治療COVID-19的小分子藥物研究進展

袁博，馮辰昀，袁耀鋒

1 福州大學化學學院，福州 350108

2 國家藥品監(jiān)督管理局南方醫(yī)藥經濟研究所，廣州 510080

3 南方科技大學化學系，廣東 深圳 518055

1 簡介

自從2019年新冠肺炎(COVID-19)疫情全球大流行以來，已經給人類社會造成了不可估量的損失。COVID-19患者可見發(fā)燒、咳嗽、嘔吐、疲勞等癥狀，重癥患者可能會出現呼吸衰竭、休克[1,2]。截至2022年11月13日，全球已報告超過6.32億例確診病例和超過650萬例死亡病例[3]。

COVID-19疫情是全球范圍內的復雜衛(wèi)生事件，需要科學家、公共衛(wèi)生專家、醫(yī)學專家和社會工作者的共同努力來終結這一事件。在科學層面，需要解決以下兩個主要問題：一是如何阻斷SARSCoV-2在人群中的傳播；二是如何有效地治療COVID-19患者。化學研究方法和工具是解決這兩個問題的重要手段。

SARS-CoV-2疫苗從一定程度上遏制了SARS-CoV-2在人群的傳播，可以預防新冠感染，降低新冠肺炎患者的重癥率和死亡率[4-6]。mRNA疫苗技術是人類首次大規(guī)模使用的新技術，mRNA疫苗研發(fā)周期更短，可以快速量產，在應對突發(fā)公共安全事件中具有一定優(yōu)勢，但同時面臨著mRNA分子的穩(wěn)定性和遞送效率低等技術困難，化學工具是解決此類技術問題的關鍵：研發(fā)人員通過對mRNA分子的修飾提高mRNA分子的穩(wěn)定性，例如對mRNA分子的5’帽子結構進行化學修飾、插入人工合成核苷酸；通過開發(fā)和優(yōu)化高效的納米粒遞送系統(tǒng)，進一步提高mRNA的遞送效率和靶向能力[7]。

小分子藥物主要指化學合成藥物，在救治COVID-19患者中起著重要作用，具有給藥方便、有利于大規(guī)模生產以及不容易激發(fā)免疫反應等優(yōu)勢(同大分子藥物相比)。截至2022年9月，在FDA批準的抗病毒藥物清單中，總共有118種療法，其中包含了103種小分子化學藥物。FDA公布的緊急使用授權(EUA)藥物名單中共有8個抗病毒藥物，其中包含了2種小分子化學藥物[8-10]。在美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)發(fā)布的The Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) Treatment Guidelines 與國家衛(wèi)生健康委發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第九版)》中，對一些中度、重度患者的救治方案中采用小分子化學藥物作為治療方案，其中也包括帕克洛維德(PaxlovidTM)等藥物(表1)。

表1 部分COVID-19治療相關的小分子藥物

治療COVID-19患者的小分子藥物主要包括抑制SARS-CoV-2病毒和控制人體細胞因子風暴等兩類藥物。其中抑制SARS-CoV-2小分子藥物的靶點以RdRp和Mpro為主。SARS-CoV-2是一種正鏈RNA病毒，它的基因組大小約為30 kb，有14個編碼開放閱讀框(ORF)。其中5’-ORF-1a/1b占SARS-CoV-2基因組的67%，5’-ORF(ORF1a/b)編碼形成16種非結構蛋白(nsp1-16) (圖1)[11]。這些非結構蛋白構成病毒生命周期所需的多種重要的酶，其中就包括了RdRp和Mpro。研究人員通過開發(fā)對RdRp或Mpro產生作用的化合物，抑制SARS-CoV-2的復制。目前已經上市的COVID-19治療藥物中以RdRp為靶點小分子藥物有阿茲夫定(Azvudine)、莫匹拉韋(Molnupiravir)、瑞德西韋(Remdesivir)，以Mpro為靶點的小分子藥物有PaxlovidTM。

圖1 SARS-CoV-2的基因組圖

在臨床應用中，控制SARS-CoV-2引起人體的細胞因子風暴有助于降低重癥患者的死亡率，因此在治療COVID-19的臨床指南中，也包括部分細胞因子抑制藥物用以輔助治療，具有代表性的就有地塞米松(Dexamethasone)、巴瑞克替尼(Baricitinib)[12](表1)。

