固表止嚏湯調(diào)控Th17細(xì)胞/Treg抗變應(yīng)性鼻炎作用機(jī)制

楊世珍 郭兆剛 蔡亞梅 龔艷

摘要：固表止嚏湯是云南省名中醫(yī)郭兆剛教授治療過(guò)敏性鼻炎的有效驗(yàn)方，由生黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、荊芥、麻絨、紫蘇葉、蒼耳子、五味子、烏梅、黃芩、甘草為基本方組成。導(dǎo)師郭教授認(rèn)為鼻鼽在臨床上肺氣虛寒者較多，強(qiáng)調(diào)調(diào)節(jié)陰陽(yáng)，重在益氣固表，祛風(fēng)通竅，自擬固表止嚏湯。通過(guò)構(gòu)建變應(yīng)性鼻炎模型，研究固表止嚏湯通過(guò)調(diào)控Th17細(xì)胞/Treg平衡介導(dǎo)抗變應(yīng)性鼻炎的作用機(jī)制。

關(guān)鍵詞：固表止嚔湯、變應(yīng)性鼻炎，Th17細(xì)胞，Treg

中圖分類號(hào)：R765.21 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2023）09-0001-03

Discussion on the Action Mechanism of Exterior-strengthening and Sneeze-stoppingDecoction by Regulating Th17 Cells/Treg Against Allergic Rhinitis

YANG Shi-Zhen1， GUO Zhao-gang2， CAI Ya-Mei1， GONG Yan1

（1. Traditional Chinese Medicine Hospital of Yuxi City， Yuxi 653100， China;2. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China）

【Abstract】Exterior-strengthening and Sneeze-stopping Decoction is an effective prescription for the treatment of allergic rhinitis by Professor Guo Zhaogang， a famous Chinese medicine doctor in Yunnan Province， which is composed of raw astragalus， atractylodis， saposhnikovia， schizopeta， ephedra， perilla leaves， cocklebur， schisandra， mume， scubaicalensis and licorice. Professor Guo considers that allergic rhinitis is more qi deficiency and cold in lung clinically， emphasizing the regulation of yin and yang， stressing on tonifying qi and strengthening exterior， dispelling wind to clear apertures， thus making self-prescribed Exterior-strengthening and Sneeze-stopping Decoction. By constructing the model of allergic rhinitis， the study aims at the mechanism of antiallergic rhinitis mediated by the regulation of Th17 cell /Treg balance.

【Key words】Exterior-strengthening and Sneeze-stopping Decoction; Allergic Rhinitis; Th17 Cells; Treg

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是耳鼻咽喉科臨床的一個(gè)常見(jiàn)病、多發(fā)病，是特應(yīng)性個(gè)體接觸了致敏原后由IgE介導(dǎo)的介質(zhì)釋放、并有多種免疫活性細(xì)胞和細(xì)胞因子等參與的鼻黏膜慢性炎癥反應(yīng)性疾?。?］。變應(yīng)性鼻炎因其不斷增高的發(fā)病率越來(lái)越得到醫(yī)學(xué)界的重視，已被列入國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）［2］。研究已表明，在變應(yīng)性鼻炎患者的外周血中，Treg細(xì)胞的數(shù)量減少，而Th17細(xì)胞的數(shù)量增加，Treg/Th17細(xì)胞失衡與AR發(fā)生密切相關(guān)。因此如何維持Treg/Th17細(xì)胞亞群間的平衡和自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，已成為治療AR重要的藥物靶點(diǎn)［3］。中醫(yī)認(rèn)為AR應(yīng)歸于“鼻鼽”，治療上，遵循中醫(yī)整體觀念和辨證論治理論，調(diào)整臟腑陰陽(yáng)平衡，改善患者的過(guò)敏體質(zhì)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，控制變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生，目前中藥治療已取得了顯著療效。臨床上肺虛感寒、肺脾氣虛、腎陽(yáng)虧虛等為常見(jiàn)的臨床證型［4］。固表止嚏湯選由具有抗變態(tài)反應(yīng)作用的藥物組方，方中所選藥物，現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為，都具有抗變態(tài)反應(yīng)的作用，它們?cè)谧儜B(tài)反應(yīng)的不同環(huán)節(jié)中發(fā)揮不同程度的作用［5］。

