基于非靶向代謝組學分析StLAC2和StLAC6差異影響玉米大斑病菌的機制

鄒金鵬，岳浩峰，李海笑，劉崢，劉寧，曹志艷，董金皋

基于非靶向代謝組學分析StLAC2和StLAC6差異影響玉米大斑病菌的機制

鄒金鵬1,2，岳浩峰2，李海笑1,2，劉崢3，劉寧1,2，曹志艷，董金皋1,2

1河北農業(yè)大學植物保護學院，河北保定 071001；2河北省植物生理與分子病理學重點實驗室/華北作物改良與調控國家重點實驗室，河北保定 071001；3保定市教育科學研究所，河北保定 071066

【背景】漆酶作為多酚氧化酶，在真菌生長發(fā)育及次級代謝等多方面發(fā)揮重要的作用。玉米大斑病菌（）基因組中含有多個漆酶基因，其中和對玉米大斑病菌生長發(fā)育及致病性具有差異的影響。【目的】明確StLAC2和StLAC6對玉米大斑病菌的差異作用機制，挖掘差異代謝物，為開發(fā)新的殺菌劑及病害防控新策略提供靶點?！痉椒ā坷脽o縫克隆的方法將和pHZ100-GFP質粒連接，構建的回補表達載體。利用PEG介導的原生質體轉化法，將構建好的載體轉入到基因缺失突變體的原生質體中，并利用PCR、RT-qPCR和GFP熒光驗證，對所獲得的陽性轉化子進行鑒定，成功構建回補菌株，并分析敲除及回補和對玉米大斑病菌胞內外黑色素合成及抗氧化性的影響。以野生型、和基因敲除突變體為試驗材料，利用非靶向代謝組學分析其差異代謝物，并利用KEGG分析StLAC2和StLAC6差異作用的機制?！窘Y果】StLAC2和StLAC6對病菌菌絲內和分泌到培養(yǎng)基中的黑色素合成具有差異影響，且StLAC2影響病菌的抗氧化性。代謝組分析發(fā)現(xiàn)與玉米大斑病菌野生型菌株相比，敲除后無論菌絲中或分泌到培養(yǎng)基中的差異代謝物數(shù)量更多，KEGG分析發(fā)現(xiàn)差異代謝物主要為脂類尤其是磷脂，的缺失造成多種黃酮多酚類代謝物下調。而1，8-二羥基萘型黑色素合成途徑的中間代謝物小柱孢酮和柱孢酮含量在Δ中顯著增加，在Δ中顯著降低?！窘Y論】StLAC2參與黑色素的聚合，StLAC6負調控玉米大斑病菌黑色素合成，StLAC2和StLAC6差異影響玉米大斑病菌中脂類代謝物和黑色素合成途徑的中間代謝物，缺失造成多種黃酮多酚類代謝物下調，導致抗氧化性降低。