鑒于一個全新的小分子藥物研發(fā)上市需要大約10年左右，為了加速藥物的研發(fā)的過程，以上藥物主要采取了“老藥新用”的研發(fā)策略，通過增加已上市藥物的適應癥來縮短藥物研發(fā)周期。例如，瑞德西韋在COVID-19爆發(fā)前已獲批上市，是埃博拉病毒、尼帕病毒、呼吸道合胞病毒等多種病毒的廣譜性藥物。疫情爆發(fā)后，該藥通過增加治療新冠肺炎的適應癥而獲批用于COVID-19的治療[13]。

2 以RdRp為靶點的小分子藥物

RdRp是RNA依賴性RNA聚合酶(The RNA-dependent RNA polymerase)的簡稱，也被稱為NSP12，需要在NSP7和NSP8的協同激活下才能具有聚合酶活性[14]，因此NSP12-NSP7-NSP8被定義為SARSCoV-2中RNA復制的最小核心單位，SARS-CoV與SARS-CoV-2的NSP12在活性位點的結構上高度相似，有助于指導藥物設計[15]。另外由于哺乳動物細胞體內不存在RdRp的對應物，以RdRp為靶點的藥物對哺乳動物細胞的影響較小，因此RdRp是一個優(yōu)異的RNA病毒藥物靶點。

2.1 Azvudine

Azvudine (2’-deoxy-2’-β-fluoro-4’-azidocytidine) (FNC)是中國本土研發(fā)并成功上市的首款SARSCoV-2小分子藥物，也是中國首個以輔助蛋白Vif與逆轉錄酶為雙靶點的抗艾滋病毒(HIV)藥物。Azvudine治療COVID-19的靶點為RdRp，是在抗HIV藥物的基礎上增加治療COVID-19適應癥的方式在中國上市。在該公司在III期臨床試驗中，40%的COVID-19患者在接受Azvudine治療一周后表現出臨床癥狀改善，而接受安慰劑的患者中這一比例僅為11%[16]。

Azvudine屬于前藥，不直接抑制病毒復制，它在細胞中進行三磷酸化產生FNC三磷酸，繼而產生對丙肝病毒(HCV)、腸道病毒71型(EV71)、SARS-CoV-2等病毒的廣譜抑制活性。FNC三磷酸已在細胞培養(yǎng)和動物模型中被證明可有效抑制SARS-CoV-2，該結論通過FNC的單磷酸類似物進行驗證，其中Vero E6細胞中抑制SARS-CoV-2的半數有效濃度(EC50)為4.3 μmol·L-1，半數細胞毒性濃度(CC50)是66.15 μmol·L-1(qRT-PCR，48h)，Calu-3細胞中抑制SARS-CoV-2的EC50為1.2 μmol·L-1，CC50＞ 102.4 μmol·L-1(qRT-PCR，48h)[17]。Azvudine通過與RdRp靶點結合，抑制病毒RNA的合成，阻斷病毒復制。以抑制SARS-CoV-2病毒復制為例，Azvudine的三磷酸化產物作為底物與SARS-CoV-2的RdRp結合，導致病毒RNA鏈合成終止，產生并無功能的病毒基因組RNA，進而阻斷病毒復制(圖2)[18,19]。

圖2 Azvudine的抗病毒原理[16]

Azvudine是核苷類似物，在其藥物設計中，Azvudine核苷母核4’-取代基的引入提高了酶和酸的穩(wěn)定性，并使核苷更親脂性，從而提高了細胞滲透性和生物利用度。另外Azvudine核苷母核4’-疊氮基團通過空間效應穩(wěn)定了3’-C-endo的構象，并與核苷母核3’-OH基團形成分子內氫鍵，從而降低了3’-OH的親核性，改善了其生物活性。在一項Azvudine治療HIV感染的臨床試驗中(NCT04109183)，共有172名受試者參與該試驗，Azvudine沒有顯示出嚴重的不良反應，表現出理想的藥代動力學，并達到了療效終點[19]。相較于Remdesivir，Azvudine的患者依從性較好，由于具有良好的生物利用度，Azvudine可口服給藥，且給藥劑量每天不超過5 mg，但Remdesivir口服生物利用度較低，必須注射給藥，且首日給藥劑量為200 mg，次日給藥劑量為100 mg。

