缺氧環(huán)境下HIF-1調(diào)控PAD4介導(dǎo)的H3cit促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞凋亡

黃 勇, 羅 書, 廖 源, 王開舉

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院, 海南 ?？?570311)

子宮內(nèi)膜是女性生殖系統(tǒng)中至關(guān)重要的組織,其周期性重塑和變化對(duì)于妊娠的建立至關(guān)重要。這一過程涉及多種激素和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,其中子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞凋亡在調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)和功能中起著重要作用[1,2]。但其凋亡的具體形成機(jī)制還有待研究。缺氧是許多生理和疾病狀態(tài)的共同特征,特別是在妊娠障礙疾病中,缺氧信號(hào)發(fā)揮關(guān)鍵作用[3,4]。在缺氧條件下,缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)被激活,從而調(diào)控多種基因表達(dá)發(fā)揮生理性,包括肽基精氨酸脫亞胺酶4(PAD4)[5]。PAD4可以介導(dǎo)蛋白質(zhì)的精氨酸殘基轉(zhuǎn)化為瓜氨酸殘基,其產(chǎn)物瓜氨酸化組蛋白H3(H3cit)在凋亡和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[6]。研究表明,女性PAD4和H3cit的水平增加會(huì)引起子宮的損傷和衰竭[7]。然而在子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中,缺氧條件是否可以通過HIF-1調(diào)控PAD4基因進(jìn)而引發(fā)凋亡仍不清楚,其相關(guān)的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。在本實(shí)驗(yàn)中,通過構(gòu)建過表達(dá)HIF-1以及沉默PAD4的細(xì)胞系,檢測(cè)其對(duì)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞凋亡的影響,并探討相關(guān)機(jī)制,為子宮內(nèi)膜類疾病的發(fā)生及治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料:宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞CM-H058(貨號(hào):CM-H058)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;胎牛血清(貨號(hào):CMS101.03)購自賽澳美細(xì)胞技術(shù)(北京)有限公司;qPCR SYBR Green Master Mix(貨號(hào):Q111-02)購自南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司;HIF-1、PAD4、Caspase3、Caspase7基因引物由上海生工生物工程公司合成;HIF-1(貨號(hào):ab1)、H3cit(貨號(hào):ab5103)、Caspase3(貨號(hào):ab32351)、Caspase7(貨號(hào):ab255818)抗體購自abcam公司;PAD4(貨號(hào):17373-1-AP)抗體購自武漢三鷹公司;細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):E-CK-A211)購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;MinElute PCR純化試劑盒(貨號(hào):57704)購自德國Qiagen;oe-PAD4、oe-NC以及sh-NC、sh-HIF-1慢病毒質(zhì)粒湖南豐暉生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞CM-H058培養(yǎng)于RIPM 1640培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、青霉素(100U/mL)和鏈霉素(100μg/mL)。當(dāng)細(xì)胞密度生長至80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代,并適時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基以供細(xì)胞生長需要,將細(xì)胞培養(yǎng)在37℃,含5%CO2的濕化培養(yǎng)箱中。

1.2.2慢病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建過表達(dá)HIF-1/沉默PAD4的細(xì)胞系:將細(xì)胞以2×105的密度接種在六孔培養(yǎng)皿中,等待細(xì)胞生長密度到達(dá)70%時(shí)轉(zhuǎn)染病毒。分別設(shè)置oe-NC組(轉(zhuǎn)染oe-NC)、oe-PAD4組(轉(zhuǎn)染oe-PAD4)、oe-PAD4+sh-NC組(轉(zhuǎn)染oe-PAD4與sh-NC)、oe-PAD4+sh-HIF-1組(轉(zhuǎn)染oe-PAD4與sh-HIF-1)。每孔所需病毒量[病毒體積=(MOI×細(xì)胞數(shù)量)/病毒滴度,病毒滴度=2×108TU/mL],病毒感染約72h后,將培養(yǎng)基更換為含有4μg/mL嘌呤霉素的選擇培養(yǎng)基。分離嘌呤霉素抗性細(xì)胞克隆,在含有2μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基中擴(kuò)增7d,然后轉(zhuǎn)移到不含嘌呤霉素的培養(yǎng)基中。

1.2.3qRT-PCR檢測(cè)HIF-1、PAD4、Caspase3、Caspase7基因表達(dá)水平:TRizol試劑提取細(xì)胞中的總RNA,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA純度和濃度。依據(jù)strand cDNA Synthesis試劑盒操作說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。按照qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒指示配制qRT-PCR反應(yīng)體系。以GAPDH為引物,按照2-ΔΔCt公式計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下:HIF-1,正向:CCCCGAGTTGCAGTATCAAAT,反向:AACGGACAAACGGACACACA;PAD4,正向:AAACGCGTGATGGGCTTCC,反向:AAGAAAGCAAGCCACTGCTG;Caspase3,正向:GAGCTTGGAACGGTACGCTA,反向:CCGTACCAGAGCGAGATGAC;Caspase7,正向:CCGTGGGAACGATGACCG,反向:GATTCATCAACGAACGGCGG;GAPDH,正向:AATGGGCAGCCGTTAGGAAA;反向:GCGCCCAATACGACCAAATC。

