生物成像用二氧雜環(huán)丁烷余輝發(fā)光體系的研究進展

呂程遠(yuǎn)，張函，楊明旺，杜健軍，樊江莉，2

（1 大連理工大學(xué)智能材料化工前沿科學(xué)中心，精細(xì)化工國家重點實驗室，遼寧 大連 116024；2 大連理工大學(xué)寧波研究院，浙江 寧波 315016）

光學(xué)成像具有實時性、無創(chuàng)性和高時空分辨率等優(yōu)勢，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用[1-3]。作為光學(xué)成像方式的一種，余輝發(fā)光成像不依賴于外界給予的實時激發(fā)光，能夠?qū)崿F(xiàn)激發(fā)光照射和信號采集過程的分離[4]，因此余輝發(fā)光成像能有效地減少生物組織自體熒光的干擾，是改良成像質(zhì)量，提高成像信噪比和靈敏度的重要手段[5]。開發(fā)生物成像用有機長余輝材料逐漸受到人們的關(guān)注。

目前已開發(fā)出的余輝試劑包括無機余輝材料[6-7]、有機長時間室溫磷光和熱激活延遲熒光材料[8-9]等。然而，上述試劑仍然存在一些不足之處，無機余輝材料，特別是包含稀土金屬元素的無機納米粒子，存在潛在的生物毒性和生物代謝等問題[10]，影響了其生物相容性；而有機長時間室溫磷光等易被生物體內(nèi)富水含氧環(huán)境猝滅，提升了體系構(gòu)建難度[9,11]。近年來，基于二氧雜環(huán)丁烷中間體的有機長余輝材料成為研究熱點。該余輝發(fā)光過程涉及光化學(xué)級聯(lián)反應(yīng)，其關(guān)鍵步驟在于二氧雜環(huán)丁烷中間體的生成并通過化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生電子激發(fā)態(tài)的物質(zhì)，最終由之發(fā)出光子輻射[12]。此類余輝發(fā)光體系具有較好的生物相容性、可分解性，并且擁有廣泛的修飾位點，能夠?qū)崿F(xiàn)多功能生物成像的需求，是生物應(yīng)用的首選[13]。本文主要就此類光化學(xué)反應(yīng)介導(dǎo)的二氧雜環(huán)丁烷余輝體系發(fā)光機理、體系的構(gòu)建和近期在生物成像領(lǐng)域的研究進展進行論述，并對未來發(fā)展方向進行展望。

1 二氧雜環(huán)丁烷型余輝發(fā)光機理

從能量的角度來看，余輝發(fā)光體系可以儲存激發(fā)光的能量，并且在移除激發(fā)光后一段時間內(nèi)，可以通過光子輻射的方式將能量緩慢地釋放出來。不同余輝發(fā)光體系儲存能量的方式也不盡相同。無機余輝發(fā)光材料依賴于入射光子導(dǎo)致材料中電子-空穴對的產(chǎn)生[5,7,14]，有機長時間室溫磷光材料和熱激活延遲熒光材料則依賴于三重激發(fā)態(tài)分子的產(chǎn)生與利用[15-17]。

二氧雜環(huán)丁烷余輝發(fā)光體系，是近年來新興的一類有機余輝發(fā)光的范式[12-13]。不同于以往的余輝發(fā)光體系，在二氧雜環(huán)丁烷余輝發(fā)光過程中，涉及一個光化學(xué)級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生二氧雜環(huán)丁烷中間體；隨后該中間體通過化學(xué)分解產(chǎn)生一部分處于電子激發(fā)態(tài)的分子，激發(fā)態(tài)分子通過光子輻射的方式釋放能量，產(chǎn)生余輝發(fā)光。具體過程如下。

1.1 余輝發(fā)光的引發(fā)

單線態(tài)氧（1O2）對富電子烯烴或雜環(huán)之間發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)（圖1）是二氧雜環(huán)丁烷產(chǎn)生的主要途徑[18]。其中，單線態(tài)氧由光敏劑經(jīng)光照后敏化氧氣產(chǎn)生。由于氧氣參與級聯(lián)反應(yīng)，因此相對于容易被氧氣猝滅的長時間室溫磷光與熱激活延遲熒光余輝發(fā)光體系，其更適合于機體中的含氧環(huán)境。

圖1 單線態(tài)氧[2+2]環(huán)加成機制

1.2 激發(fā)態(tài)產(chǎn)物的生成

二氧雜環(huán)丁烷活性中間體多數(shù)不穩(wěn)定，通常會發(fā)生化學(xué)分解產(chǎn)生羰基化合物。二氧雜環(huán)丁烷通過直接熱解的方式而產(chǎn)生單重激發(fā)態(tài)產(chǎn)物的量子產(chǎn)率很少，較難發(fā)出高強度的光。一般認(rèn)為，二氧雜環(huán)丁烷通過化學(xué)引發(fā)的電子交換發(fā)光（chemically initiated electron exchange luminescence，CIEEL）機制，能夠較高效地產(chǎn)生激發(fā)態(tài)分子[19-20]。如圖2所示，在CIEEL過程中，體系中存在的電子給體（electron donor，ED）會同二氧雜環(huán)丁烷之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移，隨后發(fā)生分子解離并產(chǎn)生羰基自由基陰離子，該陰離子自由基向ED 的陽離子自由基進行反向電子轉(zhuǎn)移時，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)分子產(chǎn)物。