玉米大斑病菌；漆酶；代謝組學；差異代謝物；黑色素

0 引言

【研究意義】漆酶（EC1.10.3.2）是一類在催化中心含有多個銅離子的多酚氧化酶，也被稱為多銅氧化酶[1]，在真菌中發(fā)揮重要作用。玉米（）是我國重要的糧食及經(jīng)濟作物之一，玉米病害的暴發(fā)嚴重影響我國糧食安全和國民經(jīng)濟發(fā)展[2]。玉米大斑?。╪orthern corn leaf blight，NCLB）是玉米的重要葉部病害之一，廣泛存在于世界各玉米產(chǎn)區(qū)，在大發(fā)生的年份減產(chǎn)可達20%左右，嚴重時減產(chǎn)50%以上[3-6]。其病原菌玉米大斑病菌（）主要侵染玉米葉片，造成的病斑沿葉脈擴展開，表現(xiàn)為棕褐色壞死條紋，周圍有黃色或淡褐色褪綠圈，嚴重影響玉米光合作用導致產(chǎn)量下降[7]。研究玉米大斑病菌致病相關基因的功能及其調控病菌生長發(fā)育、侵染致病及次生代謝的機制可為科學有效防治玉米大斑病提供參考?！厩叭搜芯窟M展】玉米大斑病菌基因組中含有多個漆酶基因，研究顯示漆酶參與了1, 8-二羥基萘（1, 8-DHN）黑色素和L-3, 4-二羥基苯丙氨酸（L-DOPA）黑色素的合成，催化其單體聚合形成無定形黑色素高聚物，影響病菌致病性等[8]。例如黃瓜炭疽病菌（）中的漆酶基因缺失突變體的分生孢子顏色與野生型菌株相比明顯較淺，同時突變體的附著胞在黑化方面存在缺陷[9]。同樣桑椹菌核病菌（）中漆酶基因是影響黑色素合成的重要酶，在致病性中起關鍵作用[10]。漆酶還影響菌體的形態(tài)建成[11]，例如松杉靈芝（）中的漆酶基因在菌絲發(fā)育和子實體成熟過程中的表達量最高，其促進松杉靈芝子實體成熟過程中色素的沉著和菌柄的伸長[12]。在灰葡萄孢（）中，致病性相關的漆酶可以降解其侵染過程中葡萄產(chǎn)生的多種植物抗毒素，從而有利于灰葡萄孢的侵染定殖[13]。因此，對漆酶作用機制的深入研究有利于解析植物病原菌的致病機制。代謝組學根據(jù)研究目的的不同，可進一步分為非靶向和靶向代謝組學，非靶向代謝組學是指采用LC-MS、GC-MS、NMR等技術無偏向性地檢測全部代謝物的動態(tài)變化，并通過生物信息學分析篩選差異代謝物，對差異代謝物進行通路分析，揭示其變化的生理機制[14]?！颈狙芯壳腥朦c】本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)玉米大斑病菌中存在9個漆酶同工酶，其中StLAC2和StLAC6對玉米大斑病菌生長發(fā)育及致病性等方面的影響存在差異，但具體機制尚不清楚，利用代謝組學檢測生物體內代謝物的含量和種類變化，并推斷基因的表達與相關代謝物和代謝通路的關系?！緮M解決的關鍵問題】在繼續(xù)構建回補菌株的基礎上，驗證和在玉米大斑病菌黑色素合成及抗氧化性等方面的差異作用，并進一步利用LC-MS分析野生型和2個基因敲除突變體的菌絲及分泌到培養(yǎng)基中的差異代謝物，以期明確漆酶同工酶差異作用方式，為解析玉米大斑病菌致病機制提供參考。

1 材料與方法

試驗于2021—2022年在河北農業(yè)大學真菌毒素與植物分子病理學實驗室完成。

1.1 供試菌株及培養(yǎng)基

玉米大斑病菌野生型菌株01-23（WT）、基因缺失突變體（Δ）基因回補菌株（Δ）和基因缺失突變體（Δ）均由河北農業(yè)大學真菌毒素實驗室保存。接種于PDA（potato dextrose agar）培養(yǎng)基，于25 ℃黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 L。液體培養(yǎng)使用改良的完全培養(yǎng)基[15]（complete medium，CM）。

1.2 StLAC6回補菌株的構建

1.2.1回補載體的構建及轉化子的獲得 根據(jù)和pHZ100-GFP載體序列，設計帶有I、R I酶切位點的特異性引物（表1），擴增全長，通過無縫克隆的方法與pHZ100-GFP載體連接，構建pHZ100-載體，并進行測序鑒定。利用PEG介導法，將構建好的pHZ100-載體轉化到Δ的原生質體中。挑取再生培養(yǎng)基上獲得的單菌落，接種于含有遺傳霉素G418抗性的PDA培養(yǎng)基上，篩選3代以上，獲得抗性穩(wěn)定的轉化子。

表1 試驗中所用引物

1.2.2 轉化子的驗證 轉化子的PCR鑒定：以轉化子基因組DNA為模板，用特異引物StLAC6-R/F和GFP-R/F（表1）擴增目的片段及GFP，擴增程序：95 ℃ 30 s，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，34個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃∞，PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

轉化子的熒光定量RT-qPCR驗證：按照真菌總RNA提取試劑盒的方法分別提取野生型、敲除突變體及轉化子的總RNA并反轉錄cDNA，以為內參，野生型菌株01-23、突變體Δ和轉化子的cDNA為模板，以RT-StLAC6-F/RT-StLAC6-R為特異引物（表1）分別檢測各菌株中的表達量。