1.2.4Western blot HIF-1、PAD4、H3cit、Caspase3、Caspase7的蛋白表達(dá)水平:用RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞中的總蛋白,并使用BCA測(cè)定蛋白濃度。通過12% SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)(120V,90min)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜(300mA,60min)。隨后,將PVDF膜用5%脫脂牛奶室溫封閉60min,并與一抗(均按1∶1,000稀釋)在4℃下孵育過夜。然后將膜與抗兔二抗(1∶5000稀釋)在室溫下孵育2h。使用ECL試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶,并使用生物放射成像系統(tǒng)量化每種蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平:用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖鹽水PBS洗滌細(xì)胞兩次,并根據(jù)制造商的說明進(jìn)行細(xì)胞凋亡測(cè)定。簡(jiǎn)而言之,每管加入100μL 1×結(jié)合緩沖液,充分懸浮細(xì)胞。加入染料并將細(xì)胞在室溫下避光孵育15min,然后加入300μL 1×結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至避光的5mL流式細(xì)胞儀管中,并在1h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。

1.2.6ChIP-qPCR檢測(cè)PAD4和H3cit在Caspase3、Caspase7轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)富集水平:CM-H058細(xì)胞在15cm平板中生長至85%匯合度。細(xì)胞在1%甲醛中固定8min。通過超聲處理對(duì)染色質(zhì)進(jìn)行剪切,4℃12000r/min離心10min。每個(gè)ChIP10μg HIF-1抗體,孵育過夜,離心后去上清,加入洗脫緩沖液,室溫孵育10min,離心后收集上清,65℃ 6h。通過MinElute PCR純化試劑盒純化DNA。參考1.2.3進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。TSS引物序列:Caspase3,正向:GTCATCTCGCTCTGGTACGG,反向:CACACACACAAAGCTGCTCC、Caspase7,正向:ACTTCGACAAAGCGACAGGT,反向:GTCACGCCATCTTTCCCGTA。

2 結(jié) 果

2.1缺氧環(huán)境下HIF-1、PAD4、H3cit以及細(xì)胞凋亡水平升高:qRT-PCR結(jié)果顯示,與常氧組比較,缺氧組HIF-1、PAD4、Caspase3、Caspase7基因表達(dá)升高(P<0.05),見表1。Western blot結(jié)果顯示,與常氧組比較,缺氧組HIF-1、PAD4、H3cit、Caspase3、Caspase7蛋白表達(dá)升高(P<0.05),見圖1和表2。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與常氧組比較,缺氧組細(xì)胞凋亡水平升高(P<0.05),見表3。

表1 兩組細(xì)胞中HIF-1 PAD4 Caspase3 Caspase7基因表達(dá)比較

表2 兩組細(xì)胞中HIF-1 PAD4 H3cit Caspase3 Caspase7蛋白表達(dá)比較

表3 常氧組和缺氧組細(xì)胞凋亡率比較

圖1 兩組細(xì)胞HIF-1、PAD4、H3cit、Caspase3、Caspase7蛋白表達(dá)曝光圖

2.2敲低HIF-1抑制PAD4、H3cit以及細(xì)胞凋亡水平:qRT-PCR結(jié)果顯示,與sh-NC組比較,sh-HIF-1組HIF-1、PAD4、Caspase3、Caspase7基因表達(dá)降低(P<0.05),見表4。Western blot結(jié)果顯示,與sh-NC組比較,sh-HIF-1組HIF-1、PAD4、H3cit、Caspase3、Caspase7蛋白表達(dá)降低(P<0.05),見圖2和表5。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與sh-NC組比較,sh-HIF-1組細(xì)胞凋亡水平降低(P<0.05),見表6。

表4 敲低HIF-1對(duì)PAD4 Caspase3 Caspase7基因表達(dá)的影響

表5 敲低HIF-1對(duì)PAD4 H3cit Caspase3 Caspase7蛋白表達(dá)的影響

表6 敲低HIF-1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

圖2 敲低HIF-1后細(xì)胞HIF-1、PAD4、H3cit、Caspase3、Caspase7蛋白表達(dá)曝光圖

2.3過表達(dá)PAD4拮抗HIF-1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響:qRT-PCR結(jié)果顯示,與sh-HIF-1+oe-NC組比較,sh-HIF-1+oe-PAD4組PAD4、Caspase3、Caspase7基因表達(dá)升高(P<0.05),見表7。Western blot結(jié)果顯示,與sh-HIF-1+oe-NC組比較,sh-HIF-1+oe-PAD4組PAD4、H3cit、Caspase3、Caspase7蛋白表達(dá)升高(P<0.05),見圖3和表8。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與sh-HIF-1+oe-NC組比較,sh-HIF-1+oe-PAD4組細(xì)胞凋亡水平升高(P<0.05),見表9。