圖2 CIEEL發(fā)光機制

1.3 能量轉(zhuǎn)移與余輝發(fā)光的產(chǎn)生

通過化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的激發(fā)態(tài)物種可以自身以光子輻射的方式弛豫，另外也可以通過能量轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)移到體系中其他能量受體中。有機熒光團具有可調(diào)節(jié)的發(fā)射，較高的熒光量子產(chǎn)率，通常作為余輝發(fā)光的能量受體出現(xiàn)。與熒光能量共振轉(zhuǎn)移（f?rster resonance energy transfer，F(xiàn)RET）過程類似，化學(xué)發(fā)光能量共振轉(zhuǎn)移（chemiluminescence resonance energy transfer，CRET）過程指代化學(xué)反應(yīng)類型的自發(fā)光體系（如化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光和余輝發(fā)光）中的能量轉(zhuǎn)移過程[13]。影響CRET 效率的主要因素包括：①能量供體和受體之間的距離[21]；②能量供體的發(fā)射光譜與能量受體的吸收光譜相重疊[22-23]；③能量受體自身的熒光量子產(chǎn)率[22]。因此，為了提高能量轉(zhuǎn)移效率，需要最小化縮短能量供體與受體之間的距離，盡量保證能量供體、受體之間的能量匹配并最大化受體的發(fā)射效率。

上述余輝發(fā)光中涉及的單線態(tài)氧產(chǎn)生、二氧雜環(huán)丁烷中間體的產(chǎn)生與分解和后續(xù)能量轉(zhuǎn)移過程，在級聯(lián)反應(yīng)體系中，分別由三部分完成（圖3）：①光敏引發(fā)劑；②余輝發(fā)光底物；③余輝發(fā)光能量受體。從能量角度來看，二氧雜環(huán)丁烷余輝發(fā)光體系是通過將激發(fā)光能量以化學(xué)能的形式儲存，在去除激發(fā)光后，體系通過化學(xué)激發(fā)過程產(chǎn)生光子輻射，實現(xiàn)在激發(fā)光停止后仍可在一段時間內(nèi)持續(xù)發(fā)光。

圖3 基于光氧化級聯(lián)反應(yīng)的二氧雜環(huán)丁烷余輝發(fā)光體系發(fā)光機理

2 二氧雜環(huán)丁烷余輝發(fā)光體系的構(gòu)建

2.1 光敏引發(fā)劑

作為余輝發(fā)光的引發(fā)劑，要求其有較高的單線態(tài)氧量子產(chǎn)率，以提高引發(fā)效率。通常使用的光敏劑包括重原子取代的熒光團，卟啉、酞菁類化合物，聚集誘導(dǎo)發(fā)光（aggregation-induced emission，AIE）分子（AIEgens）等。

2.1.1 含重原子的光敏劑

將重原子引入熒光團中，受到重原子效應(yīng)的影響，熒光團的系間竄越能力顯著提高。傳統(tǒng)光敏劑如玫瑰紅[12]（rose bengal，RB）、溴、碘代氟化硼二吡咯[24]（BDP）等由于其具有出色的單線態(tài)氧量子產(chǎn)率，可作為余輝發(fā)光的引發(fā)劑（如圖4所示）。然而，此類分子也面臨吸收、發(fā)射波長較短和重原子的引入造成的光穩(wěn)定性差等不利因素。

圖4 作為光敏引發(fā)劑的重原子光敏劑

2.1.2 卟啉、酞菁類光敏劑

卟啉、酞菁類光敏劑有特殊的π電子結(jié)構(gòu)，具有更長的吸收、發(fā)射波長，對光、熱穩(wěn)定性更高，部分卟啉和酞菁的衍生物具有較高的單線態(tài)氧量子產(chǎn)率[25-27]。此外，由于近紅外光在生物組織內(nèi)的光散射和光吸收作用較弱，因此近紅外光具有更高的組織穿透性。所以，卟啉和酞菁衍生物（圖5）也常作為光敏劑來引發(fā)余輝發(fā)光。

圖5 作為光敏引發(fā)劑的卟啉、酞菁衍生物

2.1.3 聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子

具有平面剛性結(jié)構(gòu)的光敏劑，在高濃度或聚集態(tài)下由于分子間π-π堆積效應(yīng)會引起典型的聚集引發(fā)猝滅現(xiàn)象（aggregation-caused quenching，ACQ），并降低余輝發(fā)光效率。因此余輝發(fā)光納米體系只能維持較低染料負(fù)載量以規(guī)避ACQ。不同于具有剛性共軛平面的熒光團，聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子AIEgens通常螺旋或扭曲的空間結(jié)構(gòu)[28]，在聚集狀態(tài)下，由于限制了分子內(nèi)自由旋轉(zhuǎn)或振動，AIEgens 在聚集態(tài)表現(xiàn)出更強的亮度，因此可允許以較高濃度負(fù)載在納米顆粒中。AIEgens 同時具有光穩(wěn)定性強、生物相容性好和大斯托克斯位移等特點，部分AIEgens具有更強的活性氧量子產(chǎn)率（圖6），因此可作為光敏劑使用[29-31]。