1 研究?jī)?nèi)容

采用卵清蛋白（OVA）+氫氧化鋁粉基礎(chǔ)致敏+強(qiáng)化致敏構(gòu)建變應(yīng)性鼻炎模型，固表止嚏湯藥物干預(yù)后，通過(guò)變應(yīng)性鼻炎癥狀評(píng)分表評(píng)價(jià)固表止嚏湯抗變應(yīng)性鼻炎效應(yīng)，HE染色評(píng)價(jià)固表止嚏湯對(duì)變應(yīng)性鼻炎組織病理?yè)p傷的影響。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)血清中IL-10、TGF-β和IL-17水平；實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)與分析鼻粘膜和脾淋巴細(xì)胞Th17相關(guān)基因（IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-23、RORγt和CCR6）和Treg細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)水平；流式細(xì)胞術(shù)（FACs）檢測(cè)Th17和Treg細(xì)胞的表達(dá)水平。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 來(lái)源，種系，品系：BALB/c小鼠，7～8周齡，體重20～22g，雌性，斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2019-0010；動(dòng)物飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物至少飼養(yǎng)一周后使用。溫度（22±1）℃，濕度（55±5）%，12 h光暗循環(huán)。飼料和水均在消毒后由動(dòng)物自由攝取。所有實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有關(guān)條例進(jìn)行。

2.2 固表止嚏湯浸膏的制備 固表止嚏湯，由生黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、荊芥、麻絨、紫蘇葉、蒼耳子、五味子、烏梅、黃芩、甘草為基本方組成，所需藥材加水浸泡1h，煮沸2次，每次30min，過(guò)濾后并濃縮，折合原藥材1 g浸膏相當(dāng)于原藥材2.6 g生藥。

2.3 實(shí)驗(yàn)材料 主要試劑如表1。

2.4 主要儀器設(shè) 主要實(shí)驗(yàn)儀器如表2。

3 實(shí)驗(yàn)方法及評(píng)價(jià)

3.1 變應(yīng)性鼻炎模型的誘導(dǎo)、分組和給藥 60只BALB/C小鼠，隨機(jī)分為6組：正常組、模型組、陽(yáng)性藥組（氯雷他定組）組、固表止嚏湯低、中、高劑量組，每組10只。采用卵清蛋白（OVA）+氫氧化鋁粉滴鼻構(gòu)建變應(yīng)性鼻炎模型，具體為：鼻腔滴藥后將100 μg卵清蛋白（OVA）和2mg氫氧化鋁粉AL（OH）3溶入0.1mL生理鹽水中，分別于第0、2、4、6、8、10、12、14天給予實(shí)驗(yàn)組（AR組）小鼠腹腔注射，自第15-25天每日將50 mg OVA溶入10 mL生理鹽水中，滴鼻，每側(cè)鼻孔10 mL，連續(xù)滴鼻11d。對(duì)照組使用生理鹽水替代OVA同期進(jìn)行腹腔注射以及滴鼻。第15天開(kāi)始，固表止嚏湯低、中、高劑量組（7.5、15、30 g/kg），陽(yáng)性藥組以氯雷他定組（0.5 mg/kg）每天灌胃給藥1次，共7 d，正常組和模型組灌胃等體積的生理鹽水，給藥量按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人用藥量的換算公式計(jì)算得出。

3.2 指標(biāo)檢測(cè)

3.2.1 變應(yīng)性鼻炎癥狀評(píng)分表 觀察鼻部癥狀如鼻癢、流清涕、打噴嚏等出現(xiàn)的情況及輕重，并按照表3記錄行為學(xué)得分。

3.2.2 鼻腔組織病理檢測(cè) 末次OVA激發(fā)給藥后，小鼠脫脊椎處死，鼻腔組織于4％多聚甲醛溶液中固定2h，石蠟包埋，切片，HE染色觀察鼻腔組織病理變化。

3.2.3 Th17和Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的檢測(cè) 迅速摘眼球取血，3000 r/min離心10 min，分取上層血清，血清標(biāo)本置于-20℃保存并立即送檢。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)血清中TGF-β和IL-17水平，實(shí)驗(yàn)方法詳見(jiàn)說(shuō)明書。

3.2.4 熒光定量PCR檢測(cè)Th17和Treg相關(guān)基因得表達(dá) 取脾淋巴細(xì)胞1×107，應(yīng)用Trizol試劑盒抽提細(xì)胞總RNA，采用超微量核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定其濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，采用RT-PCR法制備cDNA。逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA用作PCR反應(yīng)的模板。取同一個(gè)cDNA為模板，按照試劑盒說(shuō)明書，實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行Th17相關(guān)基因和Treg細(xì)胞相關(guān)基因mRNA表達(dá)檢測(cè)與分析，相關(guān)引物由Invitrogen公司合成。熒光定量PCR的結(jié)果以Ct值顯示。實(shí)時(shí)熒光定量PCR中每個(gè)樣本重復(fù)3次，取平均值為Ct值。

