缺鋅脅迫下玉米葉片出現(xiàn)類似細(xì)胞凋亡現(xiàn)象

王盛鋒，汪 洪

（1 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物營養(yǎng)與肥料重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 / 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081；2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物專用肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 新洋豐農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，北京 100070）

石灰性土壤鋅供應(yīng)不足較普遍[1-2]。植物缺鋅往往表現(xiàn)為葉片脈間失綠，枯萎黃化等癥狀，組織與細(xì)胞水平上觀察發(fā)現(xiàn)，缺鋅葉片出現(xiàn)局部區(qū)域細(xì)胞死亡，呈現(xiàn)“壞死”性斑點(diǎn)和斑區(qū)[2-3]；葉肉細(xì)胞收縮、變小，細(xì)胞間隙增大[4-5]；缺鋅水稻葉片細(xì)胞線粒體和葉綠體結(jié)構(gòu)變形[6]；缺鋅玉米葉片細(xì)胞體積變小、細(xì)胞膜皺縮，嚴(yán)重缺鋅時(shí)，細(xì)胞內(nèi)容物消失、細(xì)胞死亡[7]。

細(xì)胞死亡根據(jù)生理特點(diǎn)，可分為兩種類型：一類是病理性死亡，即通常所指的壞死，是指當(dāng)細(xì)胞遭到強(qiáng)烈的有害刺激時(shí)，出現(xiàn)被動(dòng)、突發(fā)性的非生理性死亡，主要表現(xiàn)為細(xì)胞脹大，細(xì)胞膜破裂，內(nèi)容物外溢流失等形態(tài)特征，這類死亡不受基因調(diào)控，細(xì)胞核變化較慢，DNA 降解不充分[8-9]；另外一類稱為細(xì)胞程序性死亡，是積極、主動(dòng)的細(xì)胞消亡過程，由特定基因編碼，以DNA 早期降解為特征的生理性細(xì)胞死亡[10-12]。根據(jù)形態(tài)與生化特征的差異，細(xì)胞程序性死亡又可細(xì)分為細(xì)胞凋亡、自噬性細(xì)胞死亡和程序性細(xì)胞壞死[13-14]。自噬性細(xì)胞死亡過程中大量自噬小泡產(chǎn)生，自噬小泡與溶酶體融合，降解包裹于其中的底物[13-14]。植物細(xì)胞凋亡的特征表現(xiàn)為細(xì)胞萎縮，細(xì)胞骨架破壞，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核邊緣化；后期DNA 斷裂，被具膜小泡包裹，形成凋亡小體，但細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，無內(nèi)容物滲出。凋亡細(xì)胞生物化學(xué)的特征表現(xiàn)為核酸內(nèi)切酶活性增加，導(dǎo)致DNA 發(fā)生特異性降解，形成180～200 bp 或其整數(shù)倍的片段，凝膠電泳產(chǎn)生梯狀條帶，稱為DNA 梯狀條帶 (DNA ladder)。DNA 斷裂過程中，產(chǎn)生3′-OH 末端，被末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端原位標(biāo)記法 (TUNEL)標(biāo)記，呈現(xiàn)亮綠色熒光特征標(biāo)記[10-12]。另外，細(xì)胞凋亡受特定基因調(diào)控，需要特定基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成，植物中發(fā)現(xiàn)了類Caspase活性的蛋白酶，如Metacaspase 和VPE (vacuolar processing enzyme)，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12,15-16]。

動(dòng)物鋅營養(yǎng)不足，體內(nèi)活性氧增多激活p53基因，凋亡蛋白酶Caspase 基因表達(dá)上調(diào)，Caspase 酶活性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)DNA 受損，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡特征，補(bǔ)充鋅素營養(yǎng)可改善抑制細(xì)胞凋亡[17-19]。番茄原生質(zhì)體和小葉出現(xiàn)細(xì)胞凋亡時(shí)，Zn2+離子抑制而Ca2+離子增強(qiáng)DNA ladder 強(qiáng)度[20]。挪威云杉胚胎發(fā)育過程中，細(xì)胞內(nèi)鋅離子穩(wěn)態(tài)與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切：胚胎細(xì)胞中鋅的分布決定細(xì)胞命運(yùn)，細(xì)胞內(nèi)鋅離子濃度降低，導(dǎo)致胚胎細(xì)胞死亡，加鋅抑制類凋亡蛋白酶活性，抑制胚柄細(xì)胞分化與胚胎發(fā)育[21]。由此，我們推斷植物鋅素營養(yǎng)供應(yīng)不足，可能會導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。