圖6 作為光敏引發(fā)劑的AIE分子

2.2 余輝發(fā)光底物

余輝發(fā)光底物通常具有富電子的烯烴或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，容易同單線態(tài)氧發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)而產(chǎn)生二氧雜環(huán)丁烷產(chǎn)物。余輝發(fā)光底物主要包括有機半導(dǎo)體聚合物和小分子化學(xué)發(fā)光底物等。下面介紹一下常見的余輝發(fā)光底物。

2.2.1 有機半導(dǎo)體聚合物類

有機半導(dǎo)體聚合物材料因其優(yōu)良的光物理性質(zhì)，在光電材料、生物熒光傳感等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用[32-33]。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)某些半導(dǎo)體聚合物可作為自發(fā)光試劑[34-36]，產(chǎn)生余輝發(fā)光（圖7）。2015年，Rao 等[34]首次報道了基于半導(dǎo)體聚合物MEHPPV 的余輝發(fā)光現(xiàn)象。2017 年，Pu 等[37]通過對PPV 系列衍生物的光氧化分解產(chǎn)物的質(zhì)譜與紅外表征，證實了該余輝發(fā)光過程涉及二氧雜環(huán)丁烷的產(chǎn)生與分解，并且通過篩選不同聚合物的余輝發(fā)光強度，發(fā)現(xiàn)取代基的電子效應(yīng)是半導(dǎo)體聚合物余輝發(fā)光的關(guān)鍵因素之一。具有供電子基團的PPV聚合物，包括BOPPV、MDMOPPV 和MEHPPV 檢測出余輝發(fā)光，而弱供電子（POPPV）或強吸電子取代（MEHCPV）等衍生物則沒有。這是由PPV 中的碳碳雙鍵對單線態(tài)氧的反應(yīng)活性決定的，即單線態(tài)氧容易同電子云密度高的雙鍵進行環(huán)加成反應(yīng)，產(chǎn)生二氧雜環(huán)丁烷活性中間體。

圖7 半導(dǎo)體聚合物余輝發(fā)光底物(a)和余輝發(fā)光機理(b)

2.2.2 金剛烷-二氧雜環(huán)丁烷化學(xué)發(fā)光前體

金剛烷-二氧雜環(huán)丁烷類化合物是常見的化學(xué)發(fā)光體系，而未形成過氧鍵的發(fā)光前體可作為余輝發(fā)光底物。如圖8 所示，金剛烷-二氧雜環(huán)丁烷發(fā)光前體可被單線態(tài)氧氧化，生成金剛烷-二氧雜環(huán)丁烷化學(xué)發(fā)光分子。當(dāng)酚羥基保護基團PG 被目標(biāo)分析物特異性去除時，產(chǎn)生不穩(wěn)定的酚氧負(fù)離子中間體，隨后通過分子內(nèi)CIEEL機制分解產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的中間體苯甲酸酯類化合物[38-39]，最后以光子輻射的方式回到基態(tài)或通過能量傳遞的方式激發(fā)其他熒光團能量受體[40]。2017 年，Shabat 等[41-42]通過在金剛烷-二氧雜環(huán)丁烷體系中引入吸電子基團，構(gòu)建分子內(nèi)推-拉電子體系，實現(xiàn)發(fā)光效率近三千倍的提升。目前Shabat 改性的金剛烷-二氧雜環(huán)丁烷化學(xué)發(fā)光分子作為余輝發(fā)光底物被廣泛地應(yīng)用于余輝發(fā)光體系構(gòu)建中[12,43]。

圖8 金剛烷發(fā)光前體余輝發(fā)光機理

2.2.3 氧雜環(huán)己烯和硫氧雜環(huán)己烯類發(fā)光前體

氧雜環(huán)己烯（DO）和硫氧雜環(huán)己烯（SO）類發(fā)光前體可被單線態(tài)氧氧化，生成二氧雜環(huán)丁烷活性中間體（圖9）。此類余輝發(fā)光分子在化學(xué)激發(fā)過程中具有較高的激發(fā)態(tài)量子產(chǎn)率，具有較高的亮度，然而其發(fā)射波長較短，在生物組織中容易受到光散射和光吸收等影響，成像穿透深度不佳。

圖9 DO與SO的結(jié)構(gòu)式(a)和發(fā)光機理(b)

Li 等[44-50]針對DO、SO 體系系統(tǒng)地進行分子改性，并開發(fā)出一系列余輝發(fā)光平臺。2021 年，為了實現(xiàn)余輝發(fā)光的可調(diào)節(jié)性，并提高能量轉(zhuǎn)移效率，研究者將SO 分子與BDP 分子共軛連接，并通過對BDP 分子改性，實現(xiàn)發(fā)射波長調(diào)節(jié)至500～700nm的較寬范圍內(nèi)。由于分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移效率顯著高于分子間的能量傳遞效率，因此相對于以往納米體系中物理包埋的方式，該策略以共價連接的方式使得余輝發(fā)光強度提高了近百倍[49]。

