氧化應(yīng)激和線粒體質(zhì)量控制與牙周炎關(guān)系的研究進(jìn)展

丁旭 李鑫 李艷 夏博園 于維先

1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科 長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院老年口腔科 長(zhǎng)春 130021；3.吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 長(zhǎng)春 130021

牙周炎是由菌斑微生物引起的牙周支持組織的慢性炎癥性疾病，引起牙周組織破壞主要是由于細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物所產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)造成機(jī)體免疫功能失衡的結(jié)果[1]。多形核中性粒細(xì)胞（polymorphonuclear neutrophils，PMNs）等防御細(xì)胞對(duì)細(xì)菌及其代謝物如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 的反應(yīng)所釋放的活性氧（reactive oxygen species，ROS）會(huì)加重牙周組織損傷[1-2]。線粒體是ROS的主要來(lái)源[3]。Govindaraj等[4]的研究表明：牙周炎患者的線粒體功能存在異常。牙周炎患者成纖維細(xì)胞的凋亡表現(xiàn)出明顯的線粒體破碎、畸形等[5]。Sun等[6]發(fā)現(xiàn)：線粒體氧化應(yīng)激在糖尿病加重牙周炎中起重要作用。由這些研究可以推測(cè)，線粒體質(zhì)量控制可能在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。線粒體質(zhì)量控制過(guò)程包括線粒體的生物發(fā)生、動(dòng)力學(xué)和自噬三大部分[7]，本文分別進(jìn)行論述，旨在為牙周炎的防治提供新途徑。

1 線粒體的生物發(fā)生

線粒體生物發(fā)生是指線粒體通過(guò)生長(zhǎng)和分化產(chǎn)生新的線粒體，以維持線粒體的數(shù)量和生理功能。病理情況下，線粒體的生物發(fā)生處于失衡狀態(tài)[8-9]。線粒體的獨(dú)特性在于它是一個(gè)半自主的細(xì)胞器，擁有自己的基因組[5,9-11]，即線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）。在氧化應(yīng)激條件下，mtDNA更容易受到ROS的攻擊[12]，從而導(dǎo)致線粒體功能失調(diào)。線粒體的生物發(fā)生依賴于轉(zhuǎn)錄因子和共激活因子之間的相互作用，如過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子1 α（peroxisome-proliferator-activated receptor-gamma co-activator 1α，PGC-1α）、核呼吸因子1/2（nuclear respiratory factor 1/2，Nrf1/2）、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）等[11]。

1.1 PGC-1α與牙周炎的關(guān)系

PGC-1α是線粒體生物發(fā)生的主要調(diào)節(jié)因子[13]，屬于轉(zhuǎn)錄共激活因子[8,11]，主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[14]。研究[14-15]表明：PGC-1α位于線粒體室中，在線粒體D環(huán)與TFAM相互作用，共同調(diào)控線粒體生物發(fā)生過(guò)程。PGC-1α磷酸化后，定植于細(xì)胞核中，上調(diào)生物發(fā)生[14]。PGC-1α還可以通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性，誘導(dǎo)Nrf1、Nrf2和TFAM的基因表達(dá)，從而協(xié)調(diào)核DNA和mtDNA編碼的線粒體蛋白的基因表達(dá)[15]。Singh等[16]研究證實(shí)：牙齦卟啉單胞菌通過(guò)降低PGC-1α而增加脂肪細(xì)胞的炎癥水平和氧化應(yīng)激，從而確定牙周炎與肥胖之間關(guān)聯(lián)的潛在機(jī)制。蔡川等[17]發(fā)現(xiàn)：炎癥刺激下，牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament cells，PDLSCs） 的PGC-1α/β、有絲分裂蛋白2（mitofusin 2，Mfn2）、線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)酶13 （translocase of inner mitochondrial membrane 13，TIMM13）表達(dá)均下調(diào)，表明細(xì)胞線粒體生物合成功能受到了影響。Hong等[18]證實(shí)：牙齦間充 質(zhì)干 細(xì)胞 （gingival mesenchymal stem cells，GMSCs）可通過(guò)增加PGC-1α的表達(dá)，改善牙周組織炎癥，促進(jìn)牙周組織的骨再生。