本研究選擇對缺鋅敏感玉米為試驗(yàn)作物，觀察了缺鋅玉米葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞DNA ladder 強(qiáng)度，葉片細(xì)胞DNA 降解特征，測定了凋亡蛋白酶Caspase活性，擬揭示缺鋅玉米葉片細(xì)胞是否出現(xiàn)凋亡特征。

1 材料與方法

1.1 植株培養(yǎng)

供試玉米品種為‘農(nóng)大108’和‘鄭單958’，選取飽滿一致的種子經(jīng)10% H2O2消毒15 min，去離子水洗凈后，浸泡12 h，轉(zhuǎn)移到鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，上蓋一層濕紗布，25℃黑暗中催芽1 天。選擇發(fā)芽一致的種子播于洗凈的石英砂中，室溫下育苗。7 天后 (兩葉一心)，選擇長勢一致的幼苗，去掉胚乳，移栽到500 mL 玻璃培養(yǎng)管中進(jìn)行營養(yǎng)液培養(yǎng)。玻璃培養(yǎng)管直徑為5 cm，高20 cm，外用黑色塑料布包裹遮光。幼苗培養(yǎng)在人工氣候箱進(jìn)行，控制條件為光照時(shí)間 12 h，光照強(qiáng)度24000 lx，晝夜溫度為25℃/20℃，相對濕度70%。

基礎(chǔ)營養(yǎng)液配方 (mmol/L) 為：Ca(NO3)22.0、K2SO40.75、MgSO40.65、KH2PO40.25、EDTA-Fe(Ⅱ)0.1、H3BO31.0×10-3、MnSO41.0×10-3、CuSO41.0×10-4、(NH4)Mo7O245.0×10-6。設(shè)置不加鋅(0μmol/L)和正常供鋅(1 μmol/L) 兩個(gè)處理，代號分別為-Zn 和+Zn，1 個(gè)玻璃管中種植1 株苗，代表1 次重復(fù)，每個(gè)處理4 次重復(fù)。營養(yǎng)液每隔2 天更換1 次，更換時(shí)營養(yǎng)液pH 用NaOH 或HCl 調(diào)到6.2，鋅以ZnSO4·7H2O 供給。

1.2 測定項(xiàng)目

1.2.1 生物量 處理20 天后，收獲植株樣品，分開地上部和根系，用直尺測量株高和根長，稱量鮮重，去離子水洗凈，擦干，105℃下殺青1 h，80℃下烘干至恒重，測干物質(zhì)重。

1.2.2 植株鋅含量 1.2.1 中樣品經(jīng)烘干粉碎后，經(jīng)HNO3-HClO4(3∶1)消煮，用原子吸收分光光度計(jì) (型號為WFX-120C，北京瑞利分析儀器公司)測定鋅濃度，計(jì)算植株鋅含量和鋅積累量。

1.2.3 葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察 處理10、15 和20 天時(shí)，選擇完全展開新葉，取缺鋅處理玉米葉片中出現(xiàn)缺鋅癥狀的部位和加鋅處理玉米葉片的相對應(yīng)部位，保存在甲醛-乙酸-乙醇(FAA)溶液固定。經(jīng)不同濃度的酒精 (30%、50%、60%、70% 酒精各1 次/15 min，80%、90%、95%酒精各1 次/20 min，100% 酒精7～8 次/h)脫水、二甲苯 (1/5、2/5、3/5、4/5 各1 次/5 min，純氯仿2 次/5 min)透明后，用石蠟浸透、包埋。輪轉(zhuǎn)式切片機(jī) (型號為KD 2508，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)進(jìn)行石蠟切片，切片厚度10 μm，展片后經(jīng)二甲苯脫蠟，蘇木素—伊紅染色，于光學(xué)顯微鏡 (型號為XD-101，南京江南永新光學(xué)有限公司)下觀察葉片解剖結(jié)構(gòu)。

