外源性直流電場(chǎng)誘導(dǎo)大鼠擴(kuò)張皮膚軟組織血管新生的作用研究

劉 天,張警泓,劉 杰,張 澤,武 潮,張家平

（1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科，重慶 400038；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院整形美容與頜面外科，重慶 400010）

擴(kuò)張皮瓣移植是整形外科用于治療大面積瘢痕與瘢痕攣縮畸形等皮膚軟組織繼發(fā)病損的重要技術(shù)[1]。通過皮膚軟組織擴(kuò)張可以獲得更大面積、更小厚度的供體皮瓣，從而獲得更好的修復(fù)質(zhì)量和效果[2]。血管危象是擴(kuò)張皮瓣移植最為常見的并發(fā)癥，直接影響手術(shù)成敗，其發(fā)生的主要原因之一是皮瓣內(nèi)血管網(wǎng)的豐度不足以維持所切取皮瓣的正常血供及代謝[3]。血管新生是在原有血管結(jié)構(gòu)上長(zhǎng)出新血管的生物學(xué)過程[4]。誘導(dǎo)擴(kuò)張皮瓣內(nèi)微小血管新生是增強(qiáng)擴(kuò)張皮瓣血供的可行策略，也是本領(lǐng)域的難點(diǎn)[5]。近年來，采用外源性電場(chǎng)促進(jìn)血管新生的研究在細(xì)胞層面已取得一定進(jìn)展[6-9]，但相關(guān)的體內(nèi)研究未見報(bào)道。本課題以SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探討外源性直流電場(chǎng)對(duì)擴(kuò)張皮膚軟組織血管新生的作用并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)4～6周齡雄性SD 大鼠24只（體質(zhì)量200～220 g），購自陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（渝）2022-0018，飼養(yǎng)于恒溫恒濕、晝夜規(guī)律標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)間。動(dòng)物手術(shù)操作環(huán)境及流程嚴(yán)格遵照陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備

異氟烷（深圳瑞沃德生命科技，R510-22-10），小動(dòng)物麻醉機(jī)（深圳瑞沃德生命科技，R500-IP），1 mL 球形硅膠皮膚擴(kuò)張器（廣州萬和整形材料），電極片（深圳創(chuàng)興禾科技，PMD1×1a），穩(wěn)壓直流電源（東莞優(yōu)利德科技，UTP1310S），光學(xué)顯微鏡（日本尼康，E200），熒光顯微鏡（德國蔡司，Axio Imager M2），酶標(biāo)儀（美國BIORAD，iMark-17562），離心機(jī)（美國Thermo賽默飛世爾，Micro 21R）。

1.3 動(dòng)物模型構(gòu)建

1.3.1 動(dòng)物分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠隨機(jī)分為直流電場(chǎng)刺激組（實(shí)驗(yàn)組）和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組大鼠又根據(jù)所施加電場(chǎng)強(qiáng)度不同分為100 mV/mm 電場(chǎng)組、200 mV/mm電場(chǎng)組和300 mV/mm電場(chǎng)組，每組6只。

1.3.2 動(dòng)物模型構(gòu)建 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物施以異氟烷麻醉，待麻醉穩(wěn)定后用剃毛機(jī)及脫毛膏嚴(yán)格術(shù)區(qū)脫毛處理，俯臥位固定。采用1 mL微型擴(kuò)張器（圖1a）在體外注水30 mL，進(jìn)行超量擴(kuò)張檢查，挑選形態(tài)完好、擴(kuò)張均勻的擴(kuò)張器用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。常規(guī)消毒鋪單后，于大鼠頸背部設(shè)計(jì)一橫向手術(shù)切口，長(zhǎng)約1.5 cm。美蘭標(biāo)記切口，切開皮膚全層，眼科剪鈍性分離皮下組織至深筋膜層，在深筋膜層鈍性分離形成皮下腔隙，腔隙前至外眥連線，后至耳前連線，兩側(cè)至顴骨邊界。將1 mL微型擴(kuò)張器置入所分離皮下腔隙，擴(kuò)張器注射壺埋置于大鼠背部，調(diào)整擴(kuò)張器位置，使其位于顱頂部中央。采用5-0 絲線全層縫合手術(shù)切口，術(shù)畢向擴(kuò)張器內(nèi)注入1 mL 無菌生理鹽水（圖1b）。術(shù)后第7 天開始，每隔3 d 在氣體麻醉下通過注射壺向擴(kuò)張器中注入1 mL 無菌生理鹽水（圖1c）。第3 次注水后(術(shù)后第13 天)，將直徑為10 mm 的正/負(fù)凝膠電極分別固定于實(shí)驗(yàn)組大鼠擴(kuò)張頭皮的頭、尾兩端，外接穩(wěn)壓直流電源，分別施加100 mV/mm、200 mV/mm 和300 mV/mm 的直流電場(chǎng)刺激，持續(xù)72 h（圖1d～f）。電場(chǎng)刺激結(jié)束后，繼續(xù)每3 d向擴(kuò)張器中注入1 mL無菌生理鹽水，共注水4次。對(duì)照組除不進(jìn)行電極刺激外，余處理同實(shí)驗(yàn)組。

