基于DNA條形碼的蘄蛇、烏梢蛇、金錢(qián)白花蛇及混偽品等32種的鑒別△

王孟虎，許亮，蔣磊，李峰，孫一帆，康廷國(guó)，孟祥松，張圣陽(yáng)，鐘明月，黃文康，石飄柔

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600；

2.亳州學(xué)院，安徽 亳州 236800；

3.亳州市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽 亳州 236800；

4.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 亳州 236800；

5.中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京 210000

蘄蛇（Agkistrodon）為蝰科尖吻蝮屬動(dòng)物五步蛇Agkistrodon acutus（Guenther）的干燥體，烏梢蛇（Zaocys）為游蛇科動(dòng)物烏梢蛇Zaocys dhumnades（Cantor）的干燥體，金錢(qián)白花蛇（Bungarus Parvus）為眼鏡蛇科動(dòng)物銀環(huán)蛇Bungarus multicinctusBlyth的幼蛇干燥體，具有祛風(fēng)、通絡(luò)、止痙的功效，主治風(fēng)濕頑痹、中風(fēng)、麻木拘謹(jǐn)、半身不遂等，均收載于《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》）2020年版[1]。由于野生蛇類(lèi)資源匱乏，人工養(yǎng)殖規(guī)模還未滿(mǎn)足需求，導(dǎo)致市售蛇類(lèi)藥材價(jià)格較高。市售藥材為不完整個(gè)體，常常摻雜有混偽品。為了保證用藥的安全性、維護(hù)蛇類(lèi)藥材市場(chǎng)的穩(wěn)定性，建立快速、準(zhǔn)確鑒別蘄蛇、烏梢蛇、金錢(qián)白花蛇及其易混偽品的方法具有重要意義。

DNA 條形碼由Hebert等[2-3]在2002年提出，陳士林等[4]在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了大量研究，確立了動(dòng)物類(lèi)藥材DNA條形碼細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（COⅠ）基因鑒定體系。由于該方法不受個(gè)體、環(huán)境等因素影響，能夠準(zhǔn)確、快速地對(duì)物種進(jìn)行鑒定，現(xiàn)已應(yīng)用在各動(dòng)物類(lèi)樣品的鑒定及鑒別領(lǐng)域。晁志等[5]基于DNA條形碼COⅠ基因?qū)疱X(qián)白花蛇及其8種混偽品進(jìn)行鑒定，顯示各物種均獨(dú)立聚為一支，其中游蛇科與眼鏡蛇科為姐妹群。廖倩等[6]基于DNA 條形碼COⅠ基因?qū)?3種蛇類(lèi)進(jìn)行鑒定，顯示各物種均獨(dú)立聚為一支，游蛇科與眼鏡蛇科為姐妹群，鏈蛇屬與白環(huán)蛇屬親緣關(guān)系較近，并支持前人研究中對(duì)錦蛇屬的重新劃分（玉斑錦蛇被歸類(lèi)于麗蛇屬，稱(chēng)為玉斑麗蛇；三索錦蛇被歸類(lèi)為頜腔蛇屬，稱(chēng)為三索頜腔蛇；王錦蛇仍歸屬于錦蛇屬）。黃勇等[7]基于DNA條形碼COⅠ基因?qū)?9 種蛇類(lèi)進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示灰鼠蛇有可能被錯(cuò)誤鑒定為烏梢蛇，赤練蛇種內(nèi)遺傳距離差異較大。石林春等[8]基于DNA條形碼COⅠ基因?qū)诿煎\蛇、錦蛇、烏梢蛇蛇蛻進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示該方法能夠準(zhǔn)確鑒定3 種蛇蛻。崔麗娜等[9]基于DNA 條形碼COⅠ基因?qū)疱X(qián)白花蛇及4 種偽品進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定?！吨袊?guó)藥典》2020 年版利用性狀、特異性引物對(duì)蘄蛇、烏梢蛇、金錢(qián)白花蛇及其混偽品進(jìn)行鑒別，其中設(shè)計(jì)的特異性引物能夠?qū)φ愤M(jìn)行擴(kuò)增并有單一條帶，而偽品則無(wú)條帶[1]。雖然，利用該方法能夠準(zhǔn)確鑒定蘄蛇、烏梢蛇、金錢(qián)白花蛇，但卻無(wú)法對(duì)混偽品進(jìn)行鑒定，無(wú)法獲知混偽品的基原信息。