表7 過表達(dá)PAD4對(duì)Caspase3 Caspase7基因表達(dá)的影響

表8 過表達(dá)PAD4對(duì)H3cit Caspase3 Caspase7蛋白表達(dá)的影響

表9 過表達(dá)PAD4對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

圖3 過表達(dá)PAD4后細(xì)胞H3cit、Caspase3、Caspase7蛋白表達(dá)曝光圖

2.4過表達(dá)PAD4促進(jìn)Caspase3、Caspase7基因轉(zhuǎn)錄:ChIP-qPCR結(jié)果,與sh-HIF-1+oe-NC組比較,sh-HIF-1+oe-PAD4組PAD4、H3cit和H3K27ac在Caspase3、Caspase7 TSS富集水平增加(P<0.05),見表10。

表10 兩組細(xì)胞PAD4和H3cit在Caspase3 Caspase7 TSS富集比較(/input %)

3 討 論

恒定的氧氣供應(yīng)對(duì)于正常的組織功能、發(fā)育和體內(nèi)平衡至關(guān)重要,在缺氧微環(huán)境下,細(xì)胞的代謝將會(huì)重編程,激活不同的分子信號(hào)通路以適應(yīng)缺氧環(huán)境,包括血管生成、葡萄糖代謝和細(xì)胞增殖等生理過程。當(dāng)氧水平下降時(shí),細(xì)胞會(huì)通過一系列基因和蛋白表達(dá)的調(diào)控從而引發(fā)細(xì)胞凋亡[8]。細(xì)胞凋亡可以清除功能失調(diào)的細(xì)胞,在維持正常組織的生理功能中起著至關(guān)重要的作用,但是異常或過度的細(xì)胞凋亡將會(huì)導(dǎo)致組織損傷[9]。子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的過度凋亡將導(dǎo)致子宮內(nèi)膜損傷,炎癥細(xì)胞以及炎性因子浸潤,進(jìn)而進(jìn)一步破壞子宮內(nèi)膜屏障功能[10]。因此探究缺氧條件下子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的凋亡分子機(jī)制對(duì)緩解子宮內(nèi)膜損傷有治療意義。

HIF-1是一種異二聚體轉(zhuǎn)錄因子,它可以協(xié)調(diào)機(jī)體的適應(yīng)性反應(yīng),以維持氧穩(wěn)態(tài)和適應(yīng)低氧水平[11]。HIF-1參與胚胎發(fā)育、腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等過程[12]。既往研究表明,缺氧條件下,HIF-1表達(dá)上調(diào),可通過兩種機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。在本實(shí)驗(yàn)中,在缺氧環(huán)境下,HIF-1表達(dá)水平以及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Caspase3、Caspase7)表達(dá)水平均顯著增加,而敲低HIF-1可以降低細(xì)胞的凋亡水平,說明缺氧可以誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞凋亡,并與HIF-1的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。近期研究表明,H3cit表現(xiàn)出高細(xì)胞毒性,可能引起組織損傷,導(dǎo)致多器官衰竭[14]。在本實(shí)驗(yàn)中,在缺氧環(huán)境下,PAD4、H3cit的表達(dá)均上調(diào),同時(shí)過表達(dá)PAD4可逆轉(zhuǎn)敲低HIF-1對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用,說明PAD4及其介導(dǎo)的H3cit可能位于HIF-1的下游,并參與了缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。H3cit形成后,組蛋白與DNA的靜電結(jié)合能力減弱,促進(jìn)RNA聚合酶Ⅱ能夠進(jìn)入DNA并將其轉(zhuǎn)錄成mRNA[3]。為進(jìn)一步探索PAD4介導(dǎo)H3cit如何誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)通過ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了PAD4和H3cit在Caspase3、Caspase7 TSS富集水平,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PAD4促進(jìn)PAD4和H3cit在Caspase3、Caspase7 TSS富集水平。提示PAD4介導(dǎo)的H3cit可以促進(jìn)Caspase3、Caspase7基因轉(zhuǎn)錄,最終誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞凋亡。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)缺氧環(huán)境下HIF-1與PAD4表達(dá)水平增加,HIF-1可以促進(jìn)PAD4表達(dá)。PAD4的表達(dá)上調(diào)后介導(dǎo)H3cit,進(jìn)一步誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白Caspase3、Caspase7的基因轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果初步明確了缺氧環(huán)境下HIF-1與PAD4介導(dǎo)H3cit形成在子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞凋亡中的作用,可為進(jìn)一步探索子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病的治療提供思路。