除了上述常見的余輝發(fā)光底物外，一些化學(xué)發(fā)光分子同樣可被活性氧氧化而發(fā)光，近期報道的海螢熒光素[51]、過氧化草酸酯[52]等也作為余輝發(fā)光底物用于余輝發(fā)光體系構(gòu)建之中。

2.3 作為余輝發(fā)光能量受體的發(fā)射團

很多余輝發(fā)光底物的光氧化分解產(chǎn)物本身具有一定熒光性質(zhì)，因此處于激發(fā)態(tài)的分解產(chǎn)物本身可以通過光子輻射的方式發(fā)光。然而，可設(shè)計通過進一步引入熒光染料作為能量受體，使發(fā)光體系具有發(fā)射可調(diào)節(jié)性，并且在生理環(huán)境下?lián)碛懈叩陌l(fā)光效率。因此，為了提高余輝發(fā)光強度，實現(xiàn)發(fā)射波長的紅移或?qū)崿F(xiàn)可激活型的余輝發(fā)射，研究者通常會額外引入改性的熒光團（如圖10 所示）作為能量受體，以滿足不同成像需求。此類熒光染料包括半導(dǎo)體聚合物、小分子熒光團、量子點等。

圖10 作為余輝發(fā)光能量受體的熒光團

某些情況下，作為余輝發(fā)光引發(fā)劑的光敏劑具有較高的熒光量子產(chǎn)率，因此同樣可以作為能量受體單元。此類分子包括卟啉和酞菁的衍生物（如NCBS 等）和AIEgens 等。特別是AIEgens，在聚集態(tài)下熒光量子產(chǎn)率高，并且可以以較高濃度負(fù)載在納米體系中。此外，其吸收波長可以很好地匹配發(fā)射波長較短的余輝發(fā)光分子，又因其具有較大的斯托克斯位移，能夠有效地延長發(fā)射波長，使其達(dá)到近紅外區(qū)。

另一方面，通過分子修飾手段賦予染料與發(fā)射團可響應(yīng)激活的特性，在同目標(biāo)分析物反應(yīng)前后出現(xiàn)染料吸收波長的變化，或熒光團熒光的開啟等（圖11）。如此可以實現(xiàn)響應(yīng)余輝發(fā)光和比例型余輝發(fā)光檢測，并進一步提高成像的準(zhǔn)確度。

圖11 響應(yīng)型受體染料

2.4 單分子余輝發(fā)光基團

某些熒光團具有活性烯烴或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，并擁有合適的活性氧量子產(chǎn)率，此類熒光團本身可同時作為光敏劑和余輝發(fā)光底物，因此單分子余輝發(fā)光團（圖12）可以在激發(fā)光照射下發(fā)生自氧化過程，并伴隨著余輝發(fā)光的產(chǎn)生。目前報道的單分子余輝發(fā)光基團包括：改性的SO 發(fā)光前體[48]、喹啉腈改性的金剛烷發(fā)光前體[53]、卟啉[54-55]和半菁染料[56]。

圖12 具有余輝發(fā)光性質(zhì)的單分子熒光團

2.5 表面活性劑

為了保證余輝發(fā)光體系中涉及的光化學(xué)級聯(lián)反應(yīng)和不同組分之間能量轉(zhuǎn)移過程的高效進行，各組分應(yīng)盡可能地保持在一個較近的距離，因此，通常將不同組分包裹在納米膠束中。在體系構(gòu)建過程中，引入表面活性劑，并通過π-π 堆積效應(yīng)、靜電相互作用、氫鍵和親疏水相互作用等將各個組分包裹起來，以自組裝等方式形成納米膠束[57]。在納米膠束中，各個組分充分混合，大大縮短了不同組分之間的距離。常用的表面活性劑（圖13）包括嵌段聚合物膠束、脂質(zhì)體等[12,33]。此外，形成的納米膠束也可以改善成像試劑在體內(nèi)的分布與代謝。

圖13 構(gòu)建納米膠束的兩親性表面活性劑

3 二氧雜環(huán)丁烷余輝發(fā)光體系在生物成像方面的應(yīng)用

生物樣本組成復(fù)雜，很多生物活性分子都具有固有熒光[58]，因此對生物樣本進行熒光成像時，生物組織的自體熒光對背景信號的干擾尤為嚴(yán)重[59]。而生物自體熒光發(fā)光壽命極短，因此擁有較長時間的余輝發(fā)光成像方式，可實現(xiàn)激發(fā)過程與信號采集過程的分離，最大程度降低生物自體熒光干擾，提升成像質(zhì)量。二氧雜環(huán)丁烷余輝發(fā)光體系具有良好的生物相容性和降解性，改善了傳統(tǒng)無機余輝發(fā)光材料的生物代謝、毒性等問題；另一方面，該體系具有更好的水氧耐受性，且易于進行分子改性與制備。更重要的是，該體系可以進一步與疾病治療手段相結(jié)合，精細(xì)地引導(dǎo)治療過程并把控治療效果，實現(xiàn)疾病的診療一體化。

