碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制與治療現(xiàn)狀

俞 蕙

復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院感染傳染科（上海 201102）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA)又稱綠膿桿菌，屬于假單胞菌屬，革蘭陰性桿菌，是導(dǎo)致免疫力低下的住院患者和囊性纖維化患者感染的主要原因。近年來(lái)隨著碳青霉烯類抗生素廣泛用于控制PA 嚴(yán)重感染，以及PA 復(fù)雜的耐藥機(jī)制，碳青霉烯類耐藥銅綠假單孢菌(carbapenem resistantPseudomonas aeruginosa，CRPA) 已開始大規(guī)模出現(xiàn)，世界衛(wèi)生組織(WHO)在2017年將CRPA列為急需開發(fā)新型抗生素治療其感染的三種細(xì)菌之一[1]，以突出其在臨床上的嚴(yán)峻形勢(shì)。兒童免疫力低下，細(xì)菌感染導(dǎo)致的危害更為嚴(yán)重，因此充分了解CRPA的耐藥機(jī)制及治療現(xiàn)狀，加強(qiáng)對(duì)CRPA 的管理尤為重要。

1 CRPA在兒童群體中的流行現(xiàn)狀

根據(jù)中國(guó)兒童細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)組（The Infectious Disease Surveillance of Pediatrics，ISPED）對(duì)兒童細(xì)菌耐藥的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)[2]，雖然PA 對(duì)美羅培南的耐藥率呈下降趨勢(shì)（從2016 年的15.8%下降至2020 年的6.1%），但在美國(guó)兒童群體中，CRPA 的比例從1999年的9.4%增加到2012年的20%[3]，在歐洲兒科患者中，從2004—2012年到2013—2018年，PA對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥率顯著增加（從9.1%到12.4%）[4]。

2 PA對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥機(jī)制

PA 對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制可分為內(nèi)在性、獲得性和適應(yīng)性。內(nèi)在性耐藥機(jī)制指細(xì)菌通過(guò)自身固有的結(jié)構(gòu)和功能對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥[5]，包括外膜通透性降低、外排泵過(guò)度表達(dá)、產(chǎn)生抗生素滅活酶。獲得性耐藥機(jī)制指細(xì)菌通過(guò)遺傳元件的水平轉(zhuǎn)移和基因變異獲得抗生素耐藥性。適應(yīng)性耐藥機(jī)制是指細(xì)菌在抗生素或其他環(huán)境因素的刺激下某些基因和/或蛋白的暫時(shí)改變，且這種改變是可逆的，主要指生物膜的形成。

2.1 內(nèi)在性耐藥機(jī)制

2.1.1 外膜通透性降低 革蘭陰性桿菌的外膜是由磷脂和脂多糖構(gòu)成的不對(duì)稱雙分子層，雖可選擇性防止抗生素穿透，但抗生素仍可通過(guò)內(nèi)嵌的孔道蛋白進(jìn)入細(xì)菌?？椎赖鞍字饕? 類：非特異性孔蛋白，允許小的親水性分子緩慢擴(kuò)散；特定孔蛋白，具有結(jié)合特定分子的特定位點(diǎn)；門控孔蛋白，是離子調(diào)節(jié)的外膜蛋白，負(fù)責(zé)攝取離子復(fù)合物；外排孔蛋白，外排泵的重要組成部分。在PA中，OprF蛋白是主要的非特異性孔蛋白；特定孔蛋白主要包括OprB、OprD、OprE、OprO和OprP；OprC和OprH屬于門控孔蛋白類；外排孔蛋白包括OprM、OprN 和OprJ[6]。導(dǎo)致PA對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的主要包括OprD 和外排孔蛋白，OprD 含有碳青霉烯類抗生素的結(jié)合位點(diǎn)，其缺乏會(huì)導(dǎo)致其對(duì)碳青霉烯類抗生素，特別是亞胺培南產(chǎn)生耐藥性[7]。關(guān)于外排孔蛋白將在外排泵過(guò)度表達(dá)部分展開。

