不同花椒品種對柑橘鳳蝶幼蟲的生長發(fā)育及生理酶活性的影響

鄭 宇,祝曉云*,張開艷,余家奇,覃 成

(1.遵義職業(yè)技術學院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)系,貴州 遵義 563000; 2.遵義華邦農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司,貴州 遵義 563000;3.遵義醫(yī)科大學 第三人民附屬醫(yī)院,貴州 遵義 563000)

花椒Zanthoxylumbungeanum屬蕓香科Rutaceae花椒屬Zanthoxylum植物,主產(chǎn)區(qū)為四川、陜西和甘肅等[1]?；ń凡粌H是傳統(tǒng)的中藥材,還具有去膻去腥和增麻增香的作用,是一種典型的調(diào)味香料[2]。在川渝地區(qū),花椒是重要的經(jīng)濟作物,種植面積廣、產(chǎn)量高,花椒產(chǎn)業(yè)也是實現(xiàn)鄉(xiāng)村振興的特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)[3]。貴州省將花椒產(chǎn)業(yè)作為林業(yè)特色產(chǎn)業(yè),且毗鄰川渝地區(qū),環(huán)境氣候大體一致,因此主要引進重慶‘九葉青’‘藤椒’及四川‘漢源’等花椒品種進行栽種。但地方小氣候仍會對昆蟲的取食規(guī)律造成影響,因此評估引進花椒的抗蟲性具有十分重要的意義。

柑橘鳳蝶Papilioxuthus屬鱗翅目Lepidoptera鳳蝶科Papilionidae,主要分布于中國及緬甸、日本、韓國、菲律賓等東南亞國家地區(qū),在我國除新疆外的各省均有分布[4]。它雖然是種觀賞性很強的昆蟲,同時也是一種農(nóng)業(yè)害蟲[5]。主要以幼蟲寡食為害蕓香科植物葉片,如花椒、柑橘、黃檗、食茱萸等蕓香科植物[6]。多數(shù)情況下達不到需要防治的經(jīng)濟閾值,但進入老熟幼蟲階段的柑橘鳳蝶在化蛹前會有一個暴食期,在部分花椒種植區(qū)會造成花椒減產(chǎn)5%～10%[7]。

寄主植物可影響植食性昆蟲的生長發(fā)育、取食量和生理變化等,因此,研究害蟲及其寄主植物的互作關系有助于掌握害蟲種群動態(tài)及制定防控治理措施[8]。有研究報道,與在紫花苜蓿、馬齒莧、灰綠藜、木地膚等7種寄主植物相比,牧草盲蝽Lyguspratensis若蟲在花椰菜和四季豆適合度高,發(fā)育歷期最短,存活率最高[9]。草地螟Loxostegesticticalis幼蟲的相對取食量、相對生長率和食物利用率因取食不同寄主植物出現(xiàn)較大差異[10]。昆蟲通常通過體內(nèi)的細胞色素P450酶(cytochrome P450,P450)、谷胱甘肽S轉移酶(glutathione Stransferases,GSTs)和羧酸酯酶(carboxylesterase,CarE)等解毒酶來抵御植物的化學防御[11]。取食大白菜后,甜菜夜蛾Spodopteraexigua幼蟲的CarE活性最高,但如果以玉米Zeamays幼苗飼喂甜菜夜蛾幼蟲,CarE酶活性降低近60%[12]。昆蟲消化酶是消化食物的重要蛋白,因此消化酶活性在一定程度上反映了昆蟲所需營養(yǎng)的種類及各類營養(yǎng)物質(zhì)被昆蟲利用的狀況[13]。分別以玉米、小麥和馬鈴薯葉片飼養(yǎng)草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda幼蟲,馬鈴薯葉片可導致草地貪夜蛾幼蟲體內(nèi)胃蛋白酶活性顯著升高[14]。

目前,對柑橘鳳蝶的研究主要集中在系統(tǒng)分化[15]、滯育[16]、蟲體營養(yǎng)成分分析[17]、蟲體揮發(fā)物成分及觸角電位反應[4]及發(fā)聲器的顯微結構及防御作用[18]等方面,對于寄主影響柑橘鳳蝶的生長發(fā)育及生理酶活性研究還知之甚少。本文以柑橘鳳蝶幼蟲為研究對象,比較初孵幼蟲在本地花椒‘遵紅’和引進的‘漢源’‘九葉青’‘藤椒’寄主上幼蟲各齡期的體長、頭殼寬、發(fā)育歷期,通過測定分析5齡幼蟲取食量和解毒消化酶活性的差異,為評估柑橘鳳蝶幼蟲對引進花椒的風險提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源及飼養(yǎng)條件