1.2.4 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 處理10、15 和20 天時(shí)，選擇完全展開新葉，取缺鋅處理玉米葉片中出現(xiàn)缺鋅癥狀的部位和加鋅處理玉米葉片的相對應(yīng)部位，固定在2.5%戊二醛固定液中，經(jīng)pH 7.2 磷酸緩沖液反復(fù)沖洗，置于1%鋨酸固定2 h 以上，經(jīng)梯度酒精 (30%、50%、60%、70%酒精各1 次/15 min，80%、90%、95% 各1 次/20 min，100% 酒精7～8 次/h)脫水，純丙酮沖洗后，環(huán)氧樹脂滲透包埋。用超薄切片機(jī)(型號為UC6／FC6，Leica) 超薄切片，厚度80 nm，切片用鎳網(wǎng)撈起，醋酸鉛—雙氧鈾染色，在透射電鏡 (型號為HITACH7500)下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，CCD 相機(jī) (型號為GATAN832)拍照。透射電鏡加速電壓80 kV。

1.2.5 DNA 瓊脂糖凝膠電泳 分別取處理5、10、15、20 天完全展開新葉，液氮研磨，于2 mL 離心管中加入700 μL 十二烷基硫酸鈉溶液，65℃下溫浴30～60 min，再加等體積酚∶氯仿 (1∶1)，輕搖至分層，12000×g下離心10 min。吸取600 μL 上清液到1.5 mL 離心管中，加入450 μL 預(yù)冷異丙醇，待出現(xiàn)沉淀后，12000×g下離心10 min，棄去上清液，用500 μL 70%酒精沖洗，棄上清，自然干燥一夜；加200 μL Tris-EDTA buffer 緩沖液溶解DNA。吸2 μL DNA 溶解液與1 μL 緩沖液Loading Buffer，上樣，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)溴化乙錠溶液染色后，利用凝膠成像系統(tǒng) (chemiDoc Universal Hood Ⅱ, 美國BIORAD)觀察拍照。

1.2.6 DAPI 熒光染色觀察 采集處理10、15、20 天玉米完全展開新葉，參考張旭紅等[22]方法，經(jīng)3:1 配比的甲醇+冰醋酸固定3 h，去離子水沖洗干凈后，放入2%纖維素酶和果膠酶混合液中，于28℃下保溫3 h，超純水沖洗，軟化葉片樣品取出，置于預(yù)冷載玻片上，展開，干燥；再用0.1% pH 7.4 的Triton-X 磷酸緩沖液處理3 次，每次5 min，1 μg/mL DAPI 染色，50%甘油封片，于熒光顯微鏡 (型號為IBE2003，重慶光學(xué)儀器廠)下觀察拍照。激發(fā)波長358 nm，發(fā)射波長460 nm。

1.2.7 Caspase-3 酶活性檢測 Caspase-3 酶的提取與檢測采用碧云天生物技術(shù)研究所檢測試劑盒。分別取處理10、15、20 天的完全展開新葉100 mg 左右，加入液氮研磨，后加入1 mL 提取液和300 μL 裂解液，冰浴3 h，輕輕振蕩，20000 g 下保持4℃離心15 min，上清液轉(zhuǎn)到預(yù)冷離心管中，-70℃下保存。