在前人研究的基礎(chǔ)上，本課題組收集蘄蛇、烏梢蛇、金錢(qián)白花蛇及其混偽品，結(jié)合從GenBank 下載的正品及混偽品COⅠ序列構(gòu)建鄰接（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，不僅對(duì)正品及混偽品進(jìn)行鑒定，也能夠?yàn)槲锓N的分類(lèi)提供一定信息。

1 材料

1.1 儀器

T100 型PCR 擴(kuò)增儀[伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司]；DYY-7C 型電泳系統(tǒng)（北京六一生物科技有限公司）；JXFSTPRP-CL 型全自動(dòng)樣品冷凍研磨儀、JS-2000 型紫外凝膠成像儀（上海培清科技有限公司）；QH07058 型微量移液器（賽默飛世爾科技公司）；WZB-32AF/S 型制冰機(jī)（寧波惠康國(guó)際工業(yè)有限公司）；LC-JSY-1 型恒溫金屬浴、LCMini-12KSP 型離心機(jī)（上海力辰儀器科技有限公司）；SPEED×10 型混勻儀（群安實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；P70F23P-G5（B0）型微波爐（格蘭仕集團(tuán)）。

1.2 試藥

Ezup 柱式動(dòng)物基因組DNA 抽提試劑盒（批號(hào)：B518251-0301）、GelRed（批號(hào)：H902KA1483）、Marker DL 2000（批 號(hào)：B500350-0500）、5×TBE buffer（批號(hào)：B548102-0500）、雙蒸水（批號(hào)：A500197-0500）、1×TE buffer（批 號(hào)：B548106-0500）均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；瓊脂糖（批號(hào)：1110GR100，德國(guó)Biofroxx 公司）；2×TaqMaster Mix（批號(hào)：L/N 017E2201CB，南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。

1.3 樣品

蘄蛇、烏梢蛇、金錢(qián)白花蛇的混偽品較多，通過(guò)查閱《常用中藥材及混偽品種整理》[10]、《中藥材市場(chǎng)常見(jiàn)易混品種鑒別圖集》[11]、《中國(guó)中藥材真?zhèn)舞b別圖典1（常用貴重藥材、進(jìn)口藥材分冊(cè)）》[12]、《實(shí)用中藥材品種鑒別》[13]、《易混淆中藥鑒別》[14]等書(shū)籍發(fā)現(xiàn)，蘄蛇、烏梢蛇、金錢(qián)白花蛇的混偽品數(shù)量分別有16、19、11種。同時(shí)，參考《中國(guó)動(dòng)物志·爬行綱（第三卷）》[15]及在線網(wǎng)站iNaturalistGT（https://guatemala.inaturalist.org/taxa/85553-Serpentes）對(duì)各物種的分類(lèi)學(xué)信息進(jìn)行分析，最終確定各物種拉丁學(xué)名并在GenBank下載各物種COⅠ堿基序列。將記載蘄蛇、烏梢蛇、金錢(qián)白花蛇各自對(duì)應(yīng)的混偽品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表1）。分別從安徽亳州、河北安國(guó)、成都荷花池藥材市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)金錢(qián)白花蛇、蘄蛇、烏梢蛇及其混偽品，所有樣品均經(jīng)亳州學(xué)院孟祥松主任中藥師鑒定，存放在亳州學(xué)院冷庫(kù)內(nèi)，樣品信息見(jiàn)表2。

表1 蘄蛇、烏梢蛇、金錢(qián)白花蛇的混偽品

表2 蘄蛇、烏梢蛇、金錢(qián)白花蛇及其混偽品

2 方法

2.1 DNA提取

取樣品蛇肌肉組織，用75%乙醇擦拭滅菌后用手術(shù)剪剪碎，低溫冷凍研磨儀研磨，取粉末約20 mg，使用Ezup 柱式動(dòng)物基因組DNA 抽提試劑盒提取總DNA，具體操作步驟按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。

2.2 PCR擴(kuò)增和電泳條件

擴(kuò)增的序列的引物為動(dòng)物COⅠ基因通用引物，正向引物：LCO1490 5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，反向引物：HCO21985′-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′。PCR 反應(yīng)體系為50 μL，體系內(nèi)含引物對(duì)各1.0 μL（10 μmol·L-1），2×TaqMaster Mix 25 μL，模板1 μL，加雙蒸水補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增程序參考《中國(guó)藥典》2020年版（四部）[16]，為95 ℃，3 min；94 ℃，40 s，45 ℃，30 s，72 ℃，30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。4 ℃短期保存，-20 ℃長(zhǎng)期保存。

