A)，25# K銼提拉根管壁(圖1B)，機用單支銼根管預備；超聲震蕩后用12.5 g/L次氯酸鈉5 mL和170 g/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)5 mL交替沖洗根管(圖1C)，20 mL生理鹽水再次沖洗根管后使用無菌紙捻吸干根管內(nèi)水分；25# K銼將根尖孔貫穿，并擴大至40# K銼，保持根尖組織與根管間開放。根據(jù)實驗分組進行根管充填(圖1D)，其中空管組僅根管預備，不做充填；根尖引血組使用無菌25# K銼刺激根尖出血至根管口下1～2 mm；CGF組將CGF凝膠注射至根管口下1～2 mm；根尖引血+CGF組根尖刺激出血至根管內(nèi)根方1/2處，然后將CGF凝膠注射至根管口下1～2 mm，所有組iRoot-BP Plus封閉根管(圖1E)，冠部充填流動樹脂并拋光(圖1F)，每周檢查牙冠封閉情況。

A：去髓；B：根管預備；C：沖洗；D：注射CGF凝膠；E：iRoot-BP Plus封閉根管口；F：流動樹脂充填。圖1 比格犬牙髓再生操作流程

1.2.4 術(shù)后取材 所有實驗牙均封閉完整，根尖對應黏膜無潰瘍、瘺管。3個月后，通過頸動脈對比格犬進行灌注，將上下頜骨完整取下，浸于40 g/L多聚甲醛中固定3 d后，使用170 g/L EDTA，37 ℃恒溫條件下脫鈣，每周更換脫鈣液，6個月后脫水透明，石蠟包埋切片，進行HE染色，倒置顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 可注射CGF凝膠的外觀

比格犬外周靜脈血離心后呈分層狀，上清液層自上而下分別為血清層、PPP層、富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)層，中間層為CD34+細胞層及CD34+細胞與血細胞混合層，下層為血細胞層(圖2A)。將抽取的PPP置于75 ℃恒溫加熱儀中加熱20 min后取出降至室溫，與CD34+細胞混勻后，CGF呈紅色凝膠狀(圖2B～C)。

2.2 比格犬根尖情況及牙髓再生的組織學觀察

2.2.1 影像學檢查 術(shù)前及術(shù)后3個月對比格犬上下頜前牙進行根尖X射線檢查，術(shù)前X射線顯示比格犬上下頜前牙牙根已發(fā)育完全，根尖孔閉合，無根尖陰影(圖3A1、B1)；術(shù)后3個月根尖X射線顯示牙冠處封閉良好，未見明顯根尖陰影，上頜前牙根尖周膜腔略增寬，骨硬板邊緣模糊(圖3A2、B2)。

A1：術(shù)前上前牙X射線片；A2：術(shù)后3個月上前牙X射線片；B1：術(shù)前下前牙X射線片；B2：術(shù)后3個月下前牙X射線片。圖3 比格犬術(shù)前及術(shù)后3個月前牙根尖X射線片

2.2.2 組織學染色 比格犬牙齒石蠟切片HE染色顯示，正常牙髓組織中成牙本質(zhì)細胞呈柵欄狀，沿牙本質(zhì)壁整齊排列，成牙本質(zhì)細胞層、多細胞層、乏細胞層清晰可見(圖4A)；空管組根管內(nèi)僅見少量組織貼附于根尖1/3處的根管壁上，根尖孔通暢，未形成根尖封閉(圖4B)。

A：正常牙髓組織；B：空管組根管組織。黑色箭頭示牙本質(zhì)；黃色箭頭示成牙本質(zhì)細胞層；藍色箭頭示乏細胞層；紅色箭頭示多細胞層；綠色箭頭示未封閉的根尖孔。圖4 正常牙髓與空管組HE染色組織學觀察

除空管組外，根尖引血組(圖5A～B)、CGF組(圖5C～D)和根尖引血+CGF組(圖5E～F)根管內(nèi)均有新生組織產(chǎn)生并伴有不同程度的礦化。根尖引血組新生組織可達根管內(nèi)約1/2處，以骨樣組織為主，上部為少量疏松結(jié)締組織并伴有血管化，根管下部新生骨樣組織阻塞根尖孔，可見新生組織中存在骨陷窩樣結(jié)構(gòu)(圖5A～B)。CGF組根管內(nèi)新生組織以疏松結(jié)締組織為主，可達根管內(nèi)約2/3處，新生組織內(nèi)存在大量血管樣結(jié)構(gòu)，越接近根尖處，血管樣結(jié)構(gòu)越豐富；根管內(nèi)根方1/3處形成新生牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，促進根管壁增厚，高倍鏡下可見成牙本質(zhì)樣細胞存在；礦化組織僅存在于新生軟組織上部中央(圖5C～D)。根尖引血+CGF組根管內(nèi)可見牙本質(zhì)樣組織貼附于根管壁上，其間散在分布成牙本質(zhì)樣細胞；新生疏松結(jié)締組織與健康牙髓組織相似，可見多細胞層、乏細胞層，并存在均勻分布的血管結(jié)構(gòu)；根管冠方與iRoot-BP Plus接觸位置形成礦化橋，將新生牙髓樣組織包裹在內(nèi)(圖5E～F)。

A～B：根尖引血組；C～D：CGF組；E～F：根尖引血+CGF組。黑色箭頭示牙本質(zhì)；白色箭頭示新生牙本質(zhì)及包埋其中的成牙本質(zhì)樣細胞；紅色箭頭示血管；黃色箭頭示類成牙本質(zhì)細胞層；淺藍色箭頭示乏細胞層；綠色箭頭示鈣化組織；橙色箭頭示iRoot-BP Plus；棕色箭頭示多細胞層；紫色箭頭示結(jié)締組織；藍色箭頭示骨陷窩。圖5 根尖引血組、CGF組、根尖引血+CGF組HE染色組織學觀察