1.3 菌株黑色素含量測定

液體CM培養(yǎng)基25 ℃靜置培養(yǎng)野生型菌株01-23、Δ和Δ，取培養(yǎng)8 d的菌絲及胞外培養(yǎng)基，根據(jù)黑色素在堿性環(huán)境下溶解，在酸性環(huán)境下沉淀且不溶于有機溶劑的特性，提取黑色素[16]并進行定量分析，確定和基因缺失后對病菌胞內外黑色素含量的影響。

1.4 菌株抗氧化性測定

選取同等生長狀況的野生型菌株01-23、Δ、ΔΔ和Δ分別接種到含有30 mmol·L-1H2O2的普通PDA培養(yǎng)基平板上，黑暗培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)以明確和對病菌抗氧化性的影響。

1.5 代謝組學分析StLAC2和StLAC6的差異代謝產(chǎn)物

1.5.1 代謝組學分析樣品的采集及提取 將野生型菌株01-23、Δ和Δ接種于CM液體培養(yǎng)中，25 ℃靜置培養(yǎng)8 d。過濾收集菌絲，將帶有樣品的濾紙置于液氮中速凍5 min后利用冷凍干燥機（Labconco，美國）凍干24 h，-80 ℃保存；將胞外培養(yǎng)液利用冷凍干燥機凍干至恒重，-80 ℃保存，用于后續(xù)質譜數(shù)據(jù)的采集。將野生型菌株01-23、Δ、Δ的菌絲樣品分別命名為WT_IN、LAC2_IN和LAC6_IN，將野生型菌株01-23、Δ、Δ分泌到培養(yǎng)基的樣品分別命名為WT_OUT、LAC2_OUT和LAC6_OUT。

吸取適量液體樣本于1.5 mL離心管中，加入400 μL乙腈﹕甲醇=1﹕1的提取液，渦旋混勻30 s后，低溫超聲提取30 min，將樣品靜置于-20 ℃，30 min，4 ℃，13 000×離心15 min，移取上清液，氮氣吹干，加入100 μL乙腈﹕水=1﹕1復溶，低溫超聲萃取5 min，4 ℃，13 000×離心5 min，移取上清液用于LC-MS分析。取等體積的所有樣本代謝物混合制備成質控樣本（quality control，QC），以考察整個分析過程的重復性，非靶向代謝組學檢測在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司開展。

1.5.2 LC-MS檢測條件 LC-MS分析的儀器平臺為賽默飛公司的超高效液相色譜串聯(lián)傅里葉變換質譜UHPLC-Q Exactive系統(tǒng)。色譜條件和質譜條件見XIE等[17]。

1.5.3 差異代謝物分析 對預處理后的矩陣文件進行差異分析。R軟件包ropls（version 1.6.2）進行主成分分析（PCA），并使用7次循環(huán)交互驗證來評估模型的穩(wěn)定性。此外，進行student’s檢驗和差異倍數(shù)分析。基于VIP＞1，＜0.05得到的變量權重值VIP和student’s檢驗值來確定代謝物為差異代謝物。差異代謝物通過KEGG數(shù)據(jù)庫（https: //www.keggjp/ kegg/pathway.htm1）進行代謝通路注釋，獲得差異代謝物參與的通路。Python軟件包scipy.stats進行通路富集分析，并通過Fisher精確檢驗獲得與試驗處理最相關的生物學途徑。

2 結果

2.1 StLAC6回補菌株的構建及亞細胞定位

將構建好的pHZ100質粒通過原生質體轉化法轉入野生型和Δ菌株原生質體中，G418抗性篩選并進行PCR驗證，的片段大小為1 803 bp，篩選回補菌株Δ（圖1-A）。利用RT-qPCR驗證轉化子中的表達水平，結果顯示，與野生型菌株相比，的表達量在Δ中顯著降低，Δ中表達量恢復，與野生型差異不顯著（圖1-B）。利用熒光顯微鏡觀察GFP標簽的綠色熒光發(fā)現(xiàn)轉化子相較于野生型有明顯的綠色熒光，并且定位于細胞壁上（圖1-C）。