圖1 大鼠頭部擴(kuò)張皮膚處構(gòu)建外源性穩(wěn)壓直流電場(chǎng)模型

1.4 明暗箱實(shí)驗(yàn)

將大鼠置于明箱中央，背對(duì)洞口，記錄10 min 內(nèi)動(dòng)物的穿箱次數(shù)以及分別在明箱和暗箱的滯留時(shí)間。

1.5 動(dòng)物處理與取材

注水?dāng)U張7 次后處死大鼠，用無菌手術(shù)刀切取凝膠電極片間的大鼠擴(kuò)張頭皮組織，部分采用4%多聚甲醛固定，行石蠟包埋、切片和HE 染色；部分組織勻漿行ELISA檢測(cè)。

1.6 樣品檢測(cè)

1.6.1 切片染色 按常規(guī)方法行HE 染色和Masson染色后，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，統(tǒng)計(jì)視野內(nèi)的血管數(shù)量。免疫熒光染色：切片經(jīng)0.01 mol/L PBS 充分洗滌后置于3% H2O2去離子水中孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化酶；加入FGF-2 一抗（1∶200）4 ℃孵育過夜，之后加入對(duì)應(yīng)熒光二抗室溫孵育1 h，采用DAPI染細(xì)胞核10 min 后封片，于熒光顯微鏡下觀察、拍照。參照文獻(xiàn)[10]中的方法行免疫組化染色，一抗為Ki67（1∶200），DAB顯色后光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6.2 ELISA 檢測(cè) 采用預(yù)冷的PBS(0.01 mol/L,pH=7.4)沖洗大鼠頭皮組織，稱重后將組織剪碎，與9 倍質(zhì)量的PBS 加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。將勻漿液5 000 g 離心5 min，取上清，根據(jù)大鼠基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell derived factor 1，SDF-1)、大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子α(vascular endothelial growth factor α，VEGF-α)ELISA 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，于450 nm 波長(zhǎng)下計(jì)算SDF-1和VEGF-α含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 23.0 軟件分析數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均采用Shapiro-Wilk法行正態(tài)性檢驗(yàn)及Levene法行方差齊性檢驗(yàn)，定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。2 組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本情況

所有動(dòng)物均麻醉滿意且耐受建模手術(shù)，術(shù)后無傷口感染、球囊破損等異常情況，擴(kuò)張器擴(kuò)張狀態(tài)良好，無漏水、破裂、移位等。施加100 mV/mm和200 mV/mm外源性直流電場(chǎng)的SD 大鼠均表現(xiàn)出良好的耐受性。其中4 只施加300 mV/mm 電場(chǎng)的SD 大鼠出現(xiàn)不同程度的間斷性抽搐、焦慮、煩躁等不適合繼續(xù)實(shí)驗(yàn)的癥狀，因而該組的后續(xù)實(shí)驗(yàn)予以終止。10 min 標(biāo)準(zhǔn)明暗箱實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，100 mV/mm 組和200 mV/mm 電場(chǎng)組大鼠的穿箱次數(shù)分別為（9.00±1.83）次和（9.83±1.57）次，提示2 組大鼠均無明顯焦慮癥狀，對(duì)所施加的外源性電場(chǎng)耐受良好。

