基于指示劑置換法的肝素含量測定
——推薦一個(gè)分析化學(xué)綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)

張自品，趙祖志

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230012

2 安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，合肥 230032

分析化學(xué)是研究物質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)，確定物質(zhì)在不同狀態(tài)和演變過程中化學(xué)成分、含量、時(shí)空分布和相互作用的測量科學(xué)。分析化學(xué)是一門實(shí)踐性和應(yīng)用性很強(qiáng)的學(xué)科，實(shí)驗(yàn)教學(xué)在其課程教學(xué)中占有重要地位，是培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力的主要途徑。目前在分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中設(shè)置的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目主要是驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)可以培養(yǎng)學(xué)生熟練地掌握基礎(chǔ)知識(shí)、基本實(shí)驗(yàn)技能以及加深對(duì)基本理論的理解。但在長期的實(shí)踐教學(xué)過程中我們深刻地意識(shí)到，現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)教學(xué)對(duì)于培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立思考、解決實(shí)際問題能力，尤其是對(duì)于培養(yǎng)和訓(xùn)練學(xué)生的科研素質(zhì)和實(shí)踐創(chuàng)新能力是非常有限的。

2012年，教育部在《關(guān)于全面提高高等教育質(zhì)量的若干意見》中提出，“探索拔尖創(chuàng)新人才培養(yǎng)模式，促進(jìn)科研與教學(xué)活動(dòng)，及時(shí)把科研成果轉(zhuǎn)化為教學(xué)內(nèi)容”。近年來，隨著創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)發(fā)展戰(zhàn)略的逐步實(shí)施以及高等學(xué)校創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)教育的深化改革，高校正在全面提升創(chuàng)新能力，高等教育工作者也在實(shí)踐中不斷探索如何將高校的科研平臺(tái)優(yōu)勢轉(zhuǎn)化為教學(xué)優(yōu)勢，利用科研反哺教學(xué)從而促進(jìn)教學(xué)質(zhì)量的提高，也符合國家對(duì)創(chuàng)新人才培養(yǎng)的要求[1-3]。因此，如何探索科研反哺教學(xué)的新途徑、新思路，培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)素養(yǎng)與創(chuàng)新能力，是高校面臨的一個(gè)重要難題[4-6]。推進(jìn)教學(xué)與科研緊密結(jié)合，將先進(jìn)、前沿的科研成果轉(zhuǎn)化為適應(yīng)基礎(chǔ)教育的本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)資源，推動(dòng)教師把國際前沿學(xué)術(shù)進(jìn)展和最新研究成果融入實(shí)驗(yàn)課堂教學(xué)，是改革實(shí)驗(yàn)教學(xué)體系和培養(yǎng)學(xué)生實(shí)踐探索能力和創(chuàng)新能力的重要措施。因此在開設(shè)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)實(shí)際情況逐步開設(shè)基于科教融合的綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)，可以提高學(xué)生專業(yè)知識(shí)的綜合運(yùn)用能力、創(chuàng)新實(shí)踐能力、分析和解決問題的能力，并且有助于培養(yǎng)學(xué)生的基本科學(xué)素養(yǎng)與團(tuán)隊(duì)合作精神[7-9]。作者結(jié)合多年從事分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)的教學(xué)經(jīng)驗(yàn)，基于科研成果向教學(xué)實(shí)踐探索轉(zhuǎn)化的思路，對(duì)課題組科研成果進(jìn)行篩選和提煉，將基于指示劑置換(indicator displacement assay，IDA)的肝素的分析新方法轉(zhuǎn)化為本科生綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目[10]。