2.1.2 外排泵過(guò)表達(dá) 細(xì)菌可以通過(guò)外排泵系統(tǒng)將進(jìn)入胞內(nèi)的抗菌藥物泵出胞外，從而使菌體內(nèi)藥物濃度降低而導(dǎo)致耐藥。外排泵系統(tǒng)主要包括RND 家族、MFS 超家族、ABC 超家族、SMR 家族、MATE 家族。與PA 耐藥性相關(guān)的主要是RND 家族，其由內(nèi)膜蛋白、連接蛋白、外膜蛋白（即外排孔蛋白）組成[8]。PA共表達(dá)12個(gè)RND系列外排泵，其中4個(gè)（MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN和MexXY-OprM）與其耐藥性密切相關(guān)[9]。MexABOprM過(guò)表達(dá)導(dǎo)致PA對(duì)美羅培南耐藥，報(bào)道往往顯示MexAB-OprM過(guò)表達(dá)和OprD缺乏相結(jié)合使PA對(duì)碳青霉烯類抗生素均產(chǎn)生高度耐藥性。Hassuna等[10]檢測(cè)到634株CRPA中MexCD-OprJ、MexXY-OprM的表達(dá)率分別為75%、62%，顯示PA對(duì)美羅培南和亞胺培南的耐藥率與MexXY-OprM和MexCD-OprJ外排泵表達(dá)呈高度正相關(guān)。

2.1.3 抗生素滅活酶的產(chǎn)生 許多抗生素具有易于水解的化學(xué)鍵，而細(xì)菌產(chǎn)生的可以水解或修飾這些抗生素內(nèi)在結(jié)構(gòu)使之失活的滅活酶正是細(xì)菌內(nèi)在耐藥性的重要組成部分。CRPA 產(chǎn)生的抗生素滅活酶主要是碳青霉烯酶，分布在A、B、D類β-內(nèi)酰胺酶中。B類金屬酶主要包括IMP、VIM、NDM、SPM、GIM、FIM、SIM、DIM 等類型。其中，IMP、VIM 和NDM-1 是導(dǎo)致對(duì)所有碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因，而有關(guān)VIM-2的報(bào)道最頻繁。在A類β-內(nèi)酰胺酶中，最常見的是KPC型碳青霉烯酶及GES型碳青霉烯酶。而D類β-內(nèi)酰胺酶中，文獻(xiàn)報(bào)道的包括OXA-40、OXA-48、OXA-181和OXA-198[11]。在一項(xiàng)全球前瞻性隊(duì)列研究中，972株CRPA分離株中211 株(22%)檢出碳青霉烯酶基因，其中blaKPC-2最為常見，在83 株菌(39%的產(chǎn)碳青霉烯酶CRPA 分離株)中作為唯一的碳青霉烯酶基因，在20株菌(9%的產(chǎn)碳青霉烯酶CRPA分離株)中與blaVIM-2同時(shí)存在。52株菌(25%產(chǎn)碳青霉烯酶的CRPA菌株)唯一碳青霉烯酶基因?yàn)閎laVIM-2。其他常見的碳青霉烯酶基因有blaNDM-1、blaIMP-1和blaGES-5。只有1 株菌含有D 類碳青霉烯酶基因(blaOXA-23)[12]。此外尚有新型碳青霉烯酶不斷出現(xiàn)，如Schauer 等[13]報(bào)道的新型A 類碳青霉烯酶GPC-1，這也為臨床診斷識(shí)別和治療不斷帶來(lái)新的挑戰(zhàn)。

除了碳青霉烯酶，Ampc 酶在PA 對(duì)碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生耐藥中同樣發(fā)揮重大作用，Yin 等[14]對(duì)141株碳青霉烯類抗生素耐藥的PA進(jìn)行基因分析時(shí)，96株(68.09%)AmpC過(guò)表達(dá)，12株(8.51%)菌株表現(xiàn)為臨界性增加，表明在Ampc 酶的高產(chǎn)量同樣會(huì)導(dǎo)致此類耐藥產(chǎn)生。

2.2 獲得性耐藥機(jī)制

2.2.1 水平基因轉(zhuǎn)移 抗生素耐藥基因可以攜帶在質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子和前噬菌體上，細(xì)菌可以通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移從相同或不同的細(xì)菌物種獲得這些基因[15]。上文所述的主要碳青霉烯酶的基因都是由遺傳元件攜帶的，包括整合子和質(zhì)粒。在目前發(fā)現(xiàn)的6 種耐藥相關(guān)整合子中，Ⅰ類整合子因攜帶耐藥基因繁多而被廣泛關(guān)注。PA 中，除了blaSPM-1、blaNDM-1和blaKPC-2，大多數(shù)獲得性碳青霉烯酶存在于Tn402類轉(zhuǎn)座子的I類整合子上，且大多數(shù)攜帶碳青霉烯酶基因的整合子都含有介導(dǎo)對(duì)其他抗生素耐藥的基因盒，導(dǎo)致CRPA 菌株的產(chǎn)生[16]。目前已報(bào)道多種在PA發(fā)現(xiàn)的攜帶碳青霉烯酶基因的相關(guān)質(zhì)粒，如攜帶blaVIM-2的質(zhì)粒pJB12[17]和質(zhì)粒pS04 90[18]、攜帶blaIMP-9的質(zhì)粒pOZ 176[19]等。碳青霉烯酶與整合子和質(zhì)粒之間的密切關(guān)聯(lián)，使耐藥性得以快速傳播。