2.2 StLAC2和StLAC6差異影響病菌黑色素的合成及抗氧化性

在PDA培養(yǎng)基上接種野生型菌株、ΔΔΔ和Δ，7 d后觀察發(fā)現(xiàn)菌落形態(tài)基本一致，菌落近圓形，邊緣整齊。野生型菌株菌落顏色呈現(xiàn)灰黑色，氣生菌絲較多，菌落較為茂密、蓬松；Δ菌落顏色呈現(xiàn)灰白色，氣生菌絲減少，菌絲致密平伏；Δ菌落顏色呈現(xiàn)黑褐色，氣生菌絲較多；Δ菌落氣生菌絲比較稀疏平坦，菌落顏色為灰色；Δ菌落邊緣比較整齊有規(guī)則，氣生菌絲比較茂盛菌落顏色為灰褐色，基本恢復到野生型菌株的形態(tài)（圖2）。

圖2 不同菌株菌落形態(tài)

對培養(yǎng)8 d的野生型菌株、Δ和Δ的胞內外黑色素進行提取及含量測定，結果顯示Δ胞內外黑色素含量顯著下降，Δ胞內外黑色素含量顯著增加（圖3）。漆酶差異影響黑色素合成及菌絲形態(tài)的機制需要進一步通過比較差異代謝物進行分析。

A：菌絲黑色素的含量the melanin content in the mycelium；B：細胞外培養(yǎng)液黑色素的含量the melanin content in the extracellular culture medium

在培養(yǎng)基中添加30 mmol·L-1H2O2培養(yǎng)野生型菌株和各突變菌株，分析StLAC2和StLAC6對抗氧化性的影響。結果顯示缺失后對H2O2更加敏感，缺失后對H2O2不敏感，可以正常生長，和回補后對H2O2的敏感程度與野生型相似（圖4），表明StLAC2影響了玉米大斑病菌的抗氧化性。

圖4 野生型和各突變菌株的抗氧化性測定

2.3 代謝組樣品質控分析

利用代謝組學分析培養(yǎng)8 d的野生型菌株、Δ和Δ菌絲內代謝物和分泌的代謝物，在各樣品鑒定出的2 779種代謝物中，正離子模式下有1 519種，負離子模式下有1 260種。對各菌株菌絲內和分泌到培養(yǎng)基的兩組樣品進行PCA分析，結果顯示QC聚合度高，說明QC重復性良好，檢測結果可靠，各組內樣本間聚合度高，組內重復性好；組間樣本代謝物呈現(xiàn)分離趨勢，說明各菌株菌絲內和分泌到培養(yǎng)基的代謝物具有明顯差異（圖5）。

A：陽離子模式Cationic mode；B：陰離子模式Anion mode

2.4 差異代謝物分析

2.4.1 整體分析 對野生型菌株、Δ和Δ菌絲內和分泌到培養(yǎng)基的差異代謝物進行統(tǒng)計分析，結果顯示與野生型菌株相比，Δ菌絲內的差異代謝物有608個顯著上調，有599個顯著下調；Δ分泌到培養(yǎng)基的差異代謝物有283個顯著上調，有396個顯著下調；Δ菌絲內的差異代謝物有766個顯著上調，有253個顯著下調；Δ6分泌到培養(yǎng)基的差異代謝物有281個顯著上調，有260個顯著下調（圖6）。

進一步對已知結構的化合物進行Venn分析，以明確同工酶影響代謝物的重疊關系，鑒別和缺失導致的共有和特有的差異代謝物，在菌絲內所有上調代謝物中，其中兩個基因共同影響的代謝物313個，253個為Δ所特有，422個為Δ所特有；在菌絲內所有下調代謝物中，其中共同下調的有140個代謝物，428個為Δ所特有，71個為Δ所特有。在分泌到培養(yǎng)基中的所有差異代謝物中，其中共同上調的有59個代謝物，220個為Δ所特有，213個為Δ所特有；其中共同下調的有145個代謝物，242個為Δ所特有，111個為Δ所特有（圖7）。以上結果表明敲除主要導致病菌代謝物合成受阻，而敲除更多的導致了菌絲內代謝物含量增加，且兩個基因影響的代謝物具有明顯的區(qū)別。