肝素是一種荷大量負(fù)電荷的線性聚合糖胺多糖(結(jié)構(gòu)式如圖1a所示)，自1935年起在臨床上被廣泛用作凝血相關(guān)疾病的預(yù)防和治療藥劑，尤其是用作手術(shù)中的抗凝血?jiǎng)11]。但長期和過量使用肝素會(huì)引起諸如出血、血小板減少等副作用，因此肝素的劑量需要嚴(yán)格的監(jiān)控[12-14]。臨床上用于肝素定量檢測傳統(tǒng)的方法是基于凝血原理和機(jī)制的方法，諸如活化凝血時(shí)間法(ACT)、活化部分凝血活酶時(shí)間法(aPTT)、和凝血酶原時(shí)間(pTT)等[15-17]。這些方法具有耗時(shí)、價(jià)格昂貴、間接檢測、數(shù)據(jù)不可靠等缺點(diǎn)。針對(duì)肝素傳統(tǒng)分析方法的缺點(diǎn)，分析化學(xué)工作者們基于肝素的化學(xué)性質(zhì)和特點(diǎn)設(shè)計(jì)合成了諸如主-客體復(fù)合物[18]、聚合物和多肽[19,20]、自組裝微納結(jié)構(gòu)[21]等，結(jié)合各種分析信號(hào)讀出機(jī)制，建立了肝素的比色、UV-Vis光譜、和熒光、電化學(xué)等分析新方法。然而，這些方法大多不可避免地需要精巧復(fù)雜、耗時(shí)繁瑣的合成步驟，因而開發(fā)低成本、簡單快速、靈敏準(zhǔn)確的肝素分析方法是十分必要的。

圖1 (a) 肝素、(b) MV2+和(c) pyranine的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

指示劑置換法(IDA)是一種基于分析物對(duì)指示劑進(jìn)行競爭取代，根據(jù)取代前后指示劑信號(hào)的變化對(duì)分析物進(jìn)行定量的分析方法。這種方法中，指示劑和受體分子可逆結(jié)合，由于分析物和受體的結(jié)合力大于指示劑和受體的結(jié)合力，因而在引入分析物的情況下，分析物會(huì)取代指示劑和受體結(jié)合從而引起指示劑信號(hào)的變化，因此利用指示劑信號(hào)的變化可以對(duì)分析物進(jìn)行定量分析。基于IDA的分析方法無需復(fù)雜合成工藝和步驟，具有成本低、操作簡單、指示劑選擇靈活多樣、靈敏準(zhǔn)確等優(yōu)勢，近年來已逐步應(yīng)用于分析和傳感領(lǐng)域[22]。作者課題組前期基于IDA的原理和技術(shù)，以甲基紫精(methyl viologen，MV2+，結(jié)構(gòu)式見圖1b)作為肝素受體，以8-羥基芘-1,3,6-三磺酸三鈉鹽(pyranine，結(jié)構(gòu)式見圖1c)作為光學(xué)指示劑，利用MV2+和肝素、pyranine之間結(jié)合的親和力不同，利用pyranine光譜信號(hào)(紫外-可見光譜吸收和熒光強(qiáng)度)的變化，實(shí)現(xiàn)了肝素的定量分析。本方法操作簡單、快速、結(jié)果可靠、成本低廉，適于血清、血漿以及肝素注射液中的肝素定量分析檢測[10]。

本文從分析化學(xué)的學(xué)科特點(diǎn)出發(fā)，基于科研與教學(xué)相互轉(zhuǎn)化、相互促進(jìn)、科研反哺教學(xué)的理念，以及科研成果向教學(xué)實(shí)踐探索轉(zhuǎn)化的思路，結(jié)合作者多年從事分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)課題組科研成果進(jìn)行篩選和提煉，將基于IDA策略和技術(shù)的肝素分析新方法轉(zhuǎn)化為本科生綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目。選取該研究成果的紫外-可見光譜法部分的內(nèi)容，將其設(shè)計(jì)成教學(xué)實(shí)驗(yàn)。其難度適中，內(nèi)容新穎，創(chuàng)新性和綜合性強(qiáng)，有利于培養(yǎng)學(xué)生的綜合素質(zhì)和實(shí)踐創(chuàng)新能能力。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

