秦皮乙素對(duì)大鼠心肌組織抗氧化能力的影響

于曉磊, 郭 研, 董 怡, 李文鑫, 李 瀟

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院, 河北 承德 067000)

多柔比星(doxorubicin,DOX)為蒽環(huán)類代表藥物,但存在心臟毒性,而限制了其應(yīng)用,可能機(jī)制為藥物刺激使心肌細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)抗氧化和促氧化的平衡失調(diào)[1],我們可以通過增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力來減輕心臟毒性。在臨床實(shí)踐中應(yīng)用輔酶Q10、維生素C、E等藥物預(yù)防多柔比星所致心臟損傷,但效果欠佳;因此尋找一個(gè)方便有效的藥物對(duì)抗其心臟毒性具有臨床意義。秦皮乙素(esculetin,ESC)又稱七葉亭,是秦皮的主要有效成分,具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤的作用[2],但是否可以減輕藥物所致心肌損傷鮮有報(bào)道。在本研究中我們用ESC干預(yù)DOX致大鼠心肌損傷,以探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物及材料:雄性SD大鼠(體重220～250g)40只購(gòu)自北京康泰合元生物公司(許可證號(hào):SCXK京2012-0001);辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、兔源P53、鼠雙微體基因2(MDM2)、血紅素加氧合酶1(HO-1)、核因子E-2相關(guān)因子2(Nrf2)、β肌動(dòng)蛋白(β-actin)一抗均購(gòu)于Proteintech公司(中國(guó)武漢);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、血清丙二醛(MDA)及氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、多柔比星、秦皮乙素(純度99%)購(gòu)于康泰合元生物公司(中國(guó)北京)。

1.2動(dòng)物分組及模型制備:40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組,每組10只,分別為:對(duì)照組、DOX組、ESC低劑量+DOX組、ESC高劑量+DOX組。模型制備方法[3]:注射用水5mL溶解DOX加入0.9%生理鹽水,配置成1mL生理鹽水含有DOX0.8mg,避光低溫存放備用。DOX組、ESC低劑量+DOX組,ESC高劑量+DOX組從實(shí)驗(yàn)第2天開始以2.5mg/kg腹腔注射DOX,隔天1次,共6次;對(duì)照組同時(shí)腹腔注射等劑量生理鹽水。給藥方法及處理:對(duì)照組和DOX組從實(shí)驗(yàn)第1～16天每日4mL生理鹽水灌胃;ESC(低劑量&高劑量)+DOX組從實(shí)驗(yàn)第1天起以(50mg/kg&100mg/kg)的ESC溶于4mL生理鹽水中灌胃,連續(xù)16d。末次灌胃后10d,測(cè)血中LDH、CK、CK-MB水平;解剖取心臟,處理后浸石蠟、包埋、Masson染色,比較各組心肌組織中膠原纖維的量的變化。DOX組大鼠心臟染色切片顯微鏡下可見細(xì)胞空泡變性,膠原纖維增多,提示造模成功。

1.3大鼠心肌組織SOD和MDA含量測(cè)定:取200mg心肌組織,在含有50mmoL/L Tris-HCl (pH 7.4),150 mmoL/L NaCl,5mmoL/L EDTA,1mmoL/L二硫蘇糖醇,1%Triton X-100和1% 蛋白酶抑制劑的裂解液中進(jìn)行勻漿。取勻漿上清液,TBA法測(cè)定MDA含量,WST-1法測(cè)定SOD活性。

1.4蛋白免疫印跡法檢測(cè)大鼠心肌組織相關(guān)蛋白的表達(dá):使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,取50μg蛋白樣品,上樣至SDS-聚丙烯酰胺凝膠,恒定電泳,然后轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜上,分別加入P53、MDM2、HO-1、Nrf2、β-actin一抗(用稀釋液將一抗按照1∶500稀釋)4℃孵育過夜,再分別加入二抗(用稀釋液將二抗按照1∶500稀釋)室溫下1h后ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。

1.5統(tǒng)計(jì)分析:使用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,對(duì)照組和DOX組的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),ESC低、高劑量+DOX組與DOX組的比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD法,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1ESC對(duì)DOX誘導(dǎo)后大鼠心功能的影響:DOX組與對(duì)照組比較,LDH(t=-18.980,P<0.001)、CK(t=-10.954,P<0.001)、CK-MB(t=-15.749,P<0.001)均上升;而ESC低、高劑量+DOX組心肌酶與DOX組相比各項(xiàng)指標(biāo)均明顯下降,說明ESC能減輕DOX對(duì)心肌組織的損傷,見表1。

表1 各組大鼠心肌酶變化情況

2.2ESC對(duì)DOX誘導(dǎo)后大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)的影響:Masson染色后肌纖維成紅色,膠原纖維呈藍(lán)色。對(duì)照組心肌纖維呈紅色,有序排列呈條索狀,藍(lán)色膠原纖維含量極少(見圖1A)。DOX組小鼠細(xì)胞空泡變性,大量的膠原纖維被染成藍(lán)色,相互連接成網(wǎng)狀,排列紊亂,分布不均(見圖1B);與DOX組比較,ESC低劑量+DOX組藍(lán)色膠原纖維略減少(見圖1C);ESC高劑量+DOX組藍(lán)色膠原纖維明顯減少(見圖1D)。

