蘋婆炭疽病病原菌生物學(xué)特性及室內(nèi)毒力測定*

王 成 趙丹陽 扈麗麗 趙 奕 高成龍 張心結(jié)陳詩琦 黃華毅

（1.廣東省龍眼洞林場，廣東 廣州 510520；2.廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省林業(yè)科學(xué)研究院，廣東 廣州510520；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510642）

蘋婆Sterculia monosperma隸屬于錦葵科Malvaceae 蘋婆屬Sterculia，是常綠的木本淀粉植物，又稱鳳眼果﹑枇杷果﹑富貴子﹑九層皮﹑潘安子等[12]。在我國主要分布于廣東﹑廣西﹑臺灣﹑福建﹑云南﹑貴州等地，國外印度﹑越南﹑印度尼西亞﹑日本也均有種植[3-4]。蘋婆種子營養(yǎng)價值高，具有重要保健作用和藥用價值；樹液富含樹膠，可作為工業(yè)原料；樹皮富含纖維，可作為造紙?jiān)匣蛴糜谥谱髀榇p繩索及人造棉等。蘋婆枝葉茂盛﹑樹冠整齊﹑花果奇特，具有較高的觀賞價值，根系發(fā)達(dá)﹑適應(yīng)性強(qiáng)，適宜作為行道樹和景觀樹[1-2,5-9]。

目前，已報道的蘋婆主要病害有煤煙病和炭疽病[10]，蘋婆在溫暖多雨季節(jié)多發(fā)炭疽病，造成葉枯﹑脫落現(xiàn)象，發(fā)病時其老葉的病變呈圓形或不規(guī)則形狀的褐色或灰白色病斑；在嫩葉上，病斑為黃褐色，從葉尖邊緣迅速蔓延到葉片上，形成大的壞死病變，干燥并最終脫落，嚴(yán)重影響其光合作用[4]。蘋婆炭疽病的病原菌于2019 年首次從廣西分離獲得，最終鑒定為暹羅炭疽菌Colletotrichum siamense。2020 年在廣西的假蘋婆Sterculia lanceolata上也發(fā)現(xiàn)了該病原菌導(dǎo)致的炭疽病[11]。目前，有關(guān)蘋婆炭疽病的病原菌暹羅炭疽菌的生物學(xué)特性研究尚未見報道。本研究為了明確蘋婆炭疽病的病原菌暹羅炭疽菌的生物學(xué)特性和有效防治的化學(xué)藥劑，測定了該病原菌的生物學(xué)特性，并篩選出高效的防治藥劑，為蘋婆炭疽病的有效防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和培養(yǎng)基

1.1.1 菌株 蘋婆炭疽病的病原菌暹羅炭疽菌C.siamense菌株P(guān)T-2 由廣東省林業(yè)科學(xué)研究院分離﹑純化并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基和查彼（Czapek）培養(yǎng)基的配制參考方中達(dá)[12]的方法。查氏培養(yǎng)基（碳源）：碳源3.00 g﹑磷酸氫二鉀1.00 g﹑氯化鉀0.50 g﹑硫酸鎂（Mg-SO4·7H2O）0.50 g﹑硫酸鐵（FeSO4）0.01 g﹑硝酸鈉2.00 g﹑瓊脂17.00 g﹑蒸餾水1.00 L。查氏培養(yǎng)基（氮源）：氮源2.00 g﹑磷酸氫二鉀1.00 g﹑氯化鉀0.50 g﹑硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.50 g﹑硫酸鐵（FeSO4）0.01 g﹑蔗糖30.00 g﹑瓊脂17.00 g﹑蒸餾水1.00 L。

1.2 供試藥劑

98%溴菌腈﹑97%嘧霉胺﹑95%啶酰菌胺﹑98%嘧菌酯﹑96.8%苯醚甲環(huán)唑和98%福美雙原藥粉末均由中國農(nóng)科院植保所廊坊農(nóng)藥廠生產(chǎn)。