2019年8月,柑橘鳳蝶成蟲采自貴州省遵義市綏陽縣管理粗放的本地紅花椒‘遵紅’花椒園(E 107°16′,N 27°59′),帶回實驗室并飼養(yǎng)在遵義職業(yè)技術學院教學用可控溫濕玻璃溫室并產(chǎn)卵于‘遵紅’花椒葉片上,連續(xù)飼養(yǎng)數(shù)代后,以足量初孵幼蟲作為供試蟲源,飼養(yǎng)條件為(25±1)℃、相對濕度(70±10)%、L∶D=16∶8。

1.2 花椒品種對柑橘鳳蝶幼蟲生長發(fā)育的影響

根據(jù)引種實際,本研究選取種植于玻璃溫室的本地花椒‘遵紅’和引進的‘漢源’‘九葉青’‘藤椒’葉片作為供試寄主材料。待卵孵化后,用細毛筆將初孵幼蟲挑出,轉入裝有不同花椒品種葉片飼養(yǎng)盒(長×寬×高=60 cm×50 cm×45 cm)中單頭飼養(yǎng)。每個花椒品種處理30頭初孵幼蟲,重復3次。每天10∶00觀察1次,蛻皮后用細毛筆移除頭殼記為2齡幼蟲,以此類推,使用游標卡尺測量記錄各幼蟲齡期第2天的體長和頭殼寬,幼蟲化蛹后終止記錄,每天更換新鮮花椒葉片,統(tǒng)計不同齡期幼蟲發(fā)育歷期。

1.3 花椒品種對柑橘鳳蝶5齡幼蟲取食量的影響

柑橘鳳蝶5齡幼蟲進入暴食期,因此對不同寄主植物的取食量測定選取5齡第2天幼蟲作為試驗對象。將挑選出的柑橘鳳蝶幼蟲均分為3個重復,每個重復5頭幼蟲,測定并記錄各重復組取食前鮮葉、取食24 h后殘葉的重量,并用未接蟲的葉片測算校正失水率。

取食量/g=(取食前葉片鮮重-食后葉片鮮重)/(1-校正失水率)。

1.4 花椒品種對柑橘鳳蝶5齡幼蟲生理酶活性的影響

分別取1.2的柑橘鳳蝶幼蟲饑餓2 h后,選取個體大小一致的單頭幼蟲用于解毒酶和消化酶活性的測定,每個處理3次重復。粗酶液的制備參照王秀吉等[19]制備方法:冰浴下解剖柑橘鳳蝶幼蟲,取出腸道,用冰冷的pH=7.2,0.1 M PBS緩沖液沖洗腸道后,立即放入滅菌離心管中,加入適量的PBS緩沖液稀釋,冰水浴中勻漿2 min破碎消化道組織,勻漿液于8000 g,4 ℃離心10 min,上清液即為粗酶液,分裝后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

解毒酶和消化酶活性測定均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒(胃蛋白酶試劑盒編號A080-1-1、淀粉酶試劑盒編號C016-1-1、脂肪酶試劑盒編號A054-1-1、谷胱甘肽-S-轉移酶試劑盒編號A004-1-1、細胞色素P450酶試劑盒編號H303、羧酸酯酶試劑盒編號A133-1-1)進行測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2010記錄和整理數(shù)據(jù),原始數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析,若存在顯著差異,則用Turkey法進行多重比較,顯著水平為P<0.05,試驗數(shù)據(jù)均用平均值±標準誤表示,采用Origin 2022軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 不同花椒品種對柑橘鳳蝶幼蟲體長和頭殼寬的影響

試驗結果表明,取食不同花椒品種對柑橘鳳蝶幼蟲的體長和頭殼寬有顯著差異,但影響的程度因該蟲的齡期而異(圖1)。取食不同花椒品種葉片對柑橘鳳蝶1齡幼蟲的體長和頭殼寬無明顯影響(P>0.05);自2齡起,取食‘九葉青’花椒后幼蟲體長和頭殼寬均顯著高于本地品種‘遵紅’花椒,‘藤椒’次之(P<0.05)。取食‘漢源’花椒僅在5齡幼蟲的體長和4齡、5齡頭殼寬顯著大于取食‘遵紅’花椒(P<0.05)。