二是夯實“黨政同責(zé)、一崗雙責(zé)”制度，劃定生態(tài)環(huán)?！柏?zé)任田”。強化生態(tài)環(huán)境保護主體責(zé)任，健全完善縱向到底、橫向到邊的責(zé)任體系。明確地方黨委政府是生態(tài)環(huán)境保護的責(zé)任主體，市委、市政府與各縣(區(qū))黨政“一把手”簽訂生態(tài)環(huán)境保護目標(biāo)責(zé)任書，向市直有關(guān)部門下達(dá)年度環(huán)保目標(biāo)責(zé)任書，形成一級抓一級、層層抓落實、責(zé)任明晰、整體聯(lián)動的工作格局。

3.1 腫瘤示蹤與手術(shù)導(dǎo)航

生物修飾的納米顆粒往往具有腫瘤靶向作用，這是實體瘤代謝性質(zhì)決定的。由于腫瘤處往往伴隨著血管豐富、血管壁間質(zhì)較大的特性，這造成了相對于正常組織，納米顆粒更容易進入腫瘤部位；加上腫瘤部位淋巴回流較差，納米顆粒能夠在腫瘤區(qū)域停留較長時間，即所謂實體瘤的高通透性和長滯留效應(yīng)（enhanced permeability and retention，EPR）[60-61]。依靠EPR 效應(yīng)，余輝納米顆粒能夠?qū)崿F(xiàn)對腫瘤部位的示蹤，充分利用高的信噪比成像優(yōu)勢，可服務(wù)于癌癥診斷與手術(shù)治療過程。特別地，由于癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是癌癥死亡的主要原因之一[62-63]，因此對轉(zhuǎn)移性癌癥組織的檢測非常重要。

2017年，Pu等[37]報道了一例基于半導(dǎo)體聚合物的余輝發(fā)光納米顆粒，并用于小鼠腫瘤和肝炎模型的成像。他們對導(dǎo)電聚合物余輝發(fā)光性能做了一個初步的篩選，并通過單線態(tài)氧抑制實驗和余輝發(fā)光后的產(chǎn)物分析，提出該余輝發(fā)光過程涉及一個二氧雜環(huán)丁烷中間體的生成。在構(gòu)建體內(nèi)成像納米顆粒過程中，為了實現(xiàn)更高效的單線態(tài)氧產(chǎn)生能力和更長波段的余輝發(fā)射，引入NCBS（圖14）作為余輝發(fā)光引發(fā)劑和能量受體單元，并將其同MEHPPV（圖15）在兩親性三嵌段共聚物F127包裹下制備余輝發(fā)光納米顆粒SPN-MEHPPV。該納米顆粒粒徑在40nm 左右，并且可以實現(xiàn)780nm 的近紅外余輝發(fā)射，發(fā)光半衰期為6min。淋巴結(jié)定位對于指導(dǎo)腫瘤切除手術(shù)具有重要意義，在小鼠腫瘤成像過程中，該納米顆?？梢郧逦貙δ[瘤進行定位。體內(nèi)實驗表明，該有機半導(dǎo)體聚合物材料余輝強度相對于無機余輝材料提高了近100倍，同時相對于近紅外熒光成像，信噪比提高了127倍。

圖14 SPPVN與PPVP納米顆粒制備與納米粒徑[64]

圖15 手術(shù)導(dǎo)航用AGL-AIE-dots余輝發(fā)光納米點（改編自文獻[66]）

余輝發(fā)光底物MEHPPV 是一個高度疏水的聚合物，同兩親性共聚物與其共沉淀生成的水溶性納米顆粒，其膠束粒徑較大，影響材料的生物分布，不利于對腫瘤被動靶向聚集。2018 年，Pu 等[64]對PPV聚合物進行改性，將親水性PEG鏈接枝在疏水性的PPV鏈上，得到水溶性PPV鏈（PPV-PEGL），改性之后的聚合物可以在水溶液中自組裝形成納米顆粒SPPVN（圖14）。此類自組裝納米顆粒相較于多組分共沉積形成的納米顆粒，具有更小的納米粒徑（24nm）。SPPVN具有最強且相對持久的余輝發(fā)光，最大發(fā)射波長為780nm，發(fā)光半衰期為4.8min。小鼠腫瘤成像，在808nm、0.3W/cm2的激發(fā)光預(yù)照射1min后，分別將SPPVN 與PPVN 進行靜脈給藥。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SPPVN相對于PPVN在腫瘤部位的余輝發(fā)光信號更強，腫瘤部位SPPVN 余輝成像信噪比值為306，相較于熒光提高了11倍。在小鼠乳腺癌腹膜轉(zhuǎn)移模型中，SPPVN 能夠?qū)ξ⑿∧[瘤病灶區(qū)進行檢測，微小轉(zhuǎn)移腫瘤灶處的余輝發(fā)光強度相對于背景提升了6.1倍。

2020 年，Zhang 等[65]報道了一例基于半導(dǎo)體聚合物PFPV（圖15）余輝發(fā)光底物，AIE分子TTMN（圖14）作為光敏劑引發(fā)余輝發(fā)光體系P-TNPs。P-TNPs 的平均水合粒徑為120nm，熒光光譜證明PFPV 與TTMN 之間有一個良好的能量轉(zhuǎn)移過程。在小鼠荷瘤模型成像實驗中，P-TNPs 主要通過肝臟代謝，然而受納米顆粒EPR效應(yīng)影響，注射12h之后，腫瘤處余輝發(fā)光最強，且相對于熒光，余輝發(fā)光成像信噪比更高，使腫瘤區(qū)域邊界清晰可見。另外，P-TNPs 可通過多次光照激活余輝發(fā)光，再次激活后，其余輝強度沒有明顯衰弱。