1) 鞏固紫外-可見分光光度法的理論知識(shí)，掌握紫外-可見光譜儀的基本操作。

2) 了解指示劑置換法的原理；理解基于pyranine-MV2+體系用紫外-可見光譜法測定肝素的原理和策略；理解分析原理和方法上的多樣性，了解分析化學(xué)新方法、新原理能夠?yàn)榻鉀Q實(shí)際問題提供技術(shù)支撐。

3) 掌握實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理技能，理解分析化學(xué)中分析方法的線性、檢測限、靈敏度等概念；

4) 提高學(xué)生綜合運(yùn)用知識(shí)能力、創(chuàng)新能力、實(shí)踐能力、獨(dú)立分析和解決問題的能力，以及培養(yǎng)學(xué)生的基本科學(xué)素養(yǎng)與團(tuán)隊(duì)合作精神。

2 實(shí)驗(yàn)原理

Pyranine是一種低毒、水溶性的有機(jī)光酸，在生理pH條件下荷負(fù)電，其結(jié)構(gòu)如圖1c所示。Pyranine通常被認(rèn)為是π電子給體，它在紫外-可見區(qū)具有較強(qiáng)的吸收，可以作為光學(xué)指示劑[23]。1,1-二甲基-4,4’-聯(lián)吡啶陽離子，又稱甲基紫精(MV2+)，其結(jié)構(gòu)式如圖1b所示，通常被認(rèn)為是π電子受體[24-26]。如圖2所示，pyranine和MV2+二者之間可以通過非共價(jià)作用結(jié)合生成pyranine-MV2+電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物(CT complex I)，該反應(yīng)可在生理?xiàng)l件下快速完成，無需苛刻反應(yīng)條件。正電荷的MV2+是肝素的有效受體，可以和肝素形成heparin-MV2+復(fù)合物(CT complex II)，并且MV2+和肝素結(jié)合的親和力大于和pyranine結(jié)合的親和力。因此，當(dāng)向pyranine-MV2+體系中加入肝素后，肝素會(huì)迅速置換出pyranine而和MV2+結(jié)合生成CT complex II，從而使pyranine從pyranine-MV2+復(fù)合物中游離出來。像這種基于指示劑pyranine和受體MV2+以及分析物肝素之間的競爭作用原理的分析技術(shù)被稱為指示劑置換法。

圖2 基于pyranine-MV2+體系的肝素指示劑置換法的原理示意圖

我們前期的研究結(jié)果表明，Pyranine酚羥基pKa約為7.14，在水溶液中存在酚羥基的酸堿解離平衡。Pyraine酸式體和堿式體在紫外-可見區(qū)的最大吸收波長分別在405 nm和455 nm，在生理pH條件下(pH 7.4)，游離的pyranine吸收光譜如圖3黑線所示。相同條件下，往pyranine溶液中加入MV2+后，pyranine在405 nm的特征吸收峰顯著降低，同時(shí)455 nm處的特征吸收紅移至468 nm處，該結(jié)果表明二者生成了pyranine-MV2+復(fù)合物。而加入肝素至pyranine-MV2+體系后，體系則會(huì)立刻恢復(fù)pyranine的特征吸收，如圖3藍(lán)線所示。這是由于肝素-MV2+的結(jié)合親和力大于pyranine-MV2+結(jié)合親和力，肝素置換出pyranine。因而本實(shí)驗(yàn)基于指示劑置換法的原理，以pyranine-MV2+溶液作為測試肝素的測試溶液，用溶液在405 nm處的吸光度對(duì)肝素進(jìn)行定量測定。