2.4.2 KEGG功能通路富集和分類分析 利用KEGG數(shù)據(jù)庫對敲除和敲除引起的差異代謝物進行代謝通路富集分析，結果顯示，敲除后菌絲內差異代謝物主要富集在ABC轉運蛋白、嘌呤代謝、嘧啶代謝、花生四烯酸代謝等通路，分泌到培養(yǎng)基的差異代謝物主要富集在甘油磷脂代謝、苯丙氨酸代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、酪氨酸代謝等通路；敲除后菌絲內差異代謝物主要富集在ABC轉運蛋白、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、花生四烯酸代謝、甘油磷脂代謝、谷胱甘肽代謝等通路，分泌到培養(yǎng)基的差異代謝物主要富集在酪氨酸代謝、亞油酸代謝、甘油磷脂代謝、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝等（圖8）。

A：ΔStLAC2菌絲內差異代謝物ΔStLAC2 differential metabolites in mycelium；B：ΔStLAC6菌絲內差異代謝物ΔStLAC6 differential metabolites in mycelium；C：ΔStLAC2分泌到培養(yǎng)基差異代謝物ΔStLAC2 differential metabolites secreted into the culture medium；D：ΔStLAC6分泌到培養(yǎng)基差異代謝物ΔStLAC6 differential metabolites secreted into the culture medium。圖8同The same as Fig. 8

將差異代謝物進行KEGG化合物分類，結果顯示在上調的差異代謝物中磷脂類代謝物數(shù)量最多（圖9-A），而下調的代謝物包括磷脂、氨基酸、核苷類和單糖類化合物富集較多（圖9-B）。同時發(fā)現(xiàn)敲除導致多種核酸類化合物上調，敲除還導致多種單糖類化合物下調。

由于發(fā)現(xiàn)差異代謝物中含有磷脂、脂肪酸、類二十烷酸等多種脂類物質發(fā)生變化，進一步對代謝組結果中的脂類差異代謝物進行分析，發(fā)現(xiàn)二酰甘油、磷脂等多種代謝物在兩種突變體中的差異有明顯區(qū)別，包括鞘磷脂類、磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油等。在Δ中二酰甘油類代謝物含量增加，在Δ中磷脂酰甘油和鞘磷脂類代謝物含量明顯增加而Δ中變化較小或差異不顯著（表2）。

2.5 StLAC2影響黃酮皂苷類代謝物的生物合成

由于Δ的抗氧化性降低，因此分析了代謝組結果中抗氧化活性物質含量的變化，結果顯示缺失導致3, 7-二羥基黃酮、甘草黃酮A、5-羥基-4’, 7, 8-三甲氧基黃酮和6-羥基-4’-甲氧基黃酮等多種黃酮皂苷類代謝物下調（圖10）。黃酮類代謝物主要影響生物的抗氧化性，其含量在Δ中含量降低，推測StLAC2參與了黃酮類物質的合成。

A：菌絲內差異代謝物Differential metabolites in mycelium；B：分泌到培養(yǎng)基的差異代謝物Differential metabolites secreted into the culture medium

2.6 StLAC2和StLAC6差異影響DHN黑色素中間代謝產(chǎn)物

由于StLAC2和StLAC6差異影響了玉米大斑病菌黑色素的合成，進一步檢測代謝組結果中DHN黑色素途徑中間代謝物小柱孢酮和柱孢酮的含量，發(fā)現(xiàn)小柱孢酮和柱孢酮在中含量增加，在中含量降低（圖11）。由此可以推測漆酶基因參與了黑色素的聚合，但敲除導致DHN黑色素合成中間代謝產(chǎn)物減少并促進了其聚合物黑色素的合成。