注:不同小寫字母分別表示差異顯著(P<0.05),下同。

2.2 不同花椒品種對柑橘鳳蝶幼蟲發(fā)育歷期的影響

試驗結果表明,不同花椒品種對柑橘鳳蝶幼蟲的發(fā)育歷期有明顯影響(圖2)。取食‘九葉青’花椒的發(fā)育歷期最短,為15.63 d,顯著少于其他花椒品種(P<0.05);以‘遵紅’花椒飼養(yǎng),柑橘鳳蝶幼蟲的發(fā)育歷期最長,為21.70 d。其中,以‘九葉青’飼養(yǎng)的4齡(3.33 d)、5齡(4.20 d)幼蟲發(fā)育歷期顯著短于以‘遵紅’花椒4齡(4.80 d)、5齡(5.83 d)飼養(yǎng)的幼蟲(P<0.05);花椒品種對3齡前柑橘鳳蝶幼蟲的發(fā)育歷期無顯著影響(P>0.05)。

圖2 柑橘鳳蝶幼蟲取食不同花椒品種的發(fā)育歷期

2.3 不同花椒品種對柑橘鳳蝶5齡幼蟲取食量的影響

柑橘鳳蝶5齡第2天幼蟲對不同花椒品種的取食量存在差異(P<0.05)(圖3)。取食量由多到少依次為取食‘九葉青’(1.74 g)>‘藤椒’(1.26 g)>‘漢源’(0.62 g)>‘遵紅’(0.43 g)。

圖3 柑橘鳳蝶5齡幼蟲在不同花椒品種上的取食量

2.4 不同花椒品種對柑橘鳳蝶5齡幼蟲消化酶酶活性的影響

試驗結果表明,不同花椒品種對柑橘鳳蝶5齡幼蟲消化酶的酶活有顯著差異(P<0.05)(圖4)。取食不同花椒品種的柑橘鳳蝶5齡幼蟲體內(nèi)胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的活性高低順序為:‘九葉青’>‘藤椒’>‘漢源’>‘遵紅’。其中,胃蛋白酶和脂肪酶活性在4個品種之間均差異顯著(P<0.05),具體為胃蛋白酶活性高低順序為‘九葉青’(3.35)>‘藤椒’(3.16)>‘漢源’(2.59)>‘遵紅’(2.30),脂肪酶活性由高到低為‘九葉青’(1.47)>‘藤椒’(1.40)>‘漢源’(1.26)>‘遵紅’(1.05);淀粉酶活性在取食‘九葉青’和‘藤椒’分別與‘漢源’、‘遵紅’差異顯著(P<0.05),活性高低順序‘九葉青’(0.26)>‘藤椒’(0.21)>‘漢源’(0.17)>‘遵紅’(0.13)。說明消化酶在柑橘鳳蝶5齡幼蟲取食花椒的過程中起重要作用。

圖4 取食不同花椒品種的柑橘鳳蝶5齡幼蟲消化酶活性

2.5 不同花椒品種對柑橘鳳蝶5齡幼蟲解毒酶酶活性的影響

不同花椒品種對柑橘鳳蝶5齡幼蟲解毒酶的酶活性影響無顯著差異(圖5)。取食不同花椒品種的柑橘鳳蝶5齡幼蟲體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉移酶、細胞色素P450酶和羧酸酯酶的活性均無顯著變化(P>0.05)。說明解毒酶在柑橘鳳蝶5齡幼蟲取食花椒的過程中不起主要作用。

圖5 取食不同花椒品種的柑橘鳳蝶5齡幼蟲解毒酶活性

3 結論與討論

寡食性昆蟲可在幾種或多種寄主植物間遷移危害,不同寄主植物具有不同營養(yǎng)構成和次生代謝物質(zhì),反映在昆蟲的生長發(fā)育、取食繁殖及體內(nèi)生理、生化指標等方面。為更好地生存和繁殖,昆蟲需要不斷提高自身對寄主植物的適應能力[20]。

本研究選取了在‘遵紅’花椒上培育的初孵柑橘鳳蝶幼蟲,分別以‘遵紅’、‘漢源’、‘九葉青’和‘藤椒’為寄主植物完成幼蟲發(fā)育階段。結果表明,取食‘九葉青’花椒后幼蟲體長和頭殼寬均顯著高于取食本地‘遵紅’花椒品種,且在‘九葉青’花椒上最快完成幼蟲的發(fā)育;另外,體長、頭殼寬、發(fā)育歷期顯著性差異均較為一致的出現(xiàn)在暴食期(4齡或5齡老熟幼蟲),說明不同花椒品種對柑橘鳳蝶幼蟲發(fā)育歷期主要集中在對老熟幼蟲(4齡和5齡)發(fā)育歷期的影響,柑橘鳳蝶幼蟲對‘九葉青’具有較好的適應性。柑橘鳳蝶5齡幼蟲進入暴食期為化蛹做準備,進一步說明柑橘鳳蝶幼蟲對‘九葉青’具較好的適應性。以上結果說明,‘九葉青’花椒較其他花椒品種更適合柑橘鳳蝶幼蟲生長發(fā)育,暴食期的幼蟲體長、頭殼寬、取食量均顯著增加,可能在為快速化蛹從而縮短發(fā)育歷期做能量物質(zhì)的積累。類似的研究表明,采用不同的食料植物葉片飼養(yǎng)美國白蛾Hyphantriacunea幼蟲,4齡后的累積取食量達到總取食量的95%以上[21]。桃小食心蟲Carposinasasakii的生長發(fā)育和繁殖在不同寄主植物間存在顯著差異[22]。桃和蘋果更適宜蘋小卷葉蛾Adoxophyesorana的發(fā)育及繁殖[23]。