圖3 基于pyranine-MV2+體系的指示劑置換法進(jìn)行肝素定量分析的紫外-可見光譜驗(yàn)證和表征

3 實(shí)驗(yàn)部分

3.1 試劑與儀器

甲基紫精(MV2+，上海麥克林生化科技有限公司)，8-羥基芘-1,3,6-三磺酸鹽(pyranine)，肝素，葡萄糖、精氨酸、葡聚糖均購于阿拉丁試劑有限公司。牛血清白蛋白(BSA)，抗壞血酸(AA)，尿酸(UA)，三磷酸腺苷(ATP)，硫酸軟骨素(CHS)購置于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，透明質(zhì)酸購于上海源葉有限公司。25 mmol·L-1磷酸緩沖溶液(PBS)、25 mmol·L-1三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖溶液、25 mmol·L-14-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖溶液均由實(shí)驗(yàn)前新鮮配制并用0.1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 7.4。實(shí)驗(yàn)中所用試劑和藥品均至少為分析純。

紫外-可見光譜測試實(shí)驗(yàn)采用Specord 205紫外-可見分光光度計(jì)(德國耶拿分析儀器股份公司)并配以1 cm石英比色皿采集紫外-可見吸收光譜，光譜波長掃描范圍為330-650 nm。采用移液槍進(jìn)行測試樣品的配制和移取。

3.2 實(shí)際樣品處理

將成年雄性SD大鼠(200-250 g)隨機(jī)分為對(duì)照組(n= 3)和實(shí)驗(yàn)組(n= 3)，經(jīng)0.8%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(40 mg·kg-1，i.p.)后麻醉。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別腹腔注射0.9%生理鹽水(10 mL·kg-1)和肝素(5000 U·kg-1)。給藥30 min后，兩組大鼠從腹主動(dòng)脈取血，然后轉(zhuǎn)入含有所需量EDTA抗凝液的離心管中，3000 r·min-1離心15 min，所得血漿用于紫外-可見光譜測試。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物立即麻醉后斷頭處死。

3.3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)過程

3.3.1 實(shí)驗(yàn)原理和策略的紫外-可見光譜驗(yàn)證

以25 mmol·L-1HEPES緩沖溶液(pH 7.4)為空白溶液，在330-650 nm波長范圍內(nèi)，采集背景光譜，再以含10 μmol·L-1pyranine、10 μmol·L-1pyranine + 50 μmol·L-1MV2+、10 μmol·L-1pyranine + 50 μmol·L-1MV2++ 50 U·mL-1肝素的25 mmol·L-1HEPES緩沖溶液(pH 7.4)為測試溶液分別采集測試溶液的樣品光譜。引導(dǎo)學(xué)生以pyranine的紫外-可見光譜為依據(jù)，判斷加入MV2+后生成pyranine-MV2+復(fù)合物，以及加入肝素進(jìn)行指示劑置換后的紫外-可見光譜變化特點(diǎn)，從而理解指示劑置換法的原理和基于pranine-MV2+體系對(duì)肝素進(jìn)行紫外-可見測定的原理和策略。

3.3.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

(1) pyranine和MV2+濃度的選擇。

以25 mmol·L-1HEPES緩沖溶液(pH7.4)為空白溶液，在330-650 nm波長范圍內(nèi)，采集背景光譜。固定pyranine為10 μmol·L-1，分別考察pyranine : MV2+濃度比為1 : 1、1 : 2、1 : 5以及1 : 10時(shí)，pyanine-MV2+體系對(duì)0、1、2、5、10、以及20 U·mL-1肝素的響應(yīng)。并分別以不同濃度比的pyanine-MV2+在405 nm處的吸光度變化率ΔA/A對(duì)肝素的濃度作圖，進(jìn)行線性擬合，從而比較不同pyranine : MV2+濃度比條件下對(duì)肝素響應(yīng)信號(hào)的大小和響應(yīng)的靈敏度來篩選pyranine : MV2+最佳濃度比，并能解釋二者濃度比影響方法分析性能的原因。這里吸光度變化率ΔA/A，ΔA為pyarnine-MV2+溶液在加入肝素后和未加入肝素時(shí)在405 nm處的吸光度之差，A為pyarnine-MV2+溶液在未加入肝素時(shí)在405處的吸光度。