在一組臨床試驗(ChiCTR2000029853)中，研究人員招募了20名COVID-19患者，通過隨機分配開展Azvudine的臨床試驗，其中包括對照組和給藥組(FNC組)，FNC組治療4天后的核酸轉陰率為100%，而對照組轉陰率僅為30%；FNC組治療6天后核酸轉陰率為100%，對照組轉陰率為40%；兩組對照均存在顯著差異(p= 0.0013和p= 0.0011) 。FNC組的首次核酸陰性轉換時間比對照組更低，對比之前輕、中COVID-19患者的氯喹治療研究，結果也較顯著[20-22]。總體上，Azvudine是一種安全、有效、治療依從性好的抑制SARS-CoV-2藥物。

2.2 Molnupiravir

由默克公司(Merck)研發(fā)的Molnupiravir (MK-4482，又稱EIDD-2801)是一種口服核糖苷類似物，對流感、SARS、埃博拉等RNA病毒具有良好的抑制活性，其COVID-19適應癥于2022年8月5日獲得FDA緊急使用授權(EUA)。Molupiravir在體內被吸收之后被血漿脂酶轉化為核糖核苷類似物β-d-N4-羥基胞苷(NHC或EIDD-1931)，隨后，NHC會被宿主細胞激酶磷酸化，形成NHC5’-三磷酸(NHC-TP)，SARS-Cov-2病毒的RdRp把NHC-TP當做的底物，替代三磷酸尿嘧啶核苷酸或者三磷酸胞嘧啶核苷酸[23](圖3)。因此當RdRp使用正鏈基因組RNA (+gRNA)作為模板合成負鏈基因組(-gRNA)會結合NHC-TP，形成具有問題的-gRNA[24]，導致正鏈RNA產物的突變，影響病毒的復制(圖3)。

圖3 Molnupiravir對SRAS-CoV-2的作用原理

在一項隨機、雙盲、安慰劑對照研究中(NCT04392219)，Molupiravir具有良好的耐藥性，且吸收良好。當在50-1600 mg劑量之間給藥時，其母體核糖核苷類似物EIDD-1931在血漿表現出線性的并與劑量成正比的藥代動力學特征。研究顯示50-800 mg每天兩次給藥5.5天和單次劑量高達1600 mg的范圍是安全且耐受性良好的。雖然單次遞增給藥與多次遞增給藥后，患者會發(fā)生頭痛與腹瀉，但Molnpiravir組在頭疼比例上小于安慰劑組(12.5%vs. 18.8%)，在腹瀉比例上Monpiravir組與安慰劑組持平(7.1%)。只有一例患者因為皮疹而停止給藥，沒有患者出現嚴重不良現象[25]。

在隨后的II期、雙盲、隨機、安慰劑對照組實驗中(NCT04405570，n= 202)證明，通過Molnupiravir治療可以降低COVID-19患者的核酸轉陰時間。在接受800 mg Molnupiravir的受試者中，92.5%的受試者在研究結束時(4周)實現了病毒RNA清除，而安慰劑受試者的這一比例為80.3%。在不良反應中，200-800 mg的治療組與安慰劑對照組不良反應率相似，且Molnupiravir僅發(fā)生輕度不良反應。該研究II期臨床試驗的安全性分析與I期相似[26]。

在一項有1433人參加的III期、雙盲、隨機、安慰劑對照試驗中(NCT04575597)，研究人員發(fā)現，在COVID-19發(fā)病的早期/中期通過接受Molnupiravir治療可以降低患者的住院、死亡率。經過29天治療，有7.3%接受了Molnupiravir治療后住院、死亡，但是安慰劑對照組為14.1%。盡管Molnupiravir組和安慰劑組在不良反應發(fā)生率相似(Molnupiravir組為30.4%，安慰劑組33.0%)，但是發(fā)生不良反應導致死亡的比例中Molnupiravir組小于安慰劑組(0.3%vs. 1.7%)。研究人員認為發(fā)生不良反應與實驗方案設計無關[27]。