3 討論

3.1 玉米大斑病菌漆酶同工酶StLAC2和StLAC6具有明顯的功能差異

漆酶屬于多銅氧化酶，作用底物廣泛可以催化多種多酚類物質，在真菌中漆酶的主要功能涉及色素合成、生長發(fā)育、致病性以及防御作用。研究發(fā)現(xiàn)許多生物編碼多個漆酶同工酶基因且不同漆酶同工酶氨基酸序列存在較大差異，其基因功能也存在差異。例如對擬南芥漆酶基因家族功能的研究發(fā)現(xiàn)，漆酶可以抑制根的伸長，可以使其更早開花，使其種子顏色變成淡黃色，說明漆酶基因在不同植物器官的發(fā)育方面具有不同作用[18]。番茄枯萎病菌（）的3個漆酶基因、和被敲除后不影響其致病性，其中調控菌絲的生長、氧化脅迫和碳源代謝等[19]。本實驗室前期發(fā)現(xiàn)在玉米大斑病菌基因組中存在9個漆酶樣多銅氧化酶基因，其同源性介于19.79%—48.70%，其中和聚類在一起，且為主要表達的漆酶[20]，本研究發(fā)現(xiàn)敲除后黑色素含量降低，相反敲除后黑色素含量增加；而且敲除后對H2O2更加敏感，而不影響病菌抗氧化性，表明兩個漆酶同工酶行使不同功能。前期研究表明StLAC2和StLAC6氨基酸序列的同源性僅為36.99%[20]，因此筆者推測可能是由于蛋白同源性較低，在蛋白結構上存在較大差異，導致StLAC2和StLAC6在功能上有明顯差異，有必要對其進行深入研究以明確同工酶功能差異的原因。本研究中和基因回補后并沒有完全恢復到野生型的表型，在菌落形態(tài)上有一定的差異，推測其回補時使用帶有強啟動子的質粒，導致其表達與野生型菌株存在區(qū)別。

A：上調差異代謝物Up-regulated differential metabolites；B：下調差異代謝物Down-regulated differential metabolites

表2 主要影響的脂類差異代謝物

圖10 注釋為黃酮類代謝物的箱式圖

圖11 黑色素合成中間代謝產(chǎn)物的箱式圖

3.2 StLAC2和StLAC6通過不同的機制對黑色素合成產(chǎn)生相反的影響

玉米大斑病菌能夠產(chǎn)生黑色素，黑色素在附著胞侵入寄主表皮細胞的過程中起關鍵作用[21]。DHN黑色素被認為是重要的毒力因子，通過讓附著胞積累足夠的膨壓從而機械穿透寄主細胞，黑色素缺乏的突變菌株不能形成具有正常侵染能力的附著胞，喪失了侵染能力，最終導致致病性喪失[22-23]。在稻瘟病菌（）、灰葡萄孢中DHN黑色素合成以丙二酰輔酶A或乙酰輔酶A為前體物質[24]，通過聚酮合酶催化醋酸鹽合成1, 3, 6, 8-4THN，然后經(jīng)還原酶（1, 3, 6, 8-tetra-HN reductase）催化生成小柱孢酮，在小柱孢酮脫水酶催化的下合成1, 3, 8 THN，經(jīng)還原酶（1, 3, 8-tetra-HN reductase）催化合成柱孢酮，在脫水酶的催化下合成1, 8-DHN，最后經(jīng)漆酶氧化聚合形成1, 8-DHN黑色素[25]，本文通過代謝組分析發(fā)現(xiàn)上述中間代謝物中的小柱孢酮和柱孢酮含量在中增加，表明敲除導致DHN合成中間代謝產(chǎn)物的積累，StLAC2直接參與了玉米大斑病菌黑色素的聚合。

磷脂類代謝物中鞘磷脂是重要的信號物質，介導了肌醇磷酰神經(jīng)酰胺生成二酰甘油。有報道顯示在新生隱球菌中二酰甘油通過激活蛋白激酶C調控漆酶的表達，并且激活黑色素合成，參與致病[26]。本研究發(fā)現(xiàn)在玉米大斑病菌敲除導致了黑色素合成增加，通過代謝組分析發(fā)現(xiàn)缺失突變體中二酰甘油類化合物含量增加，推測其通過激活蛋白激酶C，促進了黑色素的合成，但具體作用機制尚需進一步驗證。

3.3 StLAC2影響玉米大斑病菌抗氧化性及脂類代謝

的缺失主要影響黃酮皂苷類等多酚化合物。趙珊等[27]測定了多酚、黃酮、抗壞血酸等功能成分的含量及對應較高的抗氧化活性，證明黃酮類多酚物質影響甘薯葉的抗氧化能力。黃酮類差異代謝物主要在Δ中降低，如3, 7-二羥基黃酮、甘草黃酮A等，黃酮類代謝物屬于多酚類，漆酶可以催化黃酮類多酚物質，因此推測StLAC2通過影響黃酮類物質的合成導致Δ抗氧化能力下降。