2.2.2 基因變異 PA能夠通過(guò)染色體突變對(duì)所有類別的抗生素產(chǎn)生耐藥性，突變可以導(dǎo)致抗生素靶標(biāo)的修飾、外膜通透性降低、外排泵過(guò)表達(dá)以及抗生素滅活酶的過(guò)度產(chǎn)生，從而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性獲得或增加。在慢性囊性纖維化患者中，患者通常感染抗生素敏感的PA分離株，該分離株在長(zhǎng)期感染和治療過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致病情惡化[20]。

2.3 適應(yīng)性耐藥機(jī)制——生物膜形成

生物膜介導(dǎo)的耐藥機(jī)制包括形成胞外屏障導(dǎo)致抗生素穿透性差、胞外微環(huán)境改變導(dǎo)致生物膜中的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)限制和生長(zhǎng)緩慢、誘導(dǎo)適應(yīng)性應(yīng)激反應(yīng)和持留菌（persistent cell）的形成[21]。持留菌形成是一種抗生素存在下的表型變異，沒(méi)有耐藥基因，但卻對(duì)高濃度抗生素有耐受性。其處于關(guān)閉抗生素靶標(biāo)合成通路的休眠狀態(tài)，可以躲避抗生素的殺傷作用，并在移除抗生素后重新繁殖形成生物膜，是PA慢性感染遷延不愈的主要原因[22]。PA 生物膜的形成受多因素調(diào)控，包括群體感應(yīng)系統(tǒng)、Gacs/GacA和RetS/LadS 雙組分調(diào)控系統(tǒng)（TCS）、胞外多糖和cdi-GMP[23]。群體感應(yīng)是細(xì)菌之間的信號(hào)傳遞機(jī)制，細(xì)菌通過(guò)分泌信號(hào)分子感應(yīng)周圍環(huán)境中同類細(xì)菌的群體密度變動(dòng)，當(dāng)信號(hào)分子的濃度達(dá)到一定閾值就會(huì)啟動(dòng)菌體內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，改變生理特性，控制生物膜形成的速率和范圍。PA擁有3個(gè)主要的群體感應(yīng)系統(tǒng)：LasI-LasR、RhlI-RhlR和PQS-MvfR，所有這些系統(tǒng)都有助于生物膜的形成[22]。GacA是一種具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，它控制編碼2個(gè)小的非編碼RNA——RsmY和RsmZ靶基因的表達(dá)，其高表達(dá)顯著促進(jìn)生物膜的形成[24]。在gacs突變體中，缺乏這些sRNA 的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致生物膜形成受損[25]。PA中，這兩個(gè)sRNA的表達(dá)受一個(gè)復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的控制，該網(wǎng)絡(luò)不僅涉及Gacs/GacA TCS，而且還涉及其他TCS途徑：RetS通過(guò)干擾Gacs/GacA TCS活性來(lái)抑制rsmY和rsmZ基因的表達(dá)；PA1611通過(guò)抵消RetS對(duì)GACS的干擾效應(yīng)，誘導(dǎo)這兩個(gè)基因的表達(dá)；LsdS已被證明能激活rsmZ基因的表達(dá)[24]。另外3種不同的胞外多糖（Psl、Pel 和藻酸鹽）在生物膜的形成和維持中也發(fā)揮著重要作用。環(huán)狀di-GMP（c-di-GMP）是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的第二信使，可以協(xié)調(diào)從活動(dòng)性到靜止的“生活方式轉(zhuǎn)變”。目前已普遍認(rèn)為在PA細(xì)胞中高濃度c-di-GMP與生物膜形成之間的相關(guān)性[26]。對(duì)這些調(diào)控生物膜形成因素的深入認(rèn)識(shí)有助于對(duì)CRPA 耐藥機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，并為研制新型藥物開發(fā)新思路。