基于上述的研究，研究人員認為Molnupiravir適合應用于輕、中癥狀的COVID-19的患者治療。

2.3 Remdesivir

Remdesivir (RDV，GS-5734)是一種1’-氰基取代的腺苷核苷酸類似物前藥，最初的研發(fā)目的是利用抑制RNA合成的機制來治療埃博拉病毒感染。它在體內首先單磷酸化(RDV-MP，GS-441524-MP)，隨后在通過激酶進一步轉化為三磷代謝物的形式(RDV-TP) (圖4) 。RDV-TP與三磷酸腺苷的結構非常相似，它可以參與病毒的RNA復制過程，并結合在RNA鏈的i位置，這個過程會導致RNA鏈在i+ 3位置停止合成。體外實驗中Remdesivir已經顯示出抗病毒活性，Remdesivir在原代人呼吸道上皮細胞(HAE)中針對SARS-CoV的半數抑制濃度(IC50)為0.069 μmol·L-1，針對MERS-CoV的IC50為0.074 μmol·L-1；在SARS-CoV-2有關的研究中，Remdesivir在Vero E6細胞中也具有一定的抗病毒活性(EC500.77 μmol·L-1)。

圖4 Remdesivir在體內的轉化模型

Remdesivir治療COVID-19的臨床療效目前仍存在爭議。2020年10月吉利德科學發(fā)布了關于Remdesivir的最終報告(NCT04280705)，共有1062人進行了隨機分組，報告顯示運用Remdesivir進行治療可以減少患者的中位數治療持續(xù)時間(10天vs.15天，均95%置信區(qū)間)。Remdesivir治療組相比于安慰劑組更有可能在15天時出現臨床改善。Kaplan-Meier曲線中Remdesivir組的死亡率為6.7%，而安慰劑組為11.9%，而在29天時Remdesivir組死亡率為11.4%，而安慰劑組為15.2%[28]。另一項由法國國立衛(wèi)生研究院主導的研究(NCT04315948)顯示，Remdesivir對住院患者的死亡率與治療三個月患者的死亡率沒有顯著的影響[29]。這類結果只能證明Remdesivir可以幫助患者在臨床意義上改善COVID-19病情，但是在中、重度患者的療效不確切。

美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)在The Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) Treatment Guidelines中只對高危、非住院患中推薦使用Remdesivir。在中國衛(wèi)健委發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第九版)》中，Remdesivir未在抗病毒藥物名錄中。

3 PaxlovidTM：以Mpro為靶點的抗SARS-CoV-2小分子藥物

SARS-CoV-2的Mpro是一種33.8 kDa的蛋白質，主要負責病毒多蛋白的蛋白水解切割。在切割蛋白前對蛋白酶加以靶向抑制，可進一步影響成熟病毒的組裝，因此該蛋白酶通常會被視為一種潛在、有效的靶點[30]。SARS-CoV-2 Mpro抑制劑一般通過共價/非共價鍵形式，使得分子與蛋白酶相互作用，進而抑制SARS-CoV-2的Mpro活性。PaxlovidTM被認為是較具治療潛力的此類藥物，該藥由輝瑞公司研制，已獲得FDA的緊急使用授權(EUA)，適用于輕度、中度COVID-19患者的治療。在我國，PaxlovidTM也獲得附條件批準進口上市，并被寫入《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第九版)》，作為抗病毒臨床推薦藥物。

PaxlovidTM由Nirmatrelvi和Ritonavir兩種化合物組成，是一種典型的復方藥物。Nirmatrelvi是一種以Mpro為靶點的新型蛋白酶抑制劑，通過抑制Mpro來阻斷SARS-CoV-2復制。Ritonavir則是一種細胞色素P450 3A4抑制劑，不直接參與抑制SARS-CoV-2，但可以通過降低Nirmatrelvi代謝并增加其血清濃度，提升Nirmatrelvi的抗病毒效果。