(2) 緩沖溶液的選擇。

緩沖溶液的和荷電性質(zhì)會(huì)影響負(fù)電荷肝素和正電荷的MV2+的相互作用，從而影響pyranine-MV2+體系對(duì)肝素的紫外-可見光譜響應(yīng)，因而本實(shí)驗(yàn)選用負(fù)電荷的PBS緩沖溶液、正電荷的Tris-HCl緩沖溶液，以及兩性緩沖溶液HEPES作為不同荷電性質(zhì)的緩沖溶液的典型代表，考察不同緩沖溶液對(duì)方法分析性能的影響。分別以25 mmol·L-1，pH為7.4的PBS、Tris-HCl、和HEPES緩沖溶液為空白溶液采集背景光譜。再固定pyranine為10 μmol·L-1，根據(jù)(1)所獲得的pyranine : MV2+的最佳濃度比，分別考察在不同緩沖溶液中，pyranine-MV2+對(duì)0、1、2、5、10、20 U·mL-1肝素的響應(yīng)。并分別以不同緩沖溶液下pyranine-MV2+在405 nm處的吸光度對(duì)肝素的濃度作圖，進(jìn)行線性擬合，從而比較不同緩沖溶液條件下對(duì)肝素響應(yīng)信號(hào)的大小和響應(yīng)的靈敏度來篩選最佳緩沖溶液。

3.3.3 方法學(xué)考察

1) 線性。

根據(jù)3.3.2篩選的實(shí)驗(yàn)條件，以25 mmol·L-1HEPES緩沖溶液(pH 7.4)為空白溶液采集背景光譜，以含有10 μmol·L-1pyranine和50 μmol·L-1MV2+的25 mmol·L-1HEPES緩沖溶液(pH 7.4)作為測試溶液，依次向測定溶液中加入一系列濃度的肝素，采集樣品光譜。以肝素濃度為橫坐標(biāo)，以溶液在405 nm波長處的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定該方法的線性范圍、建立線性方程。并理解分析方法的線性、靈敏度、檢測限概念。建議肝素濃度從0.1 U·mL-1開始逐漸增加到40 U·mL-1。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，為降低測試溶液的稀釋因子和減小實(shí)驗(yàn)誤差，要求滴加肝素溶液的體積不超過測試溶液體積的3%。因此實(shí)驗(yàn)前需綜合考慮肝素儲(chǔ)備液的濃度以及移液槍的最小刻度等因素。

2) 選擇性。

根據(jù)3.3.2篩選的實(shí)驗(yàn)條件，以25 mmol·L-1HEPES緩沖溶液(pH 7.4)為空白溶液采集背景光譜，以含有10 μmol·L-1pyranine和50 μmol·L-1MV2+的25 mmol·L-1HEPES緩沖溶液(pH 7.4)作為測試溶液采集樣品光譜后，再依次向測試溶液中加入1 mmol·L-1葡萄糖，50 μmol·L-1尿酸，50 μmol·L-1抗壞血酸、2 μmol·L-1多巴胺、2 μmol·L-15-羥色胺、0.1 mg·mL-1牛血清白蛋白、2 μmol·L-1精氨酸、10 μmol·L-1ATP、5 mg·mL-1透明質(zhì)酸、0.5 mg·mL-1硫酸軟骨素，分別采集樣品光譜。根據(jù)測定溶液在加入上述物質(zhì)后在405 nm處吸光度是否有明顯變化來確定這些物質(zhì)是否對(duì)測定產(chǎn)生干擾。理解用該方法測定生理樣品時(shí)，需要考察哪些代表性內(nèi)源性生理活性小分子和蛋白。思考并理解本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目中為何需要考察正電荷和負(fù)電荷的內(nèi)源性小分子以及肝素的結(jié)構(gòu)類似物。