2.2 HE和Masson染色

HE 染色：對(duì)照組大鼠頭皮組織表皮層由2～3層角質(zhì)細(xì)胞組成，平均厚度為（24.2±3.2）μm；實(shí)驗(yàn)組大鼠頭皮組織表皮層細(xì)胞數(shù)增多，100 mV/mm 組的平均厚度為（42.0±4.7）μm，200 mV/mm 組的平均厚度為（62.6±4.4）μm，均厚于對(duì)照組（P＜0.01），表皮厚度隨施加電場(chǎng)強(qiáng)度增強(qiáng)而呈增大趨勢(shì)（P＜0.01），見圖2a、b。實(shí)驗(yàn)組真皮層和真皮下層的微小血管數(shù)較對(duì)照組明顯增加（P＜0.05），其中真皮下層的微小血管增多更明顯；大鼠皮下脂肪與肌肉組織厚度較對(duì)照組明顯薄，膠原纖維排列整齊，毛囊及汗腺等皮膚附屬器官結(jié)構(gòu)完整（圖2a～d）。Masson 染色：與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組的疏松皮下膠原纖維組織減少（圖2e）。

圖2 外源性穩(wěn)壓直流電場(chǎng)施加后大鼠擴(kuò)張頭皮的組織病理學(xué)檢測(cè)

2.3 組織學(xué)免疫染色

與對(duì)照組比較，100 mV/mm 電場(chǎng)組和200 mV/mm電場(chǎng)組Ki67 染色強(qiáng)度明顯升高，量化評(píng)分顯著升高（P＜0.05），見圖3a、b。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組增多的Ki67 陽性細(xì)胞主要來源于表皮基底層矮柱狀上皮細(xì)胞、新生血管內(nèi)皮細(xì)胞以及毛囊細(xì)胞。

圖3 各組大鼠頭皮組織免疫染色結(jié)果

與對(duì)照組比較，100 mV/mm 電場(chǎng)組和200 mV/mm電場(chǎng)組FGF-2 的表達(dá)增加，F(xiàn)GF-2 陽性細(xì)胞比例均顯著增高（P＜0.05），見圖3c、d。

2.4 ELISA檢測(cè)

組織勻漿ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示：100 mV/mm 電場(chǎng)組和200 mV/mm 電場(chǎng)組的SDF-1、VEGF-α的表達(dá)量均較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05），且200 mV/mm 電場(chǎng)組VEGF-α 表達(dá)高于100 mV/mm 電場(chǎng)組（P＜0.05），見圖4。

圖4 ELISA檢測(cè)各組大鼠頭皮組織血管新生相關(guān)因子表達(dá)

3 討論

血管危象或血運(yùn)障礙是擴(kuò)張皮瓣移植術(shù)后常見的并發(fā)癥，直接關(guān)乎手術(shù)成敗和臨床預(yù)后。除外皮瓣設(shè)計(jì)不合理、皮瓣轉(zhuǎn)移后蒂部扭轉(zhuǎn)或卡頓等常見原因外，擴(kuò)張皮瓣本身的新生血管豐度不足也是導(dǎo)致擴(kuò)張皮瓣移植術(shù)后血運(yùn)障礙、皮瓣繼發(fā)壞死的重要原因，同時(shí)也是影響擴(kuò)張皮瓣擴(kuò)張效率的重要制約因素[3]。

1794 年，Luigi Galvani 首次證實(shí)“生物電”存在。1848 年，德國生理學(xué)家Emil du Bois-Reymond 首次描述了皮膚傷口內(nèi)的電流[11]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的許多生物學(xué)效應(yīng)均與生物電場(chǎng)直接相關(guān)，且生物電場(chǎng)是影響組織再生和傷口愈合的重要因素[12-13]。體外研究發(fā)現(xiàn)，與生物電場(chǎng)強(qiáng)度相當(dāng)?shù)耐庠葱噪妶?chǎng)可以有效誘導(dǎo)表皮細(xì)胞定向遷移、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖并形成新生血管[9,14]。然而，有關(guān)生物電場(chǎng)誘導(dǎo)血管新生的體內(nèi)研究目前尚處于起步階段。本研究旨在通過建立大鼠擴(kuò)張頭皮外源性直流電場(chǎng)刺激模型，探索外源性直流電場(chǎng)對(duì)擴(kuò)張皮膚及血管新生的影響與機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，在4～6 周齡的大鼠頭皮組織下埋置1 mL 的微型擴(kuò)張器，注水?dāng)U張7 次后，皮膚擴(kuò)張顯著；觀察大鼠日常活動(dòng)發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)張器擴(kuò)張過程對(duì)大鼠日?；顒?dòng)無明顯不良影響。本研究根據(jù)頭皮組織擴(kuò)張后的形態(tài)體積，定制直徑為10 mm的凝膠電極片，將正、負(fù)電極分別粘貼固定于擴(kuò)張頭皮組織的頭、尾兩端，外接穩(wěn)壓直流電源，建立SD 大鼠擴(kuò)張頭皮軟組織外源性電場(chǎng)刺激模型。前期我們?cè)陔妶?chǎng)刺激干預(yù)對(duì)巴馬香豬的創(chuàng)面愈合影響實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了100 mV/mm、200 mV/mm 和300 mV/mm 三個(gè)梯度強(qiáng)度的電場(chǎng)刺激[6]。本研究中由于300 mV/mm 電場(chǎng)組超半數(shù)的大鼠出現(xiàn)抽搐、焦慮和煩躁等刺激癥狀，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中僅觀察100 mV/mm 和200 mV/mm 電場(chǎng)擴(kuò)張皮膚軟組織的相關(guān)變化。