1.3 菌株生物學(xué)特性測定

1.3.1 菌株對碳、氮源的利用 以Czapek 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用等量的9 種碳源﹑氮源置換其中的蔗糖和硝酸鈉[13]，倒平板（直徑9 cm，下同），然后用6 mm 無菌打孔器從菌株P(guān)T-2 菌落邊緣取菌餅，并分別接種至不同碳﹑氮源的培養(yǎng)基中央，以不加碳﹑氮源為對照，28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)7 d，7 d 后觀察病原菌的生長 ，并采用十字交叉法測量菌落直徑，每處理重復(fù)3 次，下同。

1.3.2 pH 值對菌株生長的影響 將PDA 培養(yǎng)基的pH 值用1 mol·L-1鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)整為4.0﹑5.0﹑6.0﹑7.0﹑8.0﹑9.0﹑10.0﹑11.0﹑12.0﹑13.0 共10 個處理。然后用6 mm 無菌打孔器從菌株P(guān)T-2 菌落邊緣取菌餅，分別接種至不同pH 值的PDA 培養(yǎng)基中央，28 ℃培養(yǎng)7 d 后，觀察病原菌的生長情況并測量菌落直徑。

1.3.3 光照對菌株生長的影響 用6 mm 無菌打孔器從菌株P(guān)T-2 菌落邊緣取菌餅，接種至PDA 培養(yǎng)基中央，分別置于24 h 光照﹑12 h 光暗交替﹑24 h 黑暗條件下28 ℃恒溫培養(yǎng)，7 d 后觀察病原菌的生長情況并測量菌落直徑[14]。

1.3.4 菌株致死溫度的測定 用無菌打孔器從菌株P(guān)T-2 菌落邊緣打取直徑6 mm 的菌餅，挑入裝有1.5 mL 無菌水的2 mL 離心管中，分別置于35﹑40﹑45﹑50﹑55 和60 ℃的金屬浴中加熱10 min，后將菌餅接種至PDA 培養(yǎng)基平板中央，28 ℃培養(yǎng)，觀察病原菌是否生長。

1.3.5 溫度對菌株的影響 用6 mm 無菌打孔器從菌株P(guān)T-2 菌落邊緣取菌餅，接種至PDA 培養(yǎng)基平板中央，分別置于5﹑10﹑15﹑20﹑25﹑28﹑30﹑35﹑40﹑45 和50 ℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)，7 d 后觀察病原菌的生長并測量菌落直徑。

1.4 菌株室內(nèi)藥劑篩選

暹羅炭疽菌的室內(nèi)藥劑篩選采用菌絲生長速率法。使用30%二甲基亞砜（DMSO）溶液復(fù)溶供試的6 種藥劑原藥粉末，分別設(shè)置成5 個質(zhì)量濃度（T1～T5)，并分別與PDA 培養(yǎng)基混合后制成帶藥平板，每個帶藥平板中含有10 mL 混合了藥劑的PDA 培養(yǎng)基，以PDA 培養(yǎng)基中加入等量30%DMSO 溶液為對照。藥劑名稱及濃度見表1。用6 mm 無菌打孔器從菌株P(guān)T-2 菌落邊緣取菌餅，分別接種至各個帶藥平板和對照組平板中央，28 ℃培養(yǎng)7 d 后測量菌落直徑，計(jì)算相對抑制率[15-16]。

表1 供試藥劑及濃度Table 1 Fungicides evaluated and concentration

1.5 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS 26.0 軟件計(jì)算毒力回歸方程﹑半最大效應(yīng)濃度（Concentration for 50% of maximal effect，EC50）和相關(guān)系數(shù)（R2）；并使用Duncan法對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析；圖表在Excel 2016中繪制完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對菌株生長的影響

如圖1 所示，不同的碳源病原菌生長情況差異顯著。在缺碳源的查氏培養(yǎng)基中，菌絲生長較差，菌絲較薄，呈現(xiàn)透明狀，菌落直徑為50.3 mm。而添加了碳源的培養(yǎng)基上病原菌菌絲生長茂盛，呈白色。其中，碳源為乳糖和纖維素粉的培養(yǎng)基中，病原菌生長速度最快，菌落直徑分別為56.5 mm和57.8 mm；碳源為可溶性淀粉的培養(yǎng)基中的病原菌生長速度最慢，為42.2 mm。