腫瘤附近生長、轉(zhuǎn)移的微小腫瘤（直徑<1mm），不容易被察覺，且往往造成術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)；加之處于腫瘤早期階段，一些生物標(biāo)志物，如H2O2、相關(guān)酶等，相對于附近組織并無明顯的高表達(dá)，這些都是實現(xiàn)特定的腫瘤成像和引導(dǎo)手術(shù)過程中亟待解決的問題。2019年，Ding等[66]報道了一例的余輝發(fā)光納米體系A(chǔ)GL-AIE-dots，該體系使用AIE 分子TPE-Ph-DCM 作為光敏劑，金剛烷-二氧雜環(huán)丁烷發(fā)光前體作為余輝發(fā)光底物（圖15）。TPE-Ph-DCM在聚集態(tài)時大大降低了激發(fā)態(tài)非輻射的損耗，并且擁有較高的單線態(tài)氧量子產(chǎn)率和熒光量子產(chǎn)率；同時，金剛烷-二氧雜環(huán)丁烷的發(fā)射光譜，與TPE-Ph-DCM 吸收光譜之間的光譜重疊，保證了一個有效的能量轉(zhuǎn)移過程，余輝發(fā)光發(fā)射>650nm，達(dá)到近紅外區(qū)。體外實驗表明，AGL-AIE-dots 在0.2W/cm2的白光照射2min 后，其余輝發(fā)光可達(dá)10 天之久。小鼠荷瘤成像實驗顯示，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（肝、脾和腎）器官余輝發(fā)光信號衰減較快，2h后基本完全消失；而作為對比，癌癥組織余輝信號能保持較長時間。由于AGL-AIE-dots 具有癌癥組織-正常組織高對比度的余輝發(fā)光信號，適合于成像引導(dǎo)癌癥切除手術(shù)過程中的精確腫瘤識別過程。而小鼠腹膜癌模型中，根據(jù)經(jīng)驗切除大部分腫瘤之后再進行余輝監(jiān)測。然而，余輝發(fā)光顯示術(shù)后腹腔中仍殘留著亞毫米級的腫瘤結(jié)節(jié)。再經(jīng)由余輝發(fā)光實時成像下進行的手術(shù)，幾乎切除了所有微小腫瘤。因此，借助于余輝發(fā)光高信噪比優(yōu)勢，ALG-AIEdots可以作為手術(shù)協(xié)助，提供更精確的腫瘤檢測。

基于三苯胺（TPA）或四苯乙烯（TPE）結(jié)構(gòu)的AIE光敏劑，具有扭曲的空間結(jié)構(gòu)，限制了分子在聚集態(tài)的自由運動，同時也避免了π-π 堆積造成的熒光猝滅。然而，也因為其扭曲結(jié)構(gòu)影響了分子共軛，造成光敏劑的摩爾消光系數(shù)較低，對外界激發(fā)光利用率不高的缺點。2023年，Liu等[67]通過將三苯胺結(jié)構(gòu)中的氮原子單元替換為三氮唑結(jié)構(gòu)單元，得到TPT衍生分子。三氮唑結(jié)構(gòu)加強了分子的平面性，分子的消光系數(shù)得以提高。產(chǎn)物的單晶結(jié)構(gòu)證明，TPT具有較弱的π-π堆積效應(yīng)，此外，存在的多個分子間氫鍵抑制了分子內(nèi)運動。因此，TPT平衡了分子扭曲與分子共軛之間的關(guān)系，使得作為光敏劑的TPT衍生物TPT-DCM在聚集態(tài)時具有更強的亮度和活性氧產(chǎn)生能力。他們使用丙烯腈取代的金剛烷發(fā)光前體AGL為余輝發(fā)光底物，TPT-DCM作為光敏劑，并通過脂質(zhì)體進行包裹，得到余輝發(fā)光納米顆粒TPT-DCM/AGLNPs。體外測試發(fā)現(xiàn)，在0.2W/cm2的白光預(yù)照射2min 后，能夠發(fā)出最大發(fā)射波長為630nm的近紅外余輝發(fā)光。TPT-DCM/AGLNPs可以實現(xiàn)深度穿透深度（1.6cm），高腫瘤-肝臟余輝成像信號強度比（187 倍），并成功地應(yīng)用于余輝引導(dǎo)下的手術(shù)導(dǎo)航（圖16）。