3 CRPA的治療現(xiàn)狀

目前針對(duì)CRPA感染的治療藥物選擇較為有限，大多推薦采用新型β內(nèi)酰胺類抗生素或聯(lián)合用藥方案治療。2022年美國(guó)感染病學(xué)會(huì)對(duì)難治性耐藥PA感染的治療指導(dǎo)[27]指出：治療對(duì)碳青霉烯類藥物不敏感但對(duì)傳統(tǒng)β內(nèi)酰胺類藥物敏感的PA引起的感染，建議選擇傳統(tǒng)β 內(nèi)酰胺類藥物大劑量延長(zhǎng)輸注時(shí)間，治療對(duì)碳青霉烯類耐藥但對(duì)傳統(tǒng)β內(nèi)酰胺類藥物敏感的PA 引起的中重度感染或感染源控制不佳的患者，可使用新型β內(nèi)酰胺類藥物（如頭孢洛扎-他唑巴坦、頭孢他啶-阿維巴坦、亞胺培南-西司他丁-雷利巴坦，若藥敏結(jié)果顯示敏感）。另外，如果對(duì)首選的新型β內(nèi)酰胺類抗菌藥物體外藥敏顯示敏感，不推薦常規(guī)的聯(lián)合抗菌藥物治療CRPA 引起的感染，會(huì)增加抗菌藥物相關(guān)不良事件的可能性。但如果CRPA 對(duì)所有首選藥物均不敏感，可考慮一種敏感的氨基糖苷類聯(lián)合頭孢洛扎-他唑巴坦、頭孢他啶-阿維巴坦或亞胺培南-西司他丁-雷利巴坦，優(yōu)先選擇最小抑菌濃度最接近其敏感性臨界點(diǎn)的β內(nèi)酰胺類-β 內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑。如果體外藥敏顯示對(duì)氨基糖苷類也均不敏感，可考慮多黏菌素B聯(lián)合β內(nèi)酰胺類-β內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑。《中國(guó)銅綠假單胞菌下呼吸道感染診治專家共識(shí)》[28]同樣指出，對(duì)于CRPA所致的肺部感染，若藥敏試驗(yàn)顯示其對(duì)頭孢他啶/阿維巴坦、頭孢洛扎/他唑巴坦、亞胺培南-西司他丁/雷利巴坦、美羅培南/法硼巴坦等新型酶抑制劑復(fù)合制劑敏感，仍然選擇其作為一線選擇；二線治療可選擇頭孢地爾。在上述藥物不可及或者不能耐受的情況下，可考慮使用以多黏菌素類藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合治療（如具有抗PA活性的β內(nèi)酰胺類、環(huán)丙沙星、磷霉素等）。不同的是，歐洲臨床微生物學(xué)和傳染病學(xué)會(huì)（ESCMID）治療耐多藥革蘭陰性桿菌感染的指南[29]提出，對(duì)于非重度感染或低風(fēng)險(xiǎn)CRPA 感染的患者，推薦使用傳統(tǒng)的具有體外抗菌活性的單藥治療，當(dāng)發(fā)生嚴(yán)重感染時(shí)，可選用多黏菌素、氨基糖苷類或磷霉素中的兩種體外活性藥物聯(lián)合治療。

氨曲南是目前唯一對(duì)B 類金屬酶水解穩(wěn)定的β-內(nèi)酰胺類藥物，由于作用于細(xì)菌細(xì)胞壁的不同靶位，將其與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑進(jìn)行組合，于產(chǎn)碳青霉烯酶的耐藥革蘭陰性菌而言，是可予以期待的治療方案。已有研究報(bào)道成功使用氨曲南聯(lián)合頭孢他啶-阿維巴坦治愈僅對(duì)阿米卡星和黏菌素敏感的產(chǎn)NDM-1和AmpC高表達(dá)的PA感染肺炎患者的臨床案例[30]。目前我國(guó)指南中雙β 內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用的推薦方案中多包含氨曲南，如哌拉西林-他唑巴坦+氨曲南、頭孢他啶+氨曲南、頭孢吡肟+氨曲南[31]。

另外，2017年《廣泛耐藥革蘭陰性菌感染的實(shí)驗(yàn)診斷、抗菌治療及醫(yī)院感染控制：中國(guó)專家共識(shí)》[31]也指出，感染控制不佳時(shí)可選用三藥聯(lián)合方案，如多黏菌素+β 內(nèi)酰胺類+環(huán)丙沙星、多黏菌素+β 內(nèi)酰胺類+磷霉素、多黏菌素靜脈滴注+碳青霉烯類+多黏菌素霧化吸入、氨曲南+頭孢他啶+阿米卡星。

在細(xì)菌耐藥已經(jīng)成為臨床醫(yī)學(xué)、公共衛(wèi)生安全所關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題的背景下，PA對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥問(wèn)題日益突出，不僅耐藥機(jī)制繁多，而且大部分CRPA 的產(chǎn)生是由多種機(jī)制共同介導(dǎo)的，同時(shí)耐藥基因的轉(zhuǎn)移和變異也大大增加了耐藥性的快速傳播，為臨床識(shí)別和治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。新型β 內(nèi)酰胺類抗生素的出現(xiàn)很大程度上解決了這一難題，但目前已有關(guān)于耐頭孢他啶-阿維巴坦等新型抗生素的PA出現(xiàn)的相關(guān)報(bào)道，因此新藥研發(fā)的腳步仍然不能停歇。