前期研究表明，基因缺失突變體中線粒體數(shù)量更多，且不產(chǎn)生分生孢子[28]。線粒體的完整性依賴于內質網(wǎng)對脂質的攝取，線粒體在脂質代謝中起著核心作用，并與其他細胞器如脂滴或過氧化物酶體連接[29]，線粒體是磷脂和磷脂酰甘油合成所必需的[30]，而Δ中代謝物磷脂酰甘油含量明顯增加。磷脂酰甘油類化合物是細胞膜的主要成分，而且在信號轉導等生理過程中發(fā)揮重要作用，與病菌菌絲形態(tài)直接相關，同時對于分生孢子的形成具有重要作用[31-32]。本文通過代謝組分析發(fā)現(xiàn)敲除導致磷脂酰膽堿及其水解產(chǎn)物LysoPC含量發(fā)生不同程度的變化，表明的缺失可能通過影響磷脂信號轉導造成分生孢子的合成受到抑制。

4 結論

1, 8-二羥基萘型黑色素合成途徑的中間代謝物小柱孢酮和柱孢酮含量在?中增加，在中降低，StLAC2和StLAC6對玉米大斑病菌黑色素合成具有相反的影響；StLAC2和StLAC6差異影響玉米大斑病菌中脂類代謝物，同時的缺失造成多種黃酮多酚類代謝物下調，導致抗氧化性降低。

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Mechanism of StLAC2 and StLAC6 differentially affectingbased on non-targeted metabonomics analysis

ZOU JinPeng1,2, YUE HaoFeng2, LI HaiXiao1,2, LIU Zheng3, LIU Ning1,2, CAO ZhiYan1,2, DONG JinGao1,2

1College of Plant Protection, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei;2Key Laboratory of Hebei Province for Plant Physiology and Molecular Pathology/State Key Laboratory of North China Crop Improvement and Regulation, Baoding 071001, Hebei;3Academy of Educational Sciences of Baoding, Baoding 071066, Hebei

【Background】As a polyphenol oxidase, laccase plays an important role in fungal growth, development and secondary metabolism. A plurality of laccase genes are encoded in the genome of, among whichandhave differential effects on the growth, development, and pathogenicity of.【Objective】To clarify the differential mechanisms of StLAC2 and StLAC6 onand explore new targets for developing new fungicides and disease control strategies by mining differential metabolites.【Method】was connected with pHZ100-GFP plasmid by seamless cloning, and the complementary expression vector ofwas constructed. Using PEG-mediated protoplast transformation method, the constructed vector was transferred into the protoplast ofgene knockout mutant, and the positive transformants were identified by PCR, RT-qPCR and GFP fluorescence verification, and therevertant strain was successfully constructed. The effects of knocking out and revertingandon melanin synthesis and oxidation resistance in and out ofwere analyzed. Taking wild-type (WT),andgene knockout mutants as experimental materials, the differential metabolites were analyzed by non-targeted metabonomics, and the mechanism of the differential action of StLAC2 and StLAC6 was analyzed by KEGG.【Result】StLAC2 and StLAC6have differential effects on melanin synthesis in mycelium and secreted into culture medium, and StLAC2 also affects antioxidant activityof. Metabolomic analysis found that compared with the WT strain of, there were more differential metabolites in the mycelium or secreted into the culture medium after knocking out, and KEGG analysis showed that the differential metabolites were mainly lipids, especially phospholipids. Meanwhile, the absence of thecaused down-regulation of various flavonoids and polyphenols. The contents of intermediates of the 1, 8-dihydroxynaphthalene melanin biosynthesis pathway, scytalone and vermelone, significantly increased in Δand decreased in Δ.【Conclusion】TheStLAC2 participates in melanin polymerization, the StLAC6 negatively regulates melanin biosynthesis in, and the differential effects of StLAC2 and StLAC6 affect lipid metabolism and intermediates of the melanin biosynthesis pathway in. The absence ofcaused down-regulation of various flavonoids and polyphenols, leading to decreased antioxidant activity.

; laccase; metabonomics; differential metabolite; melanin

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.16.006

2023-05-11；

2023-06-06

國家自然科學基金（31901827，32072370）、河北省自然科學基金（C2020204039，C2021204136）、國家現(xiàn)代農業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系（CARS-02-25）、中央引導地方科技發(fā)展資金（226Z6502G）

鄒金鵬，E-mail：17338233032@163.com。通信作者劉寧，E-mail：lning121@126.com。通信作者曹志艷，E-mail：caoyan208@126.com

（責任編輯 岳梅）