圖16 用于手術(shù)導(dǎo)航的高信噪比余輝發(fā)光成像TPT-DCM/AGL納米探針（改編自文獻[67]）

3.2 生物活性分子成像

在機體急性炎癥過程中，中性粒細(xì)胞會被招募到炎癥部位并釋放促炎因子，產(chǎn)生大量活性氧、活性氮物種；此外，由于免疫細(xì)胞的浸潤和細(xì)胞代謝，炎癥微環(huán)境還伴隨著pH的降低。2022年，Ding課題組[70]報道了一例過氧亞硝酰離子（ONOO—）和微環(huán)境pH 雙響應(yīng)激活型近紅外余輝納米探針，用于檢測中性粒細(xì)胞相關(guān)疾?。▓D17）。他們合成了苯硼酸酯保護的金剛烷-二氧雜環(huán)丁烷發(fā)光前體AGL作為余輝發(fā)光底物和TPE-TV-CyP 染料作為能量受體。如前文所述，AGL 具有較高的發(fā)射效率；而TPE-TV-CyP 是一個具有扭曲結(jié)構(gòu)的AIE 分子，其在水溶液中的聚集態(tài)限制了染料的非輻射躍遷能量消散，具有較高的熒光量子產(chǎn)率；另外，AGL 與TPE-TV-CyP之間光譜重疊較好，能量轉(zhuǎn)移效率較高。通過納米共沉積的方式，利用兩親性片段DSPE-PEG2000包封AGL 和TPE-TV-CyP，得到了近紅外余輝發(fā)光納米探針（PA-AGL NPs）。體外實驗表明，NPs 同ONOO—有良好的響應(yīng)能力，在光強為0.25W/cm2的白光預(yù)射5min 后且在ONOO—孵育條件下，15min余輝發(fā)光達(dá)到最強，且余輝發(fā)射有近553 倍的提升。NPs 可以對中性粒細(xì)胞浸潤和酸化的炎癥環(huán)境進行響應(yīng)，區(qū)分局部過敏和急性炎癥組織。另外，探針還可以根據(jù)局部中性粒細(xì)胞招募情況，對促免疫原性死亡（immunogenic cell death，ICD）藥物治療效果進行實時監(jiān)控。

圖17 用于檢測中性粒細(xì)胞相關(guān)炎癥的雙響應(yīng)余輝發(fā)光納米探針（改編自文獻[70]）

早期肝炎常伴隨肝臟硫化氫（H2S）水平的顯著上升，這可能是炎癥過程中H2S產(chǎn)生酶表達(dá)量上調(diào)引起的，因此H2S 可作為早期肝臟炎癥的標(biāo)志物。2022 年，Ye 課題組[71]報道了一例多功能納米探針F1-GdNP，可進行H2S響應(yīng)的余輝發(fā)光和磁共振（magnetic resonance imaging，MRI）雙模態(tài)成像（圖18）。F1-GdNP 是由電致變色材料EM F12+、近紅外光敏劑NIR775、余輝發(fā)光底物MEHPPV、順磁兩親性釓配合物DTPA-BSA-Gd 和陽離子脂質(zhì)體PC-DPPC 與DSPE-PEG2000組成。EM F12+是該組先前報導(dǎo)的一例H2S 特異性響應(yīng)染料[72]，F(xiàn)12+在可見光區(qū)（550nm）和近紅外區(qū)（760nm）有強烈的吸收，可以猝滅MEHPPV 和NIR775 的發(fā)光；而在H2S存在的條件下，EM F12+被還原為F2，吸收顯著藍(lán)移至500nm以下，從而開啟余輝信號。具有陽離子性質(zhì)的脂質(zhì)體和F12+染料容易通過靜電相互作用，使生理條件下的HS—更容易富集，這加快了探針與H2S 的反應(yīng)動力學(xué)過程。由DTPA-BSA-Gd 提供始終開啟的MRI信號，可以通過其來追蹤NPs在體內(nèi)的分布；而余輝發(fā)光信號則可以追蹤體內(nèi)H2S的水平。納米探針在808nm（1W/cm2）預(yù)光照1min，并同NaHS 共孵育后，余輝發(fā)光強度有126 倍的提升。此外，根據(jù)細(xì)胞胱硫醚裂解酶（CSE）介導(dǎo)的半胱氨酸-H2S 通路，納米探針對CSE 檢出限達(dá)0.21nmol/L。在小鼠脂多糖誘導(dǎo)的肝臟炎癥成像中，相對于正常肝臟，炎癥組余輝發(fā)光信號的信噪比有2.08倍的提升。