按檢測緩沖液與裂解液9∶1 的比例配置2 mL稀釋液，將10 mmol/L 的pNA (p-nitroaniline)進(jìn)行稀釋，配置6 個(gè)濃度pNA 標(biāo)準(zhǔn)品序列：0、10、20、50、100 和200 μmol/L；取200 μL 待測液，于405 nm 波長處用光譜掃描多功能讀數(shù)儀 (型號為Varioskan Flash，Thermo Scientific 公司)測定吸光度，制作吸光度與pNA 濃度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取出pNA 和底物Ac-DEVD-pNA (acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide, 2 mmol/L)，冰浴備用。配置樣品反應(yīng)體系：80 μL 檢測緩沖液、10 μL 待測樣品和10 μL Ac-DEVD-pNA，90 μL 檢測緩沖液+10μL Ac-DEVD-pNA 為空白對照，于37℃下孵育2 h，用光譜掃描多功能讀數(shù)儀測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，計(jì)算催化產(chǎn)生的pNA 量。單位時(shí)間內(nèi)與1 nmol 底物Ac-DEVD-pNA 反應(yīng)產(chǎn)生1 nmol pNA 為Caspase-3 的酶活性單位?？捡R斯亮藍(lán)法測定樣品中蛋白濃度，以單位質(zhì)量蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)計(jì)算Caspase 3 酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差統(tǒng)計(jì)分析 (ANOVA)，采用Duncan新復(fù)極差方法檢驗(yàn)不同處理之間數(shù)據(jù)的顯著性差異(P＜0.05 為差異顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 缺鋅處理18 天的植株生長及缺鋅癥狀

缺鋅培養(yǎng)10 天后，植株新葉出現(xiàn)輕微黃化；第15 天時(shí)，新葉基部白化，呈透明狀，植株矮小，節(jié)間縮短；第18 天時(shí)，葉片枯萎，基部壞死。農(nóng)大108 出現(xiàn)缺鋅癥狀比鄭單958 早1～2 天，但缺鋅后期鄭單958 出現(xiàn)的癥狀更為嚴(yán)重 (圖1)。

圖1 缺鋅處理18 天的玉米幼苗及缺鋅癥狀Fig.1 Growth and Zn deficient symptoms of maize cultivar Nongda 108 and Zhengdan 958 at 18 days of -Zn treatment

根系生長發(fā)育受到缺鋅影響，顏色變深，長度明顯縮短。2 個(gè)品種比較，缺鋅對農(nóng)大108 根系形態(tài)影響較對鄭單958 更大 (圖2)。

圖2 缺鋅處理18 天玉米根系生長狀況Fig.2 Roots of maize cultivar Nongda 108 and Zhengdan 958 at 18 days of -Zn treatment

2.2 缺鋅處理20 天的植株生物量

缺鋅脅迫20 天后，2 個(gè)品種玉米地上部和根系鮮重明顯下降，地上部干物質(zhì)重下降顯著，但根系干物質(zhì)重尚未受到明顯影響，植株根冠比增大 (表1)。

表1 不同鋅處理下玉米生物量 (g/plant)Table 1 Fresh and dry biomass of maize plants under normal and deficiency of Zn

2.3 缺鋅處理20 天的植株鋅含量

缺鋅玉米地上部和根系中鋅含量明顯降低，地上部鋅含量≤10 μg/g；根系鋅含量高于地上部，正常供鋅處理的地上部鋅積累量高于根系 (表2)。

表2 缺鋅和正常供鋅處理植株鋅含量和鋅積累量Table 2 Zn concentration and accumulation of maize plants under normal and deficiency of Zn

2.4 光學(xué)顯微鏡觀察下的葉片顯微結(jié)構(gòu)

缺鋅培養(yǎng)10 天，兩個(gè)品種玉米葉片顯微結(jié)構(gòu)尚未受到明顯影響。15 天時(shí)，葉片細(xì)胞收縮、葉綠體數(shù)目減少。20 天時(shí)，葉綠體明顯減少，葉片細(xì)胞變小，細(xì)胞間隙增大 (圖3)。兩個(gè)品種比較，前期農(nóng)大108 比鄭單958 葉片顯微結(jié)構(gòu)破壞較重，葉綠體數(shù)目下降更多，后期鄭單958 受損較大。

圖3 缺鋅(-Zn)和供鋅(+Zn)處理10、15 和20 天的農(nóng)大108 和鄭單958 葉片橫切結(jié)構(gòu) (Bar=50 μm)Fig.3 Leaf transversal section image of maize cultivar Nongda 108 and Zhengdan 958 at 10, 15 and 20 days of -Zn and +Zn treatments (Bar=50 μm)

2.5 透射電子顯微鏡下觀察葉片細(xì)胞核超微結(jié)構(gòu)