2022年2月，由輝瑞公司提交的一項PaxlovidTM的II/III期隨機、雙盲、安慰劑對照臨床試驗報告(NCT04960202)中顯示，PaxlovidTM可以降低輕型、中型COVID-19患者的病情惡化率。共有2246名患者接受了隨機分組；1120名患者在PaxlovidTM組，1126名患在安慰劑組。接受治療第28天，PaxlovidTM組患者的COVID-19相關住院或死亡發(fā)生率均遠低于安慰劑組；其中PaxlovidTM組的COVID-19發(fā)病率為0.77%，而安慰劑組的發(fā)病率為7.01%。在治療的第5天，患者體內PaxlovidTM的病毒載量低于安慰劑組。兩組在治療期間出現的不良事件發(fā)生率相似(22.6%vs. 23.9%)；但是PaxlovidTM組的總體患者的不良反應的嚴重程度小于安慰劑組，嚴重不良事件分別為1.6%和6.6%。PaxlovidTM組比安慰劑組更頻繁地發(fā)生味覺障礙(5.6%vs. 0.3%)和腹瀉(3.1%vs. 1.6%)[30]。

另一款與Paxlovid類似的藥物是洛匹那韋-利托那韋(Lopinavir-Ritonavir)。洛匹那韋(Lopinavir)是一種肽模擬藥物，主要用于HIV-1的治療。在體外實驗中，Lopinavir-Ritonavir被證明可以降低SARSCoV-2病毒滴度，研究者推測，這可能與抑制Mpro活性有關，學界對此存在爭議，有研究表明這種情況的出現似乎與Ritonavir有關[31,32]。在SARS-CoV-2的相關研究中，也暫時沒有研究可以證明Lopinavir在臨床上有效，與之相關的研究仍在進行中。

4 免疫治療藥物

4.1 Dexamethasone

Dexamethasone ((11β,16α)-9-Fluoro-11,17,21-trihydroxy-16-methylpregna-1,4-diene-3,20-dione)是一種皮質類固醇免疫抑制劑。早在20世紀70年代，世界衛(wèi)生組織(WHO)就已經將Dexamethasone列入WHO的基本藥物的使用清單中[33]。目前Dexamethasone主要被應用于各種炎癥和過敏性疾病、皮膚病的診治中，例如：系統(tǒng)性狼瘡、類風濕性關節(jié)炎、過敏性鼻炎、支氣管哮喘、接觸性和特應性皮炎等[34]。

控制COVID-19患者體內的細胞因子水平是救治中度、重度患者并降低患者死亡率的關鍵。在SARS-CoV-2的刺突蛋白作為受體與血管緊張素轉化酶2 (AEC2)大量結合后，會促發(fā)系列復雜因子的表達，最終導致肺部的過度炎癥與細胞因子風暴。如果不加以控制，患者的病情會繼續(xù)惡化，后出現彌漫性肺損傷、呼吸衰竭甚至死亡[35]。因此除了抑制SARS-CoV-2的復制之外，控制COVID-19患者體內的細胞因子水平也顯得十分重要[36]。

Dexamethasone對炎癥反應過程有抑制作用，在胸腺細胞中與糖皮質激素受體的結合，通過一系列信號通路誘導了caspase-8/caspase-3的活化，促使細胞凋亡，抑制免疫反應[35]。同時Dexamethasone還可以通過CD28通路抑制成熟T細胞的增殖，可有助于降低人體內細胞因子的表達[37]。

有研究指出，Dexamethasone可以將使用呼吸機的COVID-19患者死亡率降低1/3[34]。在一些抗病毒藥物的試驗中，Dexamethasone也作為了一種重要/輔助治療手段。例如在登記為NCT04425863研究中，研究人員在研究伊維菌素(Ivermectin)的藥效時，搭配的輔助藥物就是Dexamethasone。在另一項關于Dexamethasone輔助治療的試驗(NCT04381936)也顯示Dexamethasone可以降低患者死亡率。一項早期研究中，在隨機分配的基礎上，2104名患者在接受Dexamethasone額外治療后28天后死亡率為22.9%，而擁有4321名患者的常規(guī)治療組死亡率為25.7%；但是如若對比兩組中需要呼吸通氣的患者的存活/死亡數據則有很大差距(29.3%vs. 49.2%)[38]。

