NR5A1基因新突變致46,XY完全性性腺發(fā)育不良患者的臨床診治與遺傳學分析

擺俊博,娜菲莎·吐爾地,劉開放,迪亞爾·地里木拉提,李 佳

(1.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院小兒泌尿外科,烏魯木齊 830011;2.新疆醫(yī)科大學兒科學院,烏魯木齊 830011)

性發(fā)育異常(disorder of sex development,DSD)原來稱為兩性畸形,是指先天性染色體核型、性腺與表型性別的發(fā)育異常或不匹配,關(guān)于其發(fā)病率的數(shù)據(jù)有限,總體發(fā)病率大約為1/5 500～1/4 500。2006年發(fā)表的芝加哥共識根據(jù)染色體核型將性發(fā)育異常分為三大類型:46,XX DSD,46,XY DSD,性染色體DSD[1]。其中46,XY DSD臨床表現(xiàn)存在較大的個體差異性,具有高度遺傳異質(zhì)性,故是一系列難以歸類、難以診斷的復雜性疾病[2]。46,XY完全性性腺發(fā)育不良(46,XY complete gonadal dysplasia,46,XY CGD)又稱為Swyer綜合征,其表現(xiàn)為女性外生殖器,存在幼稚子宮、輸卵管及條紋樣性腺,但染色體核型為46,XY。SRY基因為Y染色體上的性別決定基因,當SRY基因啟動后,尿生殖脊上未分化的性腺發(fā)育為睪丸,若胚胎期SRY基因發(fā)生突變,則會出現(xiàn)性腺發(fā)育不全。據(jù)報道只有10%～20%的46,XY CGD與SRY基因突變有關(guān)[3]。有研究在9%的46,XY CGD患者中發(fā)現(xiàn)了核受體亞家族5 A組成員1(NR5A1)突變,其具有廣泛的臨床表型[4]。本研究回顧性分析1例46,XY CGD患者的臨床特征,并發(fā)現(xiàn)了一種NR5A1新的基因突變,結(jié)合國內(nèi)外文獻對其診斷及治療過程進行總結(jié)。

1 對象與方法

1.1 研究對象患者17歲,社會性別女,學生,因“發(fā)現(xiàn)外生殖器異常10月”為主訴入院?；颊邽槠淠赣H第一胎一產(chǎn),順產(chǎn),出生時體質(zhì)量3 500 g,出生時外陰為女性外觀,兒童期身高、體質(zhì)量、智力等正常發(fā)育。至今無月經(jīng)來潮,乳房發(fā)育平坦、乳頭發(fā)育小,一直未引起重視,因發(fā)現(xiàn)外生殖器肥大就診于我院。父母非近親結(jié)婚,母親身高163 cm,孕期用藥史不祥,父親因故去世,患者入院時身高170 cm,體質(zhì)量65 kg,血壓124/75 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),面容無特殊,無明顯喉結(jié)及胡須發(fā)育,音色中性偏女性。查體見:外陰發(fā)育異常,陰毛稀疏,呈女性分布,陰蒂自體表向上突起約4 cm,陰蒂頭稍向下彎曲其上有包皮在背側(cè)堆積,陰蒂兩側(cè)有大陰唇,且有色素沉著,陰蒂下方可見尿道口及陰道口,兩側(cè)陰阜平坦,腹股溝處未觸及包塊及性腺樣組織(圖1A)。婦科超聲:子宮位置見一條形低回聲與陰道相連,約為4.9 cm×1.1 cm×1.5 cm,中間未見明確子宮內(nèi)膜線狀較強回聲,考慮始基子宮、雙側(cè)卵巢顯示不清;腹股溝超聲:雙側(cè)腹股溝區(qū)未見性腺組織;泌尿系超聲:未見腎上腺增生及其他異常;垂體核磁未見異常。骨齡與同齡人相仿。激素檢查結(jié)果見表1,電解質(zhì)、肝腎功、血常規(guī)均未見異常。染色體核型為46,XY。

表1 46,XY完全性性腺發(fā)育不良患者實驗室激素檢查結(jié)果

1.2 遺傳學診斷方法

1.2.1臨床評估 為明確性腺性質(zhì),先后行性腺活檢、人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gondotropin,HCG)激素激發(fā)試驗,并在術(shù)中探查陰道及尿道長度,查看是否存在共同通道。

1.2.2全外顯子組及線粒體組基因檢測 通過從受檢者樣本中提取DNA,構(gòu)建文庫,使用雜交捕獲試劑完成目標區(qū)域捕獲,采用Illumina NovaSeq/MGI DNBSEQ-T7完成高通量測序。通過生物信息學分析,篩選出患者基因組中的可能致病性變異。