1.2 Nrf2與牙周炎的關(guān)系

Nrf2屬于堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，BZIP）轉(zhuǎn)錄因子家族，與線粒體生物發(fā)生過(guò)程密切相關(guān)。Nrf2通過(guò)與Nrf1的4個(gè)抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）啟動(dòng)子序列結(jié)合而正調(diào)控Nrf1，從而介導(dǎo)TFAM線粒體生物發(fā)生途徑的激活[19]。同時(shí)，Nrf2調(diào)控抗氧化酶的表達(dá)，從而保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激的傷害[20]。在牙齦卟啉單胞菌LPS刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)中，Nrf2的表達(dá)降低[21]。在牙周炎的發(fā)病機(jī)制中，PMNs和巨噬細(xì)胞的免疫防御作用起了關(guān)鍵作用。健康狀態(tài)下，PMNs等防御細(xì)胞會(huì)對(duì)ROS等刺激作出反應(yīng)，引發(fā)機(jī)體防御反應(yīng)；而在疾病狀態(tài)下，PMNs會(huì)衍生過(guò)量的ROS，加劇牙周組織的炎癥反應(yīng)[22]。Sima等[22]研究發(fā)現(xiàn)：重癥牙周炎患者的PMNs 中Nrf2 通路下調(diào)。因此，Nrf2 可能是PMNs的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子，抑制PMNs對(duì)牙周致病生物膜的反應(yīng)[23]。在堿性條件下，Nrf2受到泛素蛋白酶系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）的嚴(yán)格調(diào)控，從而使Nrf2蛋白保持在低水平，防止不必要的抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄[23]。Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）是一種銜接蛋白，它與Nrf2結(jié)合并促進(jìn)其降解[24]。在氧化應(yīng)激條件下，Nrf2從Keap1中釋放出來(lái)，進(jìn)入細(xì)胞核，與小的MAF（具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)）形成異源二聚體識(shí)別靶基因的轉(zhuǎn)錄[25]。Kataoka等[26]在Keap1熒光素酶報(bào)告小鼠中發(fā)現(xiàn)：在實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型中Nrf2移位到細(xì)胞核，Nrf2核定位增加。黃芩素（baicalein，BCI）通過(guò)增加Nrf2及其下游基因（cat、gclc、sod1和sod2）的表達(dá)，減輕牙周炎合并糖尿病患者的組織損傷[27]。此外，Kanzaki等[28]發(fā)現(xiàn)：Nrf2的激活劑蘿卜硫素和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯能夠抑制破骨細(xì)胞的生成，含有細(xì)胞通透性序列的ETGE肽（seven consecutive arginine，7R-ETGE）通過(guò)誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位減少破骨細(xì)胞生成。與野生型細(xì)胞相比，Nrf2缺陷的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞中的破骨細(xì)胞分化和骨吸收顯著增強(qiáng)[29]。沉默Nrf2可增加PDLSCs的TUNEL（細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量以及caspase-9和caspase-3的活性，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)并下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)[30]。白藜蘆醇是Nrf2的有效激活劑，通過(guò)激活Nrf2/血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）介導(dǎo)的信號(hào)通路減輕炎癥反應(yīng)，同時(shí)可以改善牙周炎大鼠的牙槽骨喪失[2]。

1.3 TFAM與牙周炎的關(guān)系

TFAM主要通過(guò)與mtDNA特異性結(jié)合來(lái)調(diào)控線粒體轉(zhuǎn)錄[5,7,11]。在適當(dāng)?shù)拇碳は拢ㄈ邕\(yùn)動(dòng)刺激），PGC-1α能激活TFAM，使其導(dǎo)入線粒體DNA，上調(diào)編碼電子傳遞鏈亞單位基因的表達(dá)，使耗氧量增加，三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生成增加，線粒體含量增加[7]。在tfam基因敲除的小鼠模型中，表現(xiàn)出線粒體肥大，嵴異常和呼吸鏈功能障礙[31]。在另一個(gè)基因敲除小鼠模型中，多巴胺神經(jīng)元中的tfam基因敲除導(dǎo)致mtDNA表達(dá)減少[32]。Miyazaki等[33]發(fā)現(xiàn)：tfam基因消融小鼠表現(xiàn)出破骨細(xì)胞骨吸收功能明顯增強(qiáng)，破骨細(xì)胞的線粒體出現(xiàn)線粒體嵴的紊亂，提示線粒體功能出現(xiàn)障礙。有研究[34]顯示：成纖維細(xì)胞經(jīng)牙齦假單胞菌LPS處理后，PGC-1α和TFAM蛋白的表達(dá)水平均降低，證實(shí)牙齦假單胞菌LPS對(duì)線粒體生物發(fā)生具有下調(diào)作用。然而，目前關(guān)于TFAM與牙周炎之間明確關(guān)系的相關(guān)研究仍較少。

2 線粒體動(dòng)力學(xué)