圖1 病原菌暹羅炭疽菌在不同碳源培養(yǎng)基中菌絲生長情況Fig.1 The mycelial growth of C. siamense in different carbon sources

2.2 氮源對菌株生長的影響

氮源對病原菌生長的影響差異顯著（圖2）。氮源為硝酸鈉和缺氮源的情況下，病原菌長勢一般，菌落呈透明狀，菌絲薄；而其他添加氮源的培養(yǎng)基中，菌絲生長茂盛，菌落呈白色，菌絲較厚。以胰蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中，病原菌生長速度最快，菌落直徑為58.5 mm，菌絲生長速度最慢的氮源培養(yǎng)基為硫酸銨和氯化銨，氮源為硫酸銨的培養(yǎng)基的菌落直徑分別為21.5 mm，氮源為氯化銨培養(yǎng)基菌落直徑為22.0 mm。

圖2 病原菌暹羅炭疽菌在不同氮源培養(yǎng)基中菌絲生長情況Fig.2 The mycelial growth of C. siamense in different nitrogen sources

2.3 pH 值對菌株生長的影響

如圖3 所示，病原菌在pH 值為4.0～13.0 均能生長，pH 值為7 時菌落生長最快，菌落直徑為77 mm，pH 值為5.0-8.0 時，比較適合病原菌的生長。病原菌在pH 值低于5.0 時和大于8.0 之后菌落生長速度明顯變慢。

圖3 病原菌暹羅炭疽菌在不同pH 值中菌絲生長情況Fig.3 The mycelial growth of the C.siamense in different pH

2.4 光照對菌株生長的影響

從圖4 中可以看出，病原菌生長受光照影響明顯。菌落在全光照條件下生長最快，菌落直徑為77.0 mm；全黑暗條件下，菌落生長最慢，菌落直徑為75.6 mm。

2.5 菌株的致死溫度

經(jīng)測定，55 ℃為病原菌的致死溫度，經(jīng)過35﹑40﹑45 和50 ℃處理后的菌餅均能在PDA 平板中生長，而55 ℃和60 ℃處理后的菌餅不再生長。

2.6 溫度對菌株生長的影響

從圖5 中可以看出，溫度對病原菌生長的影響差異性顯著。在28 和30 ℃下菌落生長速度較快，菌落直徑分別為76.3 mm 和77.5 mm；而當(dāng)溫度低于20 ℃和大于30 ℃時，菌落生長受到抑制，菌落直徑明顯下降；40 ℃及以上溫度，菌落不再生長。

圖5 病原菌暹羅炭疽菌在不同溫度下菌絲生長情況Fig.5 Effects of culture temperature on mycelial growth of C.siamense

2.7 不同藥劑對菌株室內(nèi)毒力效果

不同供試藥劑對菌株P(guān)T-2 生長的抑制效果見表2，96.8%苯醚甲環(huán)唑的抑菌效果最佳，EC50值為5.24 μg/mL；其次是98%溴菌腈和98%福美雙，EC50值 分 別 為23.41 μg/mL 和38.72 μg/mL。97%嘧霉胺﹑95%啶酰菌胺和98%嘧菌酯的EC50值范圍在100～200 之間，表明該病原菌對于這3種藥劑也較敏感。

表2 6 種藥劑對菌株P(guān)T-2 的室內(nèi)毒力測定結(jié)果Table 2 The results of toxicity of 6 fungicides on C. siamense

3 結(jié)論與討論

蘋婆炭疽病的病原菌暹羅炭疽菌的生物學(xué)特性的測定，明確了該病原菌生長最適氮源為胰蛋白胨，最適碳源為纖維素粉和乳糖，最適pH 值7.0，不同光照條件下對其生長影響差異不顯著，其致死溫度為55 ℃，最佳生長溫度范圍為28～30 ℃。篩選出了96.8%苯醚甲環(huán)唑可作為該病原菌的潛在高效殺菌劑。