2.5.1 農(nóng)大108 與正常供鋅處理相比，缺鋅培養(yǎng)10 和15 天時(shí)葉肉細(xì)胞核膜收縮，細(xì)胞核不呈圓形、形狀不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)濃縮，分布邊聚化，趨于核膜側(cè) (圖4)。缺鋅脅迫下，維管束鞘細(xì)胞核結(jié)構(gòu)造成破壞，20 天時(shí)，核膜收縮，核形狀由近圓形變得不規(guī)則，皺縮呈扁平狀。核內(nèi)染色質(zhì)減少但分布均勻 (圖4)。

圖4 缺鋅(-Zn)和供鋅(+Zn)處理10、15 和20 天的玉米品種農(nóng)大108 葉肉細(xì)胞和維管束鞘細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Fig.4 Ultra-structure of nucleus in leaf mesophyll and bundle sheath cells of maize cultivar Nongda 108 at 10, 15 and 20 days of -Zn and +Zn treatments

2.5.2 鄭單958 與正常供鋅處理相比，缺鋅培養(yǎng)下，葉肉細(xì)胞核形狀正常。隨缺鋅處理時(shí)間延長，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)減少、凝集、趨于邊緣化 (圖5)。與正常供鋅相比，缺鋅培養(yǎng)下的維管束鞘細(xì)胞核核膜收縮，外形不規(guī)則呈鋸齒狀，核內(nèi)染色質(zhì)較少，分布均勻 (圖5)。

圖5 缺鋅(-Zn)和供鋅(+Zn)處理10、15 和20 天的玉米品種鄭單958 葉肉細(xì)胞和維管束鞘細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Fig.5 Ultra-structure of nucleus in leaf mesophyll and bundle sheath cells of maize cultivar Zhengdan 958 at 10, 15 and 20 days of -Zn and +Zn treatments

2.6 DNA 凝膠電泳

細(xì)胞凋亡最顯著的生化特征是瓊脂糖凝膠電泳可見特征性的DNA ladder，是由于DNA 降解為大約由180～200 bp 或其多聚體組成的寡核苷酸片段所呈現(xiàn)的現(xiàn)象。

培養(yǎng)5 和10 天時(shí)，2 個(gè)品種葉片DNA 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果在缺鋅和供鋅處理之間沒有明顯區(qū)別，但15 天時(shí)，可見明顯的拖尾條帶，表明此時(shí)葉片中DNA 可能發(fā)生了降解，鄭單958 和農(nóng)大108 表現(xiàn)一致 (圖6)。

圖6 缺鋅脅迫不同時(shí)期農(nóng)大108 (左)和鄭單958 (右)葉片DNA 凝膠電泳圖Fig.6 Images of agarose gel electrophoresis of DNA extracted from leaves of maize cultivar Nongda 108 (left) and Zhengdan 958 (right) at different time of Zn deficient stress

2.7 DAPI 染色觀察

DAPI 是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，和雙鏈DNA 結(jié)合后可以產(chǎn)生比DAPI 自身更強(qiáng)的熒光。缺鋅培養(yǎng)10 天后，細(xì)胞核形狀仍保持規(guī)則，成圓球形；但15 天后，缺鋅處理樣品的DAPI 染色熒光強(qiáng)度增加，細(xì)胞核碎片增多，部分細(xì)胞核不規(guī)則、彌散，體積增大，而供鋅處理細(xì)胞核呈規(guī)則圓球狀；20 天時(shí)，缺鋅處理樣品的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，核破碎，核碎片明顯增多 (圖7 和圖8)。兩個(gè)品種比較，農(nóng)大108 缺鋅細(xì)胞核受損程度較鄭單958嚴(yán)重。

圖7 缺鋅(-Zn)和供鋅(+Zn)處理10、15、20 天的玉米品種農(nóng)大108 葉片原生質(zhì)體DAPI 染色圖Fig.7 DAPI stained protoplasts of maize cultivar Nongda 108 leaves at the 10, 15, and 20 days of -Zn and +Zn treatments

圖8 缺鋅(-Zn)和供鋅(+Zn)處理培養(yǎng)10、15 和20 天的鄭單958 葉片原生質(zhì)體DAPI 染色圖Fig.8 DAPI stained protoplasts of maize cultivar Zhengdan 958 leaves at the 10, 15, and 20 days of -Zn and +Zn treatments