線粒體動(dòng)力學(xué)是指線粒體經(jīng)過(guò)不斷的融合和裂變事件[4-5,9,13,35]來(lái)維持其形態(tài)及生理功能。融合過(guò)程有助于使受損線粒體含量均勻化，使線粒體壽命延長(zhǎng)。裂變導(dǎo)致線粒體斷裂，并通過(guò)選擇性自噬的方式促進(jìn)受損線粒體清除[9]。目前，線粒體分裂和融合機(jī)制中的幾個(gè)關(guān)鍵元件已被確定，即有絲分裂蛋白（mitofusin，Mfn）1、Mfn2、視神經(jīng)萎縮蛋白1（optic atrophy 1，OPA1）和動(dòng)力蛋白相關(guān)蛋白1（dynamin related protein 1，Drp-1）[13,36]。

2.1 線粒體融合相關(guān)蛋白

線粒體是由雙層膜結(jié)構(gòu)所組成的細(xì)胞器，在線粒體外膜（outer mitochondria membrane，OMM）和內(nèi)膜（inner mitochondrial membrane，IMM）上分別存在著與線粒體融合過(guò)程相關(guān)的蛋白質(zhì)。位于OMM上的Mfn1、Mfn2和位于IMM上的OPA1在線粒體融合過(guò)程中起關(guān)鍵作用[9,13,36]。OPA1在蛋白水解裂解位點(diǎn)的組成過(guò)程產(chǎn)生2種OPA1亞型，即long-OPA1（L-OPA1）和short-OPA1（S-OPA1），它們共同調(diào)節(jié)線粒體融合狀態(tài)[9]。L-OPA1形式的表達(dá)促進(jìn)了線粒體融合，S-OPA1形式的表達(dá)則促進(jìn)了線粒體的斷裂[35]。作為應(yīng)對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)，L-OPA1被蛋白水解成S-OPA1，從而誘導(dǎo)線粒體斷裂和凋亡[35]。Chen等[5]的研究結(jié)果表明：過(guò)氧化氫能顯著降低人PDLSCs中Mfn1和Mfn2的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)L-OPA1向S-OPA1的快速裂解。這些研究提示：在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的人PDLSCs凋亡過(guò)程中，線粒體功能和動(dòng)力學(xué)均明顯受損[5]。Drp1、Mfn2不僅定位于線粒體，也定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。Sharma等[37]闡述了線粒體融合機(jī)制：線粒體融合開(kāi)始于2個(gè)分離的線粒體通過(guò)外膜拴系Mfn1和Mfn 2，與OMM融合后再由OPA1蛋白介導(dǎo)線粒體IMM融合，從而導(dǎo)致2個(gè)獨(dú)立的線粒體融合。翟啟明等[38]的研究顯示：與健康組相比，炎癥刺激下PDLSCs中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)線粒體偶聯(lián)水平顯著增加，Mfn2蛋白的表達(dá)量增高，成骨能力顯著下降，說(shuō)明炎癥狀態(tài)下的PDLSCs的成骨分化能力下降與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體偶聯(lián)增強(qiáng)相關(guān)，通過(guò)下調(diào)Mfn2水平，其成骨能力得以恢復(fù)。翟啟明等[39]在另外一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)：炎癥微環(huán)境下，PDLSCs中Mfn1的表達(dá)量升高，導(dǎo)致細(xì)胞的成骨分化能力下降。該結(jié)果與上文氧化應(yīng)激狀態(tài)下PDLSCs中Mfn1和Mfn2表達(dá)降低相悖，仍需進(jìn)一步研究。