暹羅炭疽菌寄主繁多，目前已發(fā)現(xiàn)果樹類番石榴Psidium guajava﹑棗Ziziphus jujuba﹑芒果Mangifera indica等[17-19]；觀賞植物類金森女貞Ligustrum japonicum﹑紫背竹芋Stromanthe sanguinea[20]﹑中藥材類紫山藥Dioscorea alata[21]等寄主，還能引起草莓根腐病[22]﹑多肉植物黑腐病[23]及其他植物的炭疽病等多種病害，造成葉片枯斑﹑植株萎蔫﹑腐爛等癥狀，給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)上帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

由于寄主不同，病原菌的生物學(xué)特性呈現(xiàn)出一定的差異[19,23-24]。在碳源的利用率上，橡膠炭疽病的病原菌暹羅炭疽菌對半乳糖﹑乳糖的利用率最強(qiáng)；對纖維素﹑可溶性淀粉最弱；青星美人黑腐病的病原菌暹羅炭疽菌最佳碳源為麥芽糖；芒果炭疽病的病原菌暹羅炭疽菌最佳碳源為淀粉，在乳糖中營養(yǎng)生長最慢。而在氮源的利用率上，橡膠樹炭疽病的病原菌暹羅炭疽菌對硝酸鈉﹑硝酸鉀﹑磷酸二氫銨和蛋白胨的利用率都較好，青星美人黑腐病的病原菌暹羅炭疽菌最佳氮源為酵母浸膏，芒果炭疽病的病原菌暹羅炭疽菌對牛肉膏的吸收利用最好。但各寄主上暹羅炭疽菌病原菌對硫酸銨利用率都較差，硫酸銨對病原菌的生長起抑制作用。寄主為橡膠樹和芒果的暹羅炭疽菌病原菌的最佳生長溫度相近，分別為24 和25 ℃；而蘋婆和青星美人上的暹羅炭疽菌病原菌的最佳生長溫度一致，均為30 ℃。橡膠樹上的暹羅炭疽菌病原菌最適pH 值范圍較廣，為5.0～9.0；而在芒果和青星美人上的暹羅炭疽菌病原菌生長最快的pH 值為5.0，與蘋婆上分離出的病原菌pH 值7.0 略有差異。光照對蘋婆﹑芒果上的暹羅炭疽菌病原菌的營養(yǎng)生長沒有影響；而光暗交替適合青星美人上的病原菌菌絲生長，連續(xù)黑暗適合其產(chǎn)孢。

化學(xué)藥劑速效﹑穩(wěn)定，仍是當(dāng)前防治植物炭疽病的主要手段之一[25-26]。根據(jù)6 種殺菌劑對蘋婆炭疽病的病原菌暹羅炭疽菌的抑菌結(jié)果顯示，6 種殺菌劑對病原菌都具有較好抑菌效果，其中96.8%苯醚甲環(huán)唑表現(xiàn)出了最好的抑菌作用，能有效抑制病原菌的生長。這與王志華等[27]在金森女貞上的暹羅炭疽菌病原菌得出的結(jié)論一致。除此之外，經(jīng)藥效試驗(yàn)和室內(nèi)藥劑篩選，咪鮮胺﹑吡唑嘧菌酯﹑甲基硫菌靈[28]﹑多菌靈[27]﹑和氟環(huán)咪鮮胺[29]分別對廣東咖啡﹑金森女貞和油茶上的暹羅炭疽菌病原菌的毒力效果較好。

通過暹羅炭疽菌的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，明確了蘋婆炭疽病病原菌的生活習(xí)性，測定了6 種殺菌劑對病原菌的室內(nèi)毒力效果，并篩選出對病原菌抑制效果最強(qiáng)的藥劑，為蘋婆炭疽病的防控提供了理論支撐。