但是Dexamethasone的使用有可能增加動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病和骨質疏松癥等疾病的風險；在一項動物試驗中，研究人員也發(fā)現Dexamethasone的使用會導致大鼠體重上升、高血糖與骨質疏松[39]，因此在非重癥患者的體內，不建議使用Dexamethasone進行輔助治療。

4.2 Baricitinib

Baricitinib (INCB28050)是一種可逆的Janus相關激酶(JAK)抑制劑，廣泛被運用于治療中度、重度的類風濕性關節(jié)炎(RA)[40]。它對AP2相關激素酶(AKK-1)具有很強的親和性，對細胞周期蛋白G激素酶(GAK)具有一定的親和性，因此可以阻斷病毒進入細胞與病毒在細胞內部的運輸。同時Baricitinib可以選擇性地抑制JAK1/JAK2酶、靶向細胞因子和刺激生長因子的受體活性，并會中斷一部分這類細胞因子通路，進而導致IL-6、IL-2、IL-10、INF-γ在內的眾多細胞因子水平下降，因此可用于救助中、重度COVID-19患者[41]。

Baricitinib于2022年5月獲得FDA的緊急使用授權(EUA)，向需要補氧/有創(chuàng)機械通氣/ECMO、年齡≥ 2歲的住院COVID-19成人和兒科患者提供治療。目前的臨床數據顯示，在接受Baricitinib治療的COVID-19患者會出現炎癥標志物的減少與氧合改善[42]。在一項大型、雙盲、隨機安慰劑實驗中(NCT04401579)，研究發(fā)現，接受Baricitinib與Remdesivir聯合治療的患者相比于單獨接受Remdesivir治療中位恢復時間更低(7天vs.8天)、第15天的臨床改善現象提高30%；在接受高流量氧氣、無創(chuàng)通氣的患者中，接受Baricitinib的輔助治療效果也更明顯[43]。Baricitinib在臨床應用中與Dexamethasone相似，有研究(EUPAS34966)指出在中、重度患者的救治中，聯合使用Baricitinib與類固醇藥物具有更好的療效，肺功能在出院后可以得到更大的改善[44]。但是對于無癥狀、輕癥狀(非住院)患者，目前尚無臨床數據表明Baricitinib療法是有效、安全的[45]。

5 結語

現有研究顯示，小分子藥物在救治COVID-19患者中起到了重要作用，是抑制SARS-CoV-2復制、阻斷COVID-19患者細胞因子風暴的重要治療方法。藥物再利用是這類藥物發(fā)現的主要策略，研究人員利用與SARS-CoV-2序列同源性高、酶結構保守的SARS-CoV和MERS-CoV的前期研究成果，成功開發(fā)數個抑制SARS-CoV-2的小分子化學藥物，縮短了研發(fā)周期，有利于較快應對突發(fā)公共衛(wèi)生事件。

在抑制SARS-CoV-2復制的藥物中，除了Mpro和RdRp兩個已上市藥物靶點外，木瓜樣蛋白酶(PLpro)也被認為是相關藥物設計的關鍵靶點，在病毒復制以及干擾宿主的免疫應答等多種功能中發(fā)揮作用，是未來研究的趨勢之一[46]。相關候選藥物中，研究者已經報導了GRL0617及其幾個類似物對SARS-CoV-2表現出一定的抑制作用[47]。

除了常規(guī)的藥物設計和篩選模式，人工智能在輔助開發(fā)COVID-19小分子化學藥物也具有一定應用前景。2020年2月，Richardson P.等報導了通過人工智能技術從現有文獻中篩選出已上市藥物Baricitinib是潛在治療新冠肺炎的藥物，該技術利用藥物信息知識圖譜篩選出6種AAK1抑制劑，并最終建議Baricitinib在COVID-19患者中開展臨床試驗的候選藥物[48]。

總體上，通過干預病毒生命周期主要環(huán)節(jié)的靶向藥物設計的策略，利用藥物虛擬篩選并結合人工智能技術輔助藥物篩選，有利于尋找有效抑制SARS-CoV-2的候選化合物，可能成為這類小分子藥物研發(fā)的趨勢之一。