1.2.2.1DNA提取 簽署知情同意書后,抽取患者和其母親的EDTA 抗凝外周血2 mL。使用 QIAampDNA Blood Mini 試劑盒(Qiagen,美國)按照步驟提取DNA。

1.2.2.2生物信息學分析 核基因組:利用FastQC軟件對原始測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)控分析;利用BWA軟件(v0.7.15-r1140)將所有過濾后的測序序列(reads)比對到參考基因組(GRCh37/hg19);利用Picard軟件工具去除重復reads;利用GATK軟件工具包(v3.7-0)完成單核苷酸變異(SNVs)和插入缺失變異(Indels)的檢出;利用XHMM(v1.0)及CNVkit(v0.8.4)軟件進行拷貝數(shù)變異(CNVs)的檢出;利用Annovar及VEP等軟件包進行注釋。線粒體基因組:利用trimmomatic對原始測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)控,去除低質(zhì)量reads,并用FastQC進行質(zhì)量評估。剩余的reads用BWA軟件與線粒體參考基因組NC_012920.1進行序列比對。使用GATK軟件分析基因組中SNV和Indel。使用VEP注釋變異,并注釋mitomap、MitImpact、Clinvar等數(shù)據(jù)庫的信息。

1.2.2.3致病性變異篩選 測序質(zhì)控數(shù)據(jù)主要包括Q20、Q30、GC含量、靶向區(qū)域的平均測序深度及平均覆蓋度等。為確保檢測過程中樣本沒有混淆或污染,選用27個高頻SNP位點作為樣本身份標識,在二代測序?qū)嶒灥耐瑫r平行對每個樣本進行這些SNP位點的核酸質(zhì)譜檢測,以確定樣本的唯一性。結(jié)合人群基因變異數(shù)據(jù)庫(dbSNP數(shù)據(jù)庫、千人基因組數(shù)據(jù)庫、ExAC數(shù)據(jù)庫、gnomAD數(shù)據(jù)庫及本地數(shù)據(jù)庫)信息,去除MAF>0.01(AD)或MAF>0.05(AR)的高頻變異,個別特殊的疾病做特殊的閾值過濾。

2 結(jié) 果

2.1 臨床評估結(jié)果在完善相關(guān)實驗室及影像學檢查后,在全麻下行腹腔鏡性腺探查術(shù),術(shù)中探查見膀胱后下方可見大小約4 cm×1 cm×1 cm的幼稚型子宮,探查左側(cè)性腺缺如,右側(cè)性腺呈條索狀(圖1B),取該處性腺上下級及內(nèi)核,送病理活檢。腹腔內(nèi)探查結(jié)束后使用小兒膀胱鏡探查尿道及陰道,尿道長度約7.5 cm,陰道內(nèi)長度約12 cm,未見處女膜組織,尿道及陰道無共同通道。術(shù)后病理結(jié)果:灰白質(zhì)組織一塊,見曲細精管及增生的間質(zhì)細胞,曲細精管內(nèi)未見明確各級生精細胞(圖1C),提示性腺為發(fā)育不良的睪丸。為進一步評估睪丸組織功能,行HCG激素激發(fā)試驗,連續(xù)3 d肌肉注射絨促性素1 500 IU,第4天復查性激素提示:睪酮為1.20 nmol/L(參考值同前),HCG激素激發(fā)試驗陰性,說明睪丸組織無功能。

2.2 臨床治療結(jié)果經(jīng)各方評估后,最終行陰蒂縮短成形術(shù)+大小陰唇成形術(shù),術(shù)后2個月隨訪外觀滿意(圖1D)。

2.3 全外顯子基因組檢測結(jié)果患者全外顯子基因組檢測發(fā)現(xiàn)位于chr9:127265397染色體上的NR5A1基因出現(xiàn)雜合錯義突變,變異信息為:c.205C>T:p.Arg69Cys,患者母親未攜帶NR5A1基因變異c.205C>T(圖2)。在GnomAD數(shù)據(jù)庫、ExAC數(shù)據(jù)庫、HGMD數(shù)據(jù)庫、千人基因組數(shù)據(jù)庫、本地數(shù)據(jù)庫均未收錄該變異,REVEL功能預測軟件結(jié)果偏向于該基因為致病性變異。