2.8 Caspase-3 酶活性

表3 結(jié)果表明，培養(yǎng)10 天時(shí)，2 個(gè)品種玉米葉片Caspase-3 酶活性在缺鋅和正常供鋅處理間無明顯差異。培養(yǎng)15 天后，缺鋅鄭單958 葉片中Caspase酶活性表現(xiàn)出升高趨勢。培養(yǎng)20 天，缺鋅處理的農(nóng)大108 葉片中Caspase 3 酶活性顯著增加。

表3 缺鋅(-Zn)和供鋅(+Zn)處理不同天數(shù)玉米葉片Caspase-3 活性 (pNA μmol/mg，protein)Table 3 The activity of caspase-3 in leaves of maize at different days of -Zn and +Zn treatments

3 討論

細(xì)胞凋亡是由特定基因編碼，以DNA 早期降解為特征的一種積極、主動(dòng)的細(xì)胞消亡過程，這種過程在形態(tài)上表現(xiàn)為細(xì)胞萎縮、核固縮、染色質(zhì)凝集、細(xì)胞形成“凋亡小體”，但其膜結(jié)構(gòu)完整，無內(nèi)含物滲出[9-12]。利用電子顯微鏡觀察葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，我們發(fā)現(xiàn)，缺鋅玉米葉肉細(xì)胞核膜出現(xiàn)皺縮，核內(nèi)染色質(zhì)凝集固縮，趨向核膜邊緣，向外周聚集；維管束鞘細(xì)胞細(xì)胞核萎縮、變形、呈不規(guī)則狀；缺鋅玉米葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化呈現(xiàn)一定的細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征。但本試驗(yàn)尚未發(fā)現(xiàn)核膜出芽現(xiàn)象和“凋亡小體”的出現(xiàn)。植物細(xì)胞有細(xì)胞壁的阻隔，不易像動(dòng)物細(xì)胞那樣能產(chǎn)生凸出于細(xì)胞之外的凋亡小體[9,23]。

植物細(xì)胞凋亡另一個(gè)特點(diǎn)是DNA 特異性降解，形成180～200 bp 或其整數(shù)倍片斷，并產(chǎn)生大量3′-OH 末端[9-12]。DNA ladder 的形成是判斷細(xì)胞凋亡發(fā)生的一個(gè)重要的典型的指標(biāo)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺鋅培養(yǎng)15 天的玉米葉片中DNA 電泳呈現(xiàn)明顯的拖尾條帶，缺鋅導(dǎo)致玉米葉片細(xì)胞中DNA 發(fā)生了降解。

DNA 斷裂時(shí)，暴露的3′-OH 可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 (terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)的催化下加上綠色熒光探針熒光素 (FITC)標(biāo)記的dUTP (fluorescein-dUTP)，即常用的TUNEL 檢測[24]。我們TUNEL 試驗(yàn)結(jié)果并不理想 (結(jié)果未在此文中報(bào)道)，可能受到玉米葉片細(xì)胞壁和葉綠素?zé)晒獾母蓴_。DAPI 可對DNA 染色，在嵌入雙鏈DNA 后釋放藍(lán)色熒光，通過熒光顯微鏡進(jìn)行檢測，同時(shí)觀察到細(xì)胞核形態(tài)的變化[23,25]。張旭紅等[22]用DAPI 熒光染色方法研究Cd 脅迫下蠶豆葉片細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨Cd 濃度增加，原生質(zhì)體中細(xì)胞核相繼出現(xiàn)染色體凝集、染色體凝集加劇趨邊化、凋亡小體形成等過程。本試驗(yàn)通過DAPI 染色熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，缺鋅脅迫初期，葉片細(xì)胞的細(xì)胞核形狀規(guī)則，成圓球形；但隨著缺鋅脅迫時(shí)間延長，DAPI 染色的熒光強(qiáng)度升高，細(xì)胞核碎裂成大小不等的圓形小體增多，彌散，體積增大。據(jù)此可以認(rèn)為缺鋅脅迫的玉米葉片細(xì)胞呈現(xiàn)出一定的類似細(xì)胞凋亡的生理生化特征。沈嶸等[26]研究表明，一定濃度鋅可緩解有高鹽脅迫或緩解紫外線誘導(dǎo)的水稻根尖原生質(zhì)體細(xì)胞程序死亡。