3 討論

牙髓再生是牙體牙髓病學及組織工程研究中的重要方向之一，恢復與正常牙齒中相似的牙髓-牙本質(zhì)復合體并實現(xiàn)牙髓組織的功能是牙髓再生研究的最終目的。目前，對于恒牙牙髓缺失，仍以傳統(tǒng)的根管治療為主，在這一過程中，機械性根管預備使原有牙本質(zhì)變薄，同時失去牙髓組織的營養(yǎng)作用，導致根折的風險增大[1-2]。干細胞移植和細胞歸巢被認為是牙髓再生的可能途徑，近年來的研究中，通過牙髓干細胞直接移植[7-8，10-12]、刺激根尖出血形成血凝塊和根管內(nèi)注射PRP[6，18-19]等方法在根管內(nèi)誘導形成的新生組織仍存在一些不足，新生組織不具備牙髓的基本結(jié)構(gòu)，其間分布的鈣化團塊阻塞根管，遠期預后不佳。

CGF是第三代自體血小板凝聚物，采集外周血后通過離心獲得，不添加外源性物質(zhì)，避免引發(fā)機體的免疫排斥反應，除此之外，變速離心將血液中的細胞分離出來，纖維成分和生長因子進一步富集[20-21]。包括成纖維生長因子、表皮生長因子、血小板源性生長因子、轉(zhuǎn)移生長因子、類胰島素生長因子等在內(nèi)的多種生長因子對干細胞的遷移和分化均具有重要影響[22-23]，同時在CGF內(nèi)纖維成分的儲留作用下，這些生長因子可以發(fā)揮更長效的作用[24-25]。在組織工程領(lǐng)域研究中，CGF與自體骨或人工材料的結(jié)合已廣泛用于引導骨再生并取得良好療效[24-25]。本研究中所使用的CGF中添加了CD34+細胞，研究證明，CD34+細胞在組織再血管化過程中發(fā)揮重要作用[15-17]。

本實驗中HE染色結(jié)果顯示，空管組根尖有少量結(jié)締組織存在，而根管內(nèi)未見新生組織長入，根尖孔仍保持開放；未發(fā)現(xiàn)空管組根管內(nèi)感染的發(fā)生，這表明牙髓再生前的根管預備可以有效對根管內(nèi)進行消毒，為實驗組的牙髓再生創(chuàng)造無菌環(huán)境。2004年，BANCHS等[5]提出牙髓再血管化的概念，即通過根尖孔引入血液，誘導根尖周組織中存在的干細胞進入根管，以血凝塊為支架，在牙髓缺失的根管內(nèi)產(chǎn)生血管、神經(jīng)等代替牙髓組織，使牙根繼續(xù)發(fā)育。根尖引血組刺激根尖出血至根管口下1～2 mm處，結(jié)果顯示根管內(nèi)多為鈣化組織阻塞，這與DIOGENES等[26]的研究結(jié)果相似，其原因可能是根尖周來源的血液中部分成分對成骨具有促進作用，導致了過度鈣化的發(fā)生。CGF組根管內(nèi)新生組織接近根管全長，以牙髓樣組織為主，含有少量鈣化組織，證明CGF本身即可發(fā)揮誘導牙髓再生的作用；新生牙髓樣組織中含有豐富的血管結(jié)構(gòu)，表明CD34+細胞在組織再血管化中發(fā)揮促進作用。同時，根管壁的增厚及成牙本質(zhì)樣細胞在牙本質(zhì)樣組織中的沉積提示CGF促進根尖周干細胞的遷移和分化，然而，新生牙本質(zhì)樣組織存在于根尖1/2，根管中上部僅可見部分成牙本質(zhì)樣細胞貼附于根管壁上，延長比格犬牙髓再生的術(shù)后取樣時間可能觀察到新生牙髓樣組織充滿根管空間以及更多牙本質(zhì)樣組織的形成。根尖引血+CGF組的結(jié)果顯示，在刺激根尖出血的同時應用CGF可能形成更好的牙髓再生效果，新生牙本質(zhì)樣組織與根管上部的鈣化橋沿根管壁排列，其中包裹的牙髓樣組織已初步具備正常牙髓的組織結(jié)構(gòu)，多細胞層、乏細胞層、分布均勻的血管結(jié)構(gòu)清晰可辨，盡管根尖1/3由新生牙本質(zhì)樣組織阻塞，但這與根尖引血組的鈣化結(jié)節(jié)仍有不同之處，根尖引血+CGF組根尖部分的礦化組織更加均勻，其間成牙本質(zhì)樣細胞的散在分布與根尖引血組的骨陷窩也有不同。

綜上所述，CGF對誘導根管內(nèi)牙髓再生具有促進作用，單獨應用CGF時即可誘導根管內(nèi)牙髓樣組織再生。臨床中牙髓血運重建的結(jié)果和本研究中根尖引血組誘導牙髓再生均表明血液中的部分成分對礦化形成具有促進作用，然而，根尖引血組與CGF聯(lián)合時根管內(nèi)牙髓樣組織的形成和礦化的發(fā)生似乎達到了平衡，進而形成了類似牙髓-牙本質(zhì)復合體的結(jié)構(gòu)。在后續(xù)研究中，調(diào)整兩者相互結(jié)合的比例有望實現(xiàn)根管內(nèi)局部的礦化和以牙髓樣組織為主的牙髓再生。