圖1 Masson染色(×200)鏡下觀察各組大鼠心肌組織中膠原纖維變化

2.3ESC對(duì)DOX誘導(dǎo)后心肌組織SOD、MDA活性影響:DOX組大鼠心肌組織MDA與對(duì)照組相比升高(t=-18.743,P<0.001),但SOD表達(dá)比對(duì)照組降低(t=12.517,P<0.001);與DOX組相比,ESC低、高劑量+DOX組大鼠心肌組織MDA表達(dá)降低,SOD表達(dá)升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 各組大鼠心肌組織SOD MDA表達(dá)量

2.4Western blot 法檢測(cè)各組相關(guān)蛋白的表達(dá)水平:DOX組大鼠心肌組織P53表達(dá)高于對(duì)照組(t=-30.670,P<0.001),但MDM2(t=14.915,P<0.001)、HO-1(t=17.671,P<0.001)、Nrf2(t=20.128,P<0.001)表達(dá)明顯低于對(duì)照組;ESC低、高劑量+DOX組大鼠心肌組織P53表達(dá)明顯低于DOX組,MDM2、HO-1、Nrf2表達(dá)明顯高于DOX組。見圖2、表3。

圖2 大鼠心肌組織中P53、MDM2、HO-1、Nrf2蛋白表達(dá)情況

表3 各組大鼠心肌組織中P53 MDM2 HO-1 Nrf2相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

《傷寒論》中記載的“正在心下,按之則痛”,“心中結(jié)痛”,“心下滿微痛”,“心下必痛”,“短氣但坐”,“胸悶煩驚,譫語(yǔ)”,“心中惕惕大動(dòng)”等證候,與多柔比星致心肌損傷過程中出現(xiàn)的心絞痛、心律失常、心力衰竭等各階段的臨床表現(xiàn)極為相似。而多柔比星(DOX)在惡性腫瘤化療中起到重要作用,治療效果顯著,但因其心臟毒性制約了臨床上的應(yīng)用,其主要機(jī)制為活性氧生成增加、線粒體功能紊亂、DNA損傷、細(xì)胞凋亡等[4]。ESC又稱6,7-二羥基香豆素,是香豆素的衍生物,近年研究發(fā)現(xiàn),ESC對(duì)胃癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等癌細(xì)胞具有抑制增殖、遷移,誘導(dǎo)凋亡的作用[5]。目前,關(guān)于ESC對(duì)蒽環(huán)類藥物所致心肌損傷保護(hù)作用的研究鮮有報(bào)道,本研究從多方面證實(shí)ESC在一定程度上可減少DOX所致心肌組織氧化應(yīng)激反應(yīng),從而保護(hù)心肌組織。目前乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)較為特異性地反映心肌細(xì)胞的損傷。膠原與機(jī)體功能密切相關(guān),而膠原纖維過度堆積、比例失調(diào),是心肌重塑的重要病理特征和形成因素。在本研究中發(fā)現(xiàn)DOX可導(dǎo)致大鼠LDH、CK和CK-MB水平升高、心肌組織中膠原纖維增多,但經(jīng)過ESC處理后心肌酶水平明顯降低、心肌組織中膠原纖維減少,從宏觀上證實(shí)ESC具有保護(hù)心肌作用。

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致心肌損傷的重要因素,MDA可直接反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的強(qiáng)度及速率[6]。SOD是體內(nèi)重要活性成分,其水平降低意味著機(jī)體抗氧化損傷的能力減弱,本研究發(fā)現(xiàn),DOX誘導(dǎo)后大鼠心肌組織MDA異常升高,SOD降低,提示心肌組織抗氧化能力下降、受到自由基損傷;而ESC預(yù)處理后逆轉(zhuǎn)了心肌組織中MDA、SOD水平,提示ESC在一定程度上提高了機(jī)體抗氧化能力。

鼠雙微體基因2(murine double minute2,mdm2 )可與p53形成負(fù)反饋環(huán)路。正常細(xì)胞內(nèi)的mdm2/p53比值相對(duì)保持穩(wěn)定,損傷后可使mdm2表達(dá)顯著下降,從而阻斷p53介導(dǎo)的多種信號(hào)通路活化,最終導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激、炎癥等多種病理?yè)p傷,本實(shí)驗(yàn)中證實(shí)DOX可導(dǎo)致心肌組織內(nèi)p53和mdm2平衡,促進(jìn)p53的堆積,引起心肌組織發(fā)生過氧化反應(yīng),而針對(duì)負(fù)反饋環(huán)路,本研究也同樣發(fā)現(xiàn)ESC可通過增加mdm2的表達(dá)、抑制p53活性,保護(hù)心肌組織。核因子E-2相關(guān)因子2(Nrf2)是體內(nèi)起到抗氧化作用的關(guān)鍵因子[7],它能調(diào)節(jié)多種抗氧化劑的表達(dá)[8]。血紅素加氧合酶1(HO-1)通過促氧化劑降解,從而發(fā)揮抗氧化等作用。有研究證實(shí),HO-1的表達(dá)上調(diào)可減輕氧化應(yīng)激所致的細(xì)胞損傷[9],因此Nrf2/HO-1與細(xì)胞抗氧化能力密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)ESC預(yù)處理后上調(diào)了Nrf2及HO-1的表達(dá),這證實(shí)ESC通過增加Nrf2核易位及HO-1的表達(dá)來介導(dǎo)抗氧化應(yīng)激作用。

綜上所述,ESC預(yù)處理可通過激活p53負(fù)反饋通路及Nrf2/HO-1信號(hào)途徑抑制氧化應(yīng)激并減少細(xì)胞凋亡,從而有效改善心肌功能,然而這僅僅是眾多機(jī)制中的一個(gè)環(huán)節(jié),為針對(duì)多因素綜合干預(yù)的藥物或方法的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。