2.3 序列測(cè)序及數(shù)據(jù)處理

取PCR 產(chǎn)物5 μL，用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳電壓為100 V，電泳時(shí)間為35 min，Marker 為DL2000，將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，得到正、反堿基序列，利用CodonCodeAligner 11.0.1查看峰圖并進(jìn)行雙向拼接，去除低質(zhì)量區(qū)及引物區(qū)，獲得目標(biāo)堿基序列。從GenBank下載32種蛇類(lèi)COⅠ基因序列，為保證下載堿基序準(zhǔn)確性，所有下載堿基均經(jīng)Blast 檢索和BOLD 平臺(tái)驗(yàn)證，鑒定率均達(dá)到99%以上（表3）。

表3 蘄蛇、烏梢蛇、金錢(qián)白花蛇及其混偽品的GenBank登錄號(hào)

2.4 種間信息位點(diǎn)

利用MEGA 11.0 軟件對(duì)蘄蛇、烏梢蛇、金錢(qián)白花蛇測(cè)序獲得的COⅠ基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，獲得三者的簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。將實(shí)驗(yàn)測(cè)得蘄蛇、烏梢蛇、金錢(qián)白花蛇與混偽品種堿基序列和表3 中堿基序列進(jìn)行比對(duì)，分別獲得蘄蛇、烏梢蛇、金錢(qián)白花蛇與其各自對(duì)應(yīng)混偽品的簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。

2.5 種間遺傳距離

利用MEGA 11.0 軟件將所測(cè)物種的COⅠ序列與從GenBank 下載的堿基序列進(jìn)行遺傳距離比對(duì)分析，獲得各物種種間、種內(nèi)遺傳距離。

2.6 構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)

利用MEGA 11.0 軟件將所測(cè)物種的COⅠ序列與從GenBank 下載的堿基序列構(gòu)建NJ 系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)，同時(shí)以自舉檢驗(yàn)法（Bootstrap）檢驗(yàn)聚類(lèi)樹(shù)各分支的支持率，自展次數(shù)設(shè)置為1000次。

3 結(jié)果

3.1 種間信息位點(diǎn)

將測(cè)序獲得的蘄蛇、烏梢蛇、金錢(qián)白花蛇COⅠ基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，蘄蛇與烏梢蛇、金錢(qián)白花蛇分別有134、135 個(gè)信息位點(diǎn)，烏梢蛇與金錢(qián)白花蛇有117個(gè)信息位點(diǎn)，三者共有189個(gè)信息位點(diǎn)；蘄蛇、烏梢蛇、金錢(qián)白花蛇與其對(duì)應(yīng)的混偽品分別有253、265、233 個(gè)信息位點(diǎn)，三者種內(nèi)信息位點(diǎn)分別有27、28、13個(gè)。

3.2 遺傳距離分析

將測(cè)序獲得的COⅠ堿基序列與從GenBank下載的堿基序列進(jìn)行比對(duì)分析，由于物種數(shù)量較多，表3 的序號(hào)對(duì)應(yīng)的物種只展示種間遺傳距離及種內(nèi)平均遺傳距離，各物種種間遺傳距離均大于0.100，種內(nèi)遺傳距離均小于0.056，蘄蛇、烏梢蛇、金錢(qián)白花蛇及其混偽品物種平均種內(nèi)、種間遺傳距離見(jiàn)增強(qiáng)出版附加材料。

3.3 NJ系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)

將所測(cè)樣本序列與從GenBank 下載的堿基序列進(jìn)行比對(duì)分析并構(gòu)建NJ 系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)，如圖1 所示，蘄蛇、金錢(qián)白花蛇、烏梢蛇均獨(dú)立聚為一支，三者分別歸屬于蝰科、眼鏡蛇科、游蛇科，與科內(nèi)其他混偽品種均獨(dú)立聚為一支，說(shuō)明基于COⅠ序列不僅能夠鑒別蘄蛇、金錢(qián)白花蛇、烏梢蛇，還能夠鑒別可能科內(nèi)其他物種。所有的樣品均為蝰科、眼鏡蛇科、游蛇科科內(nèi)物種，但基于3 科物種的NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示并未聚為三大支，其中游蛇科有14 屬21種，科內(nèi)物種并未聚為一支，華游蛇屬（赤鏈華游蛇、環(huán)紋華游蛇）及腹鏈蛇屬（草腹鏈蛇）與蝰科聚為一大支；林蛇屬（黃環(huán)林蛇）及頸棱蛇屬（頸棱蛇）與眼鏡蛇科聚為一大支；水蛇屬（寬吻水蛇）、鉛色蛇屬（鉛色水蛇）、沼蛇屬（中國(guó)沼蛇）、漁游蛇屬（漁游蛇）并未與其他游蛇科物種聚為一大支；錦蛇屬玉斑錦蛇、百花錦蛇、黑眉錦蛇并未聚為一支，而是玉斑錦蛇與滯卵蛇屬聚為一小支，百花錦蛇與黑眉錦蛇并未聚為一小支。