圖2 46,XY完全性性腺發(fā)育不良患者及母親NR5A1基因變異c.205C>T Sanger測序驗證結(jié)果示意圖

3 討 論

46,XY性發(fā)育異常疾病復雜、病因多樣,可分為雄激素合成異常、雄激素受體異常、睪酮在外周組織代謝異常、抗苗勒管抑制物質(zhì)(anti-Mullerianhormone,AMH)合成、分泌或其受體異常及性腺(睪丸)發(fā)育異常。人類性別最初都是往女性方向發(fā)展的,至胚胎第6～9周時在泌尿生殖脊上出現(xiàn)未分化的性腺和兩個導管(中腎管、苗勒管)。當Y染色體中SRY因子啟動后,未分化的性腺發(fā)育為睪丸,隨后出現(xiàn)支持細胞及間質(zhì)細胞,間質(zhì)細胞分泌的睪酮促進中腎管分化為輸精管、附睪等,支持細胞分泌的AMH使苗勒管退化。若SRY因子未啟動,中腎管在沒有睪酮的刺激下而退化,苗勒管不需要任何激素的作用下發(fā)育為輸卵管、子宮和陰道的上2/3[5]。若胚胎時期睪丸發(fā)育過程中出現(xiàn)停滯或退化,則會出現(xiàn)XY性腺發(fā)育不全,分為單純性腺發(fā)育不全和完全性性腺發(fā)育不全(Swyer綜合征)[6]。Swyer綜合征患者的染色體核型為46,XY,胚胎早期睪丸因各種因素未發(fā)育,也未能分泌睪酮及AMH,中腎管因缺乏睪酮刺激而無法向男性發(fā)育,苗勒管因無AMH抑制而發(fā)育為輸卵管、子宮及上段陰道,因缺少兩個X染色體,故性腺無法發(fā)育為正常的卵巢,僅為條索狀性腺。目前Swyer綜合征具體發(fā)病機制仍不明確,相關(guān)學說及研究表明該病由多基因引起,常見的為SRY基因出現(xiàn)突變、缺失、異位等[7]。有報道稱因SRY基因引起的46,XY CGD僅占15%左右[8]。另有學者研究發(fā)現(xiàn)常染色體基因中SOX9、NR5A1、WT1、CBX2、DHH和MAP3K1基因常參與人類睪丸發(fā)育過程,它們的突變可能導致46,XY DSD[9]。

NR5A1編碼類固醇生成因子1(SF1),是決定性腺發(fā)育、睪酮合成的關(guān)鍵基因。NR5A1位于染色體9q33.3上,其基因突變導致46,XY性發(fā)育障礙,與睪丸間質(zhì)細胞異常分化和功能失調(diào)有關(guān)[10]。在XY胚胎中,NR5A1在GTAT4等多個轉(zhuǎn)錄因子協(xié)調(diào)下,使SRY基因表達升高;在睪丸支持細胞中,NR5A1通過激活AMH基因的表達促進AMH的合成和分泌,后者使苗勒管結(jié)構(gòu)退化,從而阻止了在XY胚胎發(fā)育過程中形成輸卵管、子宮和上段陰道;而在睪丸間質(zhì)細胞中,NR5A1促進睪酮合成,使中腎管發(fā)育為輸精管、附睪和精囊,促進男性化及睪丸下降[11]。

本研究中患者出生后按女性撫養(yǎng),青春期后乳房發(fā)育欠佳,且一直無月經(jīng)來潮,就診后查性染色體核型為46,XY,外觀為正常女性,陰蒂肥大似男性陰莖,查體見存在陰道口及尿道口,且陰道與尿道之間無共同通道。婦科超聲提示存在未完全發(fā)育的始基子宮,卵巢顯示不清;腹股溝超聲提示雙側(cè)腹股溝未見性腺組織;術(shù)中探查見陰道發(fā)育良好,長度約12 cm:性腺活檢提示性腺為發(fā)育不良的睪丸組織;實驗室檢查睪酮水平較高,但HCG激素激發(fā)試驗陰性,進一步證明睪丸功能欠佳[12]?；颊呷怙@子基因檢測結(jié)果提示:發(fā)現(xiàn)位于chr9染色體上的NR5A1基因出現(xiàn)雜合錯義突變,變異信息為:c.205C>T,結(jié)合性染色體、影像學檢查、病理活檢及基因檢測結(jié)果可診斷患者為存在NR5A1基因突變的46,XY CGD。