植物體內(nèi)參與細(xì)胞凋亡過程的核酸內(nèi)切酶有DNase，協(xié)助完成細(xì)胞核清除，降解核DNA。依據(jù)對活性離子的依賴性，核酸內(nèi)切酶可分為Zn2+依賴型、Ca2+依賴型、Mg2+依賴型及Ca2+和Mg2+同時(shí)依賴型4 類[27-28]。小麥糊粉層內(nèi)存在受赤霉素誘導(dǎo)產(chǎn)生的DNase，中性環(huán)境下，受Ca2+和Mg2+激活但被Zn2+離子強(qiáng)烈抑制[29]。鋅是轉(zhuǎn)錄因子如鋅指蛋白和DNA/RNA 聚合酶活性所必需的離子，從而影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)以及DNA 的復(fù)制和RNA 的轉(zhuǎn)錄[3]。鋅是RNA 聚合酶的金屬元素組分，該酶保護(hù)核糖RNA 免受核糖核酸酶RNase 的攻擊而降解。缺鋅條件下，植物體內(nèi)RNase 酶活性升高[3]。

半胱氨酸蛋白酶Caspase 被稱為細(xì)胞凋亡效應(yīng)器或核心酶。該酶具有半胱氨酸和天冬氨酸裂解位點(diǎn)，通過水解天冬氨酸殘基C 末端的肽鍵 (P1 殘基)，分解細(xì)胞內(nèi)相關(guān)底物蛋白，引起細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝改變[23,30]。高溫處理誘導(dǎo)番茄表皮細(xì)胞DEVDase (類Caspase-3)蛋白酶活性增加[31]。添加Ac-DEVD-CHO (Caspase-3 抑制劑) 可阻止DNA 斷裂和PARP [poly-(ADP-ribose) polymerase]降解，從而抑制細(xì)胞凋亡[31-32]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，培養(yǎng)20 天后，缺鋅農(nóng)大108 葉片中Caspase 3 酶活性顯著升高，而鄭單958 葉片中Caspase 酶活性在15 天缺鋅處理時(shí)表現(xiàn)出升高趨勢。在挪威云杉胚胎發(fā)育過程中，細(xì)胞內(nèi)鋅離子穩(wěn)態(tài)與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，胚胎細(xì)胞中鋅的分布決定細(xì)胞命運(yùn)，細(xì)胞內(nèi)鋅離子水平耗竭，胚胎細(xì)胞出現(xiàn)死亡，添加鋅離子，會通過抑制胚柄細(xì)胞分化而抑制胚胎發(fā)育，鋅影響胚胎中類凋亡蛋白酶類Caspase 酶的活性[29]。鋅與植物體內(nèi)活性氧代謝之間關(guān)系十分密切[3]，活性氧參與調(diào)控植物細(xì)胞凋亡，可能的一條途徑就是線粒體釋放產(chǎn)生細(xì)胞色素C，細(xì)胞色素C 擾亂電子傳遞鏈，導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生，激活類Caspase 活性及相關(guān)凋亡級聯(lián)反應(yīng)[25]。

4 結(jié)論

苗期短時(shí)缺鋅，玉米葉肉細(xì)胞體積變小，收縮，葉綠體數(shù)量減少。葉肉細(xì)胞核膜出現(xiàn)皺縮，核內(nèi)染色質(zhì)凝集固縮，形成周邊化特征；維管束鞘細(xì)胞核變形、萎縮；細(xì)胞核DNA 碎片增加，葉片中介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的Caspase-3 酶活性升高，由此初步證實(shí)，缺鋅脅迫導(dǎo)致玉米葉片細(xì)胞出現(xiàn)了類似細(xì)胞凋亡的形態(tài)與生理學(xué)特征。但缺鋅植株體內(nèi)凋亡信號的傳遞與相互作用、蛋白水解酶 (Caspases)活性關(guān)聯(lián)反應(yīng)等還需進(jìn)一步研究。