圖1 蘄蛇、烏梢蛇、金錢(qián)白花蛇NJ系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)

4 討論

根據(jù)NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，除沼蛇屬中國(guó)沼蛇未聚為一支外，其余各物種均獨(dú)立聚為一支。中國(guó)沼蛇種內(nèi)遺傳距離為0.018，而赤鏈蛇、山烙鐵頭、王錦蛇、中介蝮種內(nèi)遺傳距離分別為0.022、0.056、0.019、0.018，均不小于0.018 且均聚為一支，這可能是由于中國(guó)沼蛇位于聚類(lèi)樹(shù)外圍導(dǎo)致的。蝰科與游蛇科華游蛇屬、腹鏈蛇屬聚為一支，且游蛇科華游蛇屬、腹鏈蛇屬與游蛇科其他屬相距較遠(yuǎn)，顯示華游蛇屬（赤鏈華游蛇、環(huán)紋華游蛇）、腹鏈蛇屬（草腹鏈蛇）與蝰科更近的親緣關(guān)系。眼鏡蛇科與游蛇科（林蛇屬、頸棱蛇屬）聚為一支并與游蛇科、蝰科并列聚類(lèi)，顯示了林蛇屬黃環(huán)林蛇、頸棱蛇屬頸棱蛇與眼鏡蛇科有更近的親緣關(guān)系。眼鏡蛇科與蝰科為姐妹群，說(shuō)明眼鏡蛇科與蝰科親緣關(guān)系較近?！吨袊?guó)動(dòng)物志·爬行綱（第三卷）》將紅紋滯卵蛇、玉斑錦蛇、王錦蛇、百花錦蛇、黑眉錦蛇都?xì)w屬為錦蛇屬[15]，而根據(jù)在線網(wǎng)站可知紅紋滯卵蛇歸屬為滯卵蛇屬，王錦蛇歸屬為玉斑蛇屬，玉斑錦蛇、百花錦蛇、黑眉錦蛇歸為錦蛇屬，NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)支持該物種在線網(wǎng)站中的最新歸屬，但錦蛇屬內(nèi)玉斑錦蛇、百花錦蛇、黑眉錦蛇并未聚為一支?！吨袊?guó)動(dòng)物志·爬行綱（第三卷）》將烏梢蛇歸屬為烏梢蛇屬，白環(huán)蛇歸屬為白環(huán)蛇屬，赤鏈蛇歸屬為赤鏈蛇屬，黑背白環(huán)蛇及雙全白環(huán)蛇歸屬為白環(huán)蛇屬[15]，在線網(wǎng)站將烏梢蛇歸屬為鼠蛇屬，白環(huán)蛇、赤鏈蛇、黑背白環(huán)蛇、雙全白環(huán)蛇歸屬為白環(huán)蛇屬，NJ 系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)均支持在線網(wǎng)站中的最新物種歸屬。

以上說(shuō)明，基于DNA 條形碼COⅠ基因能夠?qū)?2 種蛇類(lèi)進(jìn)行鑒定，赤鏈華游蛇、環(huán)紋華游蛇、草腹鏈蛇歸屬為蝰科和黃環(huán)林蛇、頸棱蛇歸屬為眼鏡蛇科有待進(jìn)一步研究；錦蛇屬玉斑錦蛇、百花錦蛇、黑眉錦蛇歸屬有待一進(jìn)步研究；蝰科、眼鏡蛇科、游蛇科聚為一大支，與寬吻水蛇、鉛色水蛇、中國(guó)沼蛇、漁游蛇并列聚類(lèi)，這4 個(gè)物種獨(dú)立于蝰科、眼鏡蛇科、游蛇科，其種屬分類(lèi)有待進(jìn)一步研究。