LIN等[13]對嚴重雄激素缺乏不伴腎上腺皮質(zhì)功能不全的患者進行NR5A1基因分析,發(fā)現(xiàn)約11%的患者存在NR5A1基因雜合突變。BUONOCORE等[14]對CGD和部分男性化46,XY DSD患者進行了廣泛的診斷,發(fā)現(xiàn)20%左右患者存在NR5A1基因突變,上述作者均認為NR5A1基因突變是導致46,XY DSD發(fā)病的主要病因之一。學者對伴有NR5A1基因突變46,XY DSD患者的研究中發(fā)現(xiàn),其個體間表型差異性較大,患者可表現(xiàn)為如尿道下裂、隱睪、男性不育癥、卵巢早衰或完全女性化等不同的臨床表型,但此類患者其腎上腺功能常正常[15]。有國內(nèi)學者在46,XY男性化不足的患者中發(fā)現(xiàn)1例SF-1雜合子缺失c.11835delC,其母親及姐姐 SF-1 基因測序結(jié)果正常,父親的DNA未獲得,該患兒表現(xiàn)為重度尿道下裂、外陰呈女性外觀、陰道為盲端[16]。結(jié)合本研究中患者的臨床表現(xiàn)為外陰男性化,存在正常陰道及發(fā)育欠佳的子宮,再一次證實了上述研究結(jié)果,其原因可能是NR5A1基因變異位點的不同導致氨基酸殘基活性不同或NR5A1表達劑量的不一。有研究證實即使同一家系中相同變異都會導致不同臨床表現(xiàn),證明其存在較大差異的外顯率[17]。

本研究中NR5A1基因為既往未報道的新變異,變異信息為:c.205C>T:p.Arg69Cys,患者母親未攜帶NR5A1基因變異c.205C>T,其父親因故去世無法進行基因攜帶檢測,不能排除其攜帶此種基因突變或生殖細胞內(nèi)存在突變的嵌合體。其在GnomAD數(shù)據(jù)庫、ExAC數(shù)據(jù)庫、HGMD數(shù)據(jù)庫、千人基因組數(shù)據(jù)庫、本地數(shù)據(jù)庫均未收錄該變異,REVEL功能預測軟件結(jié)果偏向于該基因為致病性變異。該突變是在NR5A1基因第5外顯子區(qū),使第69位氨基酸由精氨酸翻譯為半胱氨酸,我們推測該位點發(fā)生突變時,將影響NR5A1蛋白與其配體結(jié)合,從而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,進而抑制了胚胎期性腺發(fā)育,導致間質(zhì)細胞分泌睪酮不足,使男性化發(fā)育受到抑制,支持細胞分泌AMH不足導致苗勒管未退化而表現(xiàn)出女性特征。

關(guān)于46,XY CGD綜合征的治療,目前國內(nèi)外統(tǒng)一認為一經(jīng)確診,需立即行雙側(cè)性腺切除術(shù),并按女性撫養(yǎng),既往報道Swyer綜合征患者性腺惡變率高,常有性腺母細胞瘤、無性細胞瘤及惡性程度更高的胚胎瘤[18]。該類患者在青春期時使用雌激素誘導第二性征,當雌激素達成人水平或出現(xiàn)第一次突破性出血時,需加用孕激素替代治療[12,19]。本研究中我們根據(jù)患者性腺活檢、HCG激素激發(fā)試驗結(jié)果,判定患者性腺為發(fā)育不良的睪丸組織,因患者陰道發(fā)育良好且存在幼稚子宮?？紤]到患者即將成年,有自我性別認定的意識,在心理實驗室完善明尼蘇達多項個性檢測后,結(jié)果顯示患者女性性別認同強烈,在與患者及其家屬反復溝通談話后最終決定行性腺切除術(shù)+陰蒂縮短成形術(shù)+大小陰唇成形術(shù),術(shù)后患者外觀恢復良好。我們認為典型的Swyer綜合征的難點在于針對臨床表型不典型的患者如何選擇性別,筆者認為對這些患者一經(jīng)確診可切除性腺組織,待患者有性別認同概念時再作出性別選擇,醫(yī)者需要做到關(guān)愛患者身心健康、尊重患者的選擇,作出符合倫理的性別判斷并及時給予心理輔導,在成長過程中需要及時隨訪性激素水平,根據(jù)結(jié)果調(diào)整性激素,維持第二性征的發(fā)育。

綜上所述,本研究對1例46,XY CGD患者臨床資料進行分析,進一步應用全外顯子組及線粒體組基因檢測明確診斷,發(fā)現(xiàn)了一種既往未報道的新的NR5A1基因突變類型,擴大了NR5A1突變譜,為Swyer綜合征的診斷提供幫助。由于該病臨床表現(xiàn)多樣,發(fā)病機制復雜,明確診斷后作出正確性別選擇對提高患者生活質(zhì)量有重要價值。