3.3.4 實(shí)際樣品的測定

對(duì)照組和給藥組SD大鼠血漿均用25 mmol·L-1HEPES緩沖溶液(pH 7.4)稀釋10倍后作為待測樣品。在3.3.2篩選的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，以25 mmol·L-1HEPES緩沖溶液(pH 7.4)采集背景光譜，配制2 mL含10 μmol·L-1pyranine-50 μmol·L-1MV2+的25 mmol·L-1HEPES (pH 7.4)緩沖溶液作為測試溶液，采集樣品光譜，再依次向測試溶液中先后加入10 μL對(duì)照組和給藥組大鼠血漿，分別采集樣品光譜。分別測定加入血漿樣品后405 nm處吸光度。實(shí)際樣品平行測定3次，根據(jù)3.3.3方法學(xué)考察中(1)線性中的線性方程計(jì)算對(duì)照組和給藥組大鼠血漿中的肝素濃度值。注意，計(jì)算時(shí)不要忽略了稀釋倍數(shù)。

3.4 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果參考

根據(jù)我們前期的研究結(jié)果以及在小范圍推行的學(xué)生實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這里提供本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果以供執(zhí)行本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的老師和同學(xué)參考和借鑒。

1) Pyranine : MV2+最佳濃度比篩選結(jié)果。

固定pyranine濃度為10 μmol·L-1，考察不同pyranine : MV2+濃度比的條件下，以pyranine-MV2+體系在405 nm處吸光度對(duì)肝素在0.1-20 U·mL-1濃度范圍的響應(yīng)，參考結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，pyranine : MV2+濃度比在1 : 1-1 : 5之間時(shí)，隨著MV2+濃度的增加，pyranine-MV2+吸光度變化對(duì)肝素濃度響應(yīng)的線性的斜率逐漸增大，表明體系對(duì)肝素檢測的靈敏度逐漸增加。而當(dāng)MV2+濃度繼續(xù)增加時(shí)，即pyranine : MV2+濃度比小于1 : 5時(shí)，pyranine-MV2+體系對(duì)肝素檢測的靈敏度又開始逐漸下降。這是因?yàn)?，MV2+濃度增加，由于形成了pyranine-MV2+CT complex I，降低了pyranine在405 nm處的吸光度，因而降低檢測肝素使的背景吸光度(如圖3所示)。背景信號(hào)的降低有利于提高靈敏度。當(dāng)MV2+濃度太大時(shí)，又會(huì)增加肝素置換pyranine的難度，因而方法的靈敏度會(huì)下降。因此，推薦pyranine : MV2+為1 : 5為實(shí)驗(yàn)的最佳濃度比。

圖4 不同pyranine : MV2+濃度比條件下，pyranine-MV2+體系在405 nm處的吸光度變化率對(duì)不同肝素濃度的響應(yīng)

2) 緩沖溶液的選擇。

分別以含10 μmol·L-1pyranine + 50 μmol·L-1MV2+的濃度為25 mmol·L-1pH為7.4的PBS、Tris-HCl和HEPES緩沖溶液作為測試溶液測定其對(duì)0、1、2、5、10、以及20 U·mL-1肝素的響應(yīng)，參考結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明在在HEPES緩沖溶液，體系對(duì)肝素的響應(yīng)最靈敏，其線性的斜率0.0052 mL·U-1，而PBS和Tris-HCl條件下的斜率分別為0.0018和0.0033 mL·U-1。因此，推薦25 mmol·L-1pH 7.4的HEPES作為肝素測定的最佳緩沖。

圖5 不同緩沖溶液中pyranine-MV2+體系在405 nm處的吸光度變化率對(duì)不同肝素濃度的響應(yīng)

4 教學(xué)安排與組織的建議

本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)在于讓學(xué)生理解指示劑置換法測定陰離子的作用機(jī)制以及紫外-可見分光光度法定量分析的基本原理和方法；掌握對(duì)肝素進(jìn)行定量分析的方法，以及學(xué)會(huì)對(duì)分析方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)講義并沒有詳細(xì)的步驟，如何引導(dǎo)學(xué)生分工合作、自行設(shè)計(jì)方案驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法的可行性、合理安排和利用課堂實(shí)驗(yàn)時(shí)間、探索最佳條件，以及讓學(xué)生掌握本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理的方法與步驟，是指導(dǎo)教師指導(dǎo)該實(shí)驗(yàn)的核心內(nèi)容。