生理酶在植食性昆蟲取食植物起重要作用,首先解毒酶作用于昆蟲抵御植物的化學防御過程,當昆蟲克服植物的防御屏障后,還需要消化酶進一步進行組織的分解和營養(yǎng)的吸收[24]。本研究表明,取食不同花椒品種對柑橘鳳蝶5齡幼蟲GSTs、P450、CarE等解毒酶的活性均無顯著影響。這與寄主對小線角木蠹蛾Streltzoviellainsularis幼蟲解毒酶的影響結果不一致,本文的結果為取食普通寄主(旱柳、欒樹、香椿、毛桃)的幼蟲3種解毒酶的平均活性均高于取食喜食寄主(洋白蠟、銀杏、國槐)的幼蟲[19]。原因可能是因為本研究所涉及的寄主植物均為花椒,只是品種的不同,不同花椒品種的防御昆蟲的過程相同,研究團隊后期將針對這一方面開展深入研究。但是,取食不同花椒品種的柑橘鳳蝶5齡幼蟲體內(nèi)消化酶(蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶)的酶活有顯著差異。

蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等消化酶的功能是將植物中的營養(yǎng)物質(zhì)分解為能被昆蟲吸收的小分子蛋白,這些酶類是評價寄主植物被昆蟲利用的狀況以及昆蟲和寄主植物之間的相互適應性重要參考[13,25]。因此,本研究結果可推測出柑橘鳳蝶對‘九葉青’具較好的適應性,蟲體內(nèi)消化酶可能是其對‘九葉青’有較好適應性的主要原因。類似研究表明,在取食營養(yǎng)成分含量高的寄主植物時,金銀花尺蠖Heterolochajinyinhuaphaga幼蟲通過提高自身消化酶活性分解大量的營養(yǎng)物質(zhì),以保證機體的快速生長[26]。小菜蛾Plutellaxylostella幼蟲取食適宜寄主植物體內(nèi)蛋白酶活性最高,取食適宜寄主植物體內(nèi)蛋白酶活性也處于較高水平,可能是幼蟲將蛋白質(zhì)水解為氨基酸,為機體提供氮源有關[27]。取食柳杉與柏木的云南松毛蟲Dendrolimushoui幼蟲體內(nèi)蛋白酶活性均處于較高水平,因此云南松毛蟲對柳杉和柏木具較好的適應性[28]。酶活力測定法比較了桑粉虱Bemisiamyricae6種寄主植物(桑樹、黃瓜、煙草、菜豆、馬鈴薯、番茄)田間種群的酶活結果為乙酰膽堿酯酶活力桑樹種群與其他種群相比差異顯著或極顯著,羧酸酯酶的活性桑樹粉虱種群與番茄種群相比差異顯著或極顯著,谷胱甘肽-S-轉移酶活性是桑樹種群最高,顯著高于其他植物粉虱種群[29];不同寄主植物對斜紋夜蛾Spodopteralitura初孵幼蟲的發(fā)育歷期、存活率、蛹重、繁殖率有較大差異,斜紋夜蛾對不同寄主植物表現(xiàn)出不同的喜好性[30]。對比蘿卜蚜Lipaphiserysimi在不同寄主上的適合度,結果表明蘿卜最適合蘿卜蚜生長發(fā)育和繁殖,甘藍不利于其繁殖[31]。

本研究表明柑橘鳳蝶幼蟲對‘九葉青’花椒品種有較好的適應性,體現(xiàn)在較大的體長和頭殼寬、較短發(fā)育歷期和5齡幼蟲較大的取食量,蟲體內(nèi)的消化酶(胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶)可能是其適應‘九葉青’的主要原因。這些研究結果可為評估‘九葉青’引種栽培后的抗柑橘鳳蝶的風險和防治提供參考。