圖18 肝損傷檢測用H2S激活型余輝-磁共振雙模式成像納米探針（改編自文獻[71]）

局部一氧化氮（NO）含量的上升，是巨噬細(xì)胞M1型極化并發(fā)揮抗腫瘤免疫活性的標(biāo)志之一[73]。目前，現(xiàn)有的余輝發(fā)光分子存在的缺點包括：①余輝發(fā)光強度伴隨著時間的推移而下降，這不利于對分析底物的定量測量[74]；②由于缺乏相關(guān)反應(yīng)位點，構(gòu)建響應(yīng)性余輝發(fā)光探針難度較大[75]。2022 年，Zhang等[24]提出了一種余輝發(fā)光能量共振轉(zhuǎn)移策略，根據(jù)反應(yīng)前后能量給體和受體發(fā)光信號強度的比例，對分析底物進行定量測定。他們采用余輝發(fā)光聚合物MEHPPV 作為能量供體，NO 反應(yīng)型熒光探針NRM 作為能量受體，光敏劑BDP 作為余輝發(fā)光引發(fā)劑，多種組分通過兩親性聚合物F127 包裹形成納米探針（RAN1）。其中，在NRM 中，帶有二氨基的苯并噻二唑會被NO氧化成吸電子能力更強的苯并噻二唑-三氮唑結(jié)構(gòu)（NRM-NO），從而導(dǎo)致分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)增強，吸收和發(fā)射波長明顯紅移。RAN1 在同NO 共孵育下，600nm 處的余輝發(fā)光AF1 減弱，而830nm 處的余輝發(fā)光AF2 增強，并且二者余輝比例（AF2/AF1）同NO 濃度呈現(xiàn)一個良好的線性關(guān)系。值得注意的是，基于該比例型余輝發(fā)光策略，可以有效降低因激發(fā)光功率、照射時間的不同，而引起的發(fā)光強度變化造成的不利影響，從而提高余輝傳感的可靠性。為了驗證該設(shè)計策略的有效性，他們使用多種調(diào)節(jié)劑（IFN-γ，BLZ945，培西達(dá)替尼和氯喹）對RAW264.7巨噬細(xì)胞極化過程進行成像。結(jié)果表明，RAN1 可以根據(jù)細(xì)胞內(nèi)源性NO 含量的波動，來評估細(xì)胞極化過程。

3.3 余輝發(fā)光監(jiān)控藥物釋放

2019 年，Pu 課題組[76]報道了一例余輝發(fā)光納米自組裝體APtN，可對腫瘤微環(huán)境中高表達(dá)的H2O2水平進行響應(yīng)，同時在伴隨余輝發(fā)光信號的開啟，化療前藥隨即釋放至患處，實現(xiàn)對癌癥的精準(zhǔn)治療與診療一體化。在該策略中，他們合成了連接有H2O2激活型化療前藥5-DFUR的金剛烷余輝發(fā)光底物，同時該底物接枝兩親性PEG 長鏈。此外，引入了近紅外染料NCBS作為余輝發(fā)光引發(fā)劑。溶液中，兩親性大分子PEG-AE- 5-DFUR與NCBS可自組裝形成納米顆粒APtN。APtN可通過EPR效應(yīng)在靜脈注射給藥后被動靶向腫瘤區(qū)域，同時，通過對腫瘤微環(huán)境中H2O2的響應(yīng)，不僅化療藥物可由生物標(biāo)志物觸發(fā)，而且其余輝發(fā)光信號也同藥物釋放狀態(tài)有關(guān)。體外實驗證明，5-DFUR釋放比例同余輝發(fā)光強度有一個很好的線性關(guān)系（R2=0.9857）。APtN 的精準(zhǔn)釋藥性質(zhì)在細(xì)胞和小鼠層面得到進一步驗證。2022年，Ding等[77]將化療藥物喜樹堿（HCPT）與ONOO—激活的金剛烷余輝底物通過自消除基團相連接，光敏劑(TPE-DPA)2-Py 則作為光敏劑與余輝發(fā)光能量受體出現(xiàn)（圖19）。在ONOO—作用下，HCPT被釋放，同時進行一系列級聯(lián)反應(yīng)，近紅外余輝發(fā)光開啟。該納米探針可響應(yīng)光動力治療過程引發(fā)的ICD過程中，腫瘤部位高表達(dá)的ONOO—水平，實現(xiàn)余輝發(fā)光監(jiān)測腫瘤治療中的ICD過程與藥物HCPT的釋放。

圖19 ONOO—激活喜樹堿釋放與余輝發(fā)光監(jiān)控釋藥（改編自文獻[77]）

4 結(jié)語

綜上所述，基于光氧化級聯(lián)反應(yīng)的二氧雜環(huán)丁烷余輝發(fā)光體系，具有良好的生物相容性、水氧耐受性和易于制備和修飾等優(yōu)點。然而，在實際應(yīng)用上仍然面臨諸多挑戰(zhàn)，其中包括以下幾種問題應(yīng)予以解決。

（1）部分余輝發(fā)光體系發(fā)光效率較低，其原因之一是能量轉(zhuǎn)移過程中造成的損失。未來，構(gòu)建激活型單分子余輝發(fā)光材料是研究的熱點。

（2）相對于處于近紅外一區(qū)（600～900nm）波段的光來說，近紅外二區(qū)（1000～1700nm）波段的光具有更深的組織穿透能力[78-79]。然而目前近紅外二區(qū)的余輝發(fā)光體系的研究較少，屬于亟待開發(fā)的領(lǐng)域。此外，近紅外二區(qū)熒光團通常受限于相對較低的熒光量子產(chǎn)率，發(fā)光強度較弱[13]。因此開發(fā)出能夠在近紅外二區(qū)擁有較高發(fā)光效率的余輝發(fā)光體系是未來研究的方向。

（3）目前二氧雜環(huán)丁烷余輝發(fā)光體系所需激發(fā)光的光強較大，且針對于較深成像部位，使用原位照射的方式面臨激發(fā)光穿透深度和安全光劑量的問題。可以采取其他激活方式，如X-射線[80]和超聲激活[81]自發(fā)光的形式，實現(xiàn)深層組織成像。相信隨著研究的深入，此類余輝發(fā)光體系將會在成像領(lǐng)域有著更為廣泛的應(yīng)用。