以往研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚軟組織擴(kuò)張過程中，機(jī)械力學(xué)刺激將顯著誘導(dǎo)組織大量分泌VEGF 和誘導(dǎo)血管新生，但隨著擴(kuò)張過程持續(xù)，VEGF 分泌和血管新生于擴(kuò)張后2 周降至正常水平[15-16]。我們也在實(shí)驗(yàn)中觀察到了同樣的現(xiàn)象。為避免擴(kuò)張過程機(jī)械力學(xué)因素對(duì)血管新生的干擾，我們將外源性電場(chǎng)的刺激時(shí)機(jī)選定為第3 次注水?dāng)U張后（術(shù)后第13 天），以客觀評(píng)估外源性直流電場(chǎng)對(duì)擴(kuò)張皮膚軟組織血管新生的作用，因此外源性直流電場(chǎng)的施加時(shí)機(jī)是本模型成功建立的另一關(guān)鍵。

Ki67 是細(xì)胞增殖標(biāo)志物，與細(xì)胞有絲分裂密切相關(guān)[17]。FGF-2 具有促血管生成作用，常被用作血管生成的指標(biāo)之一[18]。SDF-1 和VEGF-α 是兩種與血管生成密切相關(guān)的細(xì)胞因子。其中，SDF-1 具有誘導(dǎo)VEGF-α 表達(dá)的重要作用，而VEGF-α 則可激活SDF-1/CXCR4 信號(hào)軸，二者在促血管生成方面具有協(xié)同效果[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，100 mV/mm 和200 mV/mm 電場(chǎng)組大鼠真皮內(nèi)和真皮下微小血管數(shù)增加、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活躍，F(xiàn)GF-2 和VEGF-α 的表達(dá)增加，且這一作用在一定電場(chǎng)強(qiáng)度范圍內(nèi)與電場(chǎng)強(qiáng)度呈正相關(guān)，說明外源性直流電場(chǎng)可以顯著誘導(dǎo)大鼠擴(kuò)張皮膚軟組織的血管新生。FGF-2是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的核心成員，在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖并形成管腔結(jié)構(gòu)等血管化核心環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用[18-19,21]。FGF-2 和VEGF-α具有協(xié)同互補(bǔ)的作用。有研究顯示，VEGF-α 可促進(jìn)毛細(xì)血管的生成，而FGF-2 則可促進(jìn)小動(dòng)脈的生成[22]。研究報(bào)道，F(xiàn)GF-2 通過ERK 1/2 途徑促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，而VEGF-α 需在外圍間質(zhì)細(xì)胞的旁分泌功能輔助下發(fā)揮促血管生成作用，同時(shí)二者共同調(diào)節(jié)MAPK 通路的活性[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，血管新生程度高的皮膚軟組織往往伴隨表皮層明顯增厚，而表皮細(xì)胞又是FGF-2的重要來源細(xì)胞。因此，我們推測(cè)，電場(chǎng)可能通過刺激表皮細(xì)胞增殖而促進(jìn)FGF-2 的分泌，從而誘導(dǎo)血管新生，但具體機(jī)制以及血管新生和角質(zhì)細(xì)胞增殖的關(guān)系需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究成功建立了外源性直流電場(chǎng)誘導(dǎo)擴(kuò)張皮膚軟組織血管新生的動(dòng)物模型，明確了外源性直流電場(chǎng)對(duì)擴(kuò)張皮膚軟組織血管新生的促進(jìn)作用，并初步探討其機(jī)制，為采用直流電場(chǎng)誘導(dǎo)皮膚軟組織血管新生，增加擴(kuò)張皮瓣的切取面積，降低擴(kuò)張皮瓣的血管危象發(fā)生率和提高擴(kuò)張皮瓣移植存活率提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。