建議在完成分析化學(xué)課程中化學(xué)分析和儀器分析理論課程以及相關(guān)實(shí)驗(yàn)課程之后開設(shè)，或面向化學(xué)、藥學(xué)相關(guān)專業(yè)高年級(jí)本科生開設(shè)?？砂才?-10學(xué)時(shí)，分2-3次實(shí)驗(yàn)課完成。前4-6個(gè)學(xué)時(shí)主要任務(wù)和目的是實(shí)驗(yàn)原理的驗(yàn)證以及實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，后4個(gè)學(xué)時(shí)安排本方法的方法學(xué)考察以及實(shí)際樣品的測定。實(shí)驗(yàn)課前布置檢索和閱讀本實(shí)驗(yàn)相關(guān)的國內(nèi)外文獻(xiàn)的任務(wù)，并于實(shí)驗(yàn)開始前安排部分學(xué)生參與實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備，包括緩沖溶液的配制，pyranine、MV2+以及肝素儲(chǔ)備液的配制。

此外，關(guān)于實(shí)際樣品的測試，若具備條件，可以根據(jù)本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容推薦，將SD大鼠分為對(duì)照組和給藥組，腹主動(dòng)脈取血，血漿可以在實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備好，冰箱冷藏備用。對(duì)于不具備動(dòng)物實(shí)驗(yàn)條件的學(xué)校或?qū)嶒?yàn)室，實(shí)際樣品測定可以測定肝素鈉注射液或肝素鈉軟膏中肝素含量。

需要注意的是，本實(shí)驗(yàn)中使用的甲基紫精是有毒藥品，實(shí)驗(yàn)前須讓學(xué)生充分了解MV2+的規(guī)范和安全使用，實(shí)驗(yàn)時(shí)須做好自身安全防護(hù)，需要帶護(hù)目鏡、乳膠手套或PE手套，按實(shí)驗(yàn)室規(guī)范著裝并穿實(shí)驗(yàn)服。

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)束后，撰寫小論文形式的實(shí)驗(yàn)報(bào)告，并以小組為單位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果PPT匯報(bào)和答辯，以培養(yǎng)學(xué)生的科技論文寫作能力和綜合表達(dá)能力。

5 結(jié)語

綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)可以激發(fā)學(xué)生的求知欲和創(chuàng)新意識(shí)，在實(shí)驗(yàn)任務(wù)和目標(biāo)的執(zhí)行過程中可集中調(diào)動(dòng)學(xué)生的認(rèn)知基礎(chǔ)與實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，在培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)分析能力的同時(shí)，充分鍛煉思維的應(yīng)變能力、整合能力和創(chuàng)新能力，促進(jìn)學(xué)生的創(chuàng)造力，提高學(xué)生的科學(xué)素養(yǎng)和綜合素質(zhì)。目前本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目在我校藥學(xué)相關(guān)專業(yè)篩選報(bào)名的20名本科生中，作為分析化學(xué)綜合性研究性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目首次開設(shè)，實(shí)驗(yàn)包括實(shí)驗(yàn)原理的驗(yàn)證、實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化、定量檢測及實(shí)際樣品的分析，實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果良好。擬逐年優(yōu)化，有計(jì)劃有步驟地面向我校藥學(xué)各專業(yè)本科生作為分析化學(xué)綜合性設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目開設(shè)。該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目既保證了實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的前沿性與創(chuàng)新性，又無需昂貴的大型分析設(shè)備，無需復(fù)雜耗時(shí)的合成步驟，實(shí)驗(yàn)操作簡便，是一項(xiàng)可以推廣的分析化學(xué)類綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目可作為醫(yī)藥院校藥學(xué)相關(guān)專業(yè)、綜合類和師范類院?；瘜W(xué)相關(guān)專業(yè)高年級(jí)本科生的分析化學(xué)、儀器分析綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)。