2.2 線粒體分裂相關(guān)蛋白

線粒體的分裂主要由Drp1介導(dǎo)[9,37]。Drp1主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，介導(dǎo)膜的收縮和斷裂[40]。Sharma等[37]闡述了線粒體分裂機(jī)制：線粒體分裂因子（mitochondrial fission factor，Mff）、線粒體分裂1蛋白（mitochondrial fission 1 protein，F(xiàn)is1）、線粒體動(dòng)力學(xué)蛋白49（mitochondrial dynamics protein-49，MiD49）和線粒體動(dòng)力學(xué)蛋白51（mitochondrial dynamics protein-51，MiD51）等受體蛋白招募Drp1至線粒體，Drp1在OMM上形成多聚體，進(jìn)而形成螺旋，水解三磷酸鳥(niǎo)苷（guanosine triphosphate，GTP），導(dǎo)致線粒體收縮。線粒體在裂變（分裂）和融合之間不斷經(jīng)歷形態(tài)變化，以響應(yīng)各種代謝和環(huán)境變化。如果融合和分裂之間的平衡被打破，線粒體分裂會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制Drp1活性[41]。Gan等[42]的研究表明：Drp1參與了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體功能障礙，導(dǎo)致成骨細(xì)胞損傷。Chen等[5]發(fā)現(xiàn)：用過(guò)氧化氫處理PDLSCs顯著增加了Fis1和Drp1的表達(dá)，進(jìn)一步支持線粒體分裂與PDLSCs凋亡密切相關(guān)的結(jié)論。He等[43]通過(guò)建立PDLSCs 缺氧模型發(fā)現(xiàn)：Drp1 表達(dá)顯著增高而Mfn2表達(dá)顯著降低；而通過(guò)線粒體分裂抑制劑1（mitochondrial division inhibitor 1，Mdivi-1）治療，可逆轉(zhuǎn)缺氧狀態(tài)下的線粒體碎裂，改善線粒體功能。這些研究表明，不僅是ROS，缺氧狀態(tài)也會(huì)加重牙周組織損傷，但缺氧對(duì)牙周組織的影響還處于初步探索階段。

3 線粒體自噬

線粒體自噬是一種選擇性自噬，通過(guò)形成自噬體降解受損的線粒體[9,11]，其中最著名的便是由PTEN誘導(dǎo)的假定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，Pink1）和E3泛素-蛋白連接酶（E3 ubiquitin-protein ligase，Parkin）介導(dǎo)的線粒體自噬[7]。Pink1在細(xì)胞核內(nèi)編碼并在細(xì)胞質(zhì)中合成[44]。有學(xué)者[45]提出Pink1主要定位于線粒體OMM。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的Pink1表達(dá)水平很低，幾乎檢測(cè)不到。內(nèi)源性的Pink1只有在一定的應(yīng)激條件下才有可能被檢測(cè)到[44,46]。Pink1在線粒體內(nèi)的積累主要與線粒體損傷和缺陷有關(guān)，表現(xiàn)為線粒體膜電位的喪失。膜電位喪失阻止了Pink1從OMM到達(dá)IMM，無(wú)法被相關(guān)蛋白酶降解，使全長(zhǎng)的Pink1在OMM積聚[44,46]。Okatsu等[46]研究表明：在解偶聯(lián)毒素（carbonyl cyanide-chlorophenylhydrazone，CCCP） 的 誘導(dǎo)下，與外源表達(dá)的Pink1相比，內(nèi)源性全長(zhǎng)Pink1的條帶略有上移。該研究進(jìn)一步證明，在功能障礙的線粒體中，全長(zhǎng)的Pink1在OMM積聚。Pink1在OMM積聚后，會(huì)招募Parkin以泛素化受損的線粒體[44,46]。Parkin用Pink1產(chǎn)生的磷酸泛素標(biāo)記嵌入OMM的蛋白質(zhì)，然后成為Pink1的底物，反饋放大自噬信號(hào)[9]。正常情況下，通過(guò)線粒體自噬可以清除受損的線粒體；但過(guò)量自噬可能會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡和組織損傷[47]。Yang等[47]發(fā)現(xiàn)：成骨細(xì)胞經(jīng)缺氧處理后，Pink1/Parkin在線粒體上迅速積聚并促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡；通過(guò)沉默Pink1則可顯著抑制成骨細(xì)胞凋亡。Chiricosta等[48]也發(fā)現(xiàn)，用Moringin（一種抗氧化劑）預(yù)處理PDLSCs后，Pink1的表達(dá)下調(diào)并調(diào)控相關(guān)凋亡基因的表達(dá)，從而抑制了細(xì)胞凋亡。Parkin還通過(guò)泛素化OMM上直接或間接參與線粒體自噬的許多蛋白質(zhì)，包括Mfn1/Mfn2、PGC-1α等，顯著增強(qiáng)線粒體自噬[9]。目前有關(guān)Pink1與慢性牙周炎之間的研究仍處于初級(jí)階段，需要進(jìn)一步探索。

綜上所述，線粒體質(zhì)量控制是一個(gè)十分復(fù)雜、龐大的系統(tǒng)，各級(jí)信號(hào)通路之間存在串?dāng)_。氧化應(yīng)激可能是牙周炎發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)因素，而線粒體是ROS的直接靶點(diǎn)，會(huì)進(jìn)一步加重組織損傷。本文從線粒體質(zhì)量控制的三階段闡述其與牙周炎間的關(guān)系，旨在為牙周炎的防治提供新的方向。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。