3.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1和Treg細(xì)胞的表達(dá)水平 對(duì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色：各組1×106個(gè)小鼠脾淋巴細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞與PMA、Ionomycin以及BFA于5%CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)4h后，收集細(xì)胞，冼液冼2次，加入IgG抗體，封閉FcR，行標(biāo)志CD4染色。完畢后，固定、穿膜，加入熒光標(biāo)記的抗IL-17抗體和IFN-g，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。對(duì)于Treg細(xì)胞的檢測(cè)，無(wú)需上述刺激，按胞內(nèi)細(xì)胞因子染色檢測(cè)，F(xiàn)lowjo軟件分析

3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理。均值間差異比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05為顯著水平。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 固表止嚏湯對(duì)變應(yīng)性鼻炎模型體重的影響 表4結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠體重下降，但差異無(wú)顯著性意義（P>0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性組和固表止嚏湯低、中、高劑量組小鼠體重?zé)o明顯差別（P>0.05）。見(jiàn)表4。

4.2 固表止嚏湯對(duì)變應(yīng)性鼻炎癥狀評(píng)分的影響 表5結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠癥狀評(píng)分顯著增加，差異具有顯著性意義（P<0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性組和固表止嚏湯低、中、高劑量組癥狀評(píng)分顯著減少，差異具有顯著性意義（P<0.05）。見(jiàn)表5。

4.3 固表止嚏湯對(duì)變應(yīng)性鼻炎模型鼻黏膜組織病理的影響 與空白組比較，模型組小鼠鼻黏膜有大量炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，固有層腺體增生明顯，纖毛柱狀上皮細(xì)胞排列缺乏完整性。與模型組比較，陽(yáng)性藥組和固表止嚏湯中、高劑量組鼻黏膜炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)顯著減少，固有層腺體增生改善，纖毛柱狀上皮細(xì)胞排列較好，以陽(yáng)性藥和固表止嚏湯中劑量效果最好。見(jiàn)圖1。

4.4 固表止嚏湯對(duì)變應(yīng)性鼻炎模型血清細(xì)胞因子IL-17的影響 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠血清IL-17水平升高，但差異無(wú)顯著性意義。與模型組比較，陽(yáng)性藥組和固表止嚏湯低、中、高劑量組均低于模型組，其中中劑量差異具有顯著性意義（P<0.05）。見(jiàn)表6。

4.5 固表止嚏湯對(duì)變應(yīng)性鼻炎模型小鼠血清細(xì)胞因子TGF-b的影響 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠血清TGF-b水平無(wú)明顯變化，與模型組比較，固表止嚏湯高劑量組血清細(xì)胞因子TGF-b高于模型組，差異具有顯著性意義（P<0.05）。見(jiàn)表7。

4.6 固表止嚏湯對(duì)變應(yīng)性鼻炎模型Th17/Th1細(xì)胞表達(dá)的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)變應(yīng)性鼻炎模型小鼠脾臟和淋巴結(jié)Th17（CD4+IL-17+T細(xì)胞）和Th1細(xì)胞（CD4+IFN-g+T細(xì)胞）表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與模型組比較，固表止嚏湯給藥組小鼠脾臟的CD4+IL-17+T細(xì)胞比例顯著下降，差異具有顯著性意義（P<0.05）。然而淋巴結(jié)2組Th17細(xì)胞表達(dá)無(wú)差異。2組小鼠淋巴結(jié)和脾臟Th1細(xì)胞表達(dá)水平均無(wú)顯著差異。結(jié)果見(jiàn)圖2。

4.7 固表止嚏湯對(duì)變應(yīng)性鼻炎模型小鼠Treg細(xì)胞表達(dá)的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)變應(yīng)性鼻炎模型小鼠脾臟和淋巴結(jié)Treg細(xì)胞（CD4+Foxp3+T細(xì)胞）表達(dá)，結(jié)果顯示，與模型組比較，固表止嚏湯藥物干預(yù)顯著上調(diào)變應(yīng)性鼻炎模型小鼠脾臟和淋巴結(jié)Treg細(xì)胞比例，差異均具有顯著性意義（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖3。

5 小結(jié)

本研究結(jié)果證實(shí)，固表止嚏湯能夠顯著改善變應(yīng)性鼻炎模型的炎癥評(píng)分和鼻黏膜的病理?yè)p傷，減少黏膜組織炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，其作用機(jī)制與抑制Th17細(xì)胞，上調(diào)Treg細(xì)胞的表達(dá)，調(diào)控Th17細(xì)胞/Treg平衡有關(guān)。

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