基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術探討黃芩治療糖尿病心肌病的作用機制

孫玉鳳，葛卓琦，李銀洛，白雪，林淑嫻, ，陳琦*

1.貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025

2.貴州醫(yī)科大學，貴州 貴陽 550025

3.貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550002

據(jù)2021 年國際糖尿病聯(lián)合會數(shù)據(jù)統(tǒng)計，目前世界上有5.37 億20～79 歲的成年人患有糖尿病，而我國患病人數(shù)高達1.4 億，居世界首位，預計2045年將達到1.74 億[1]。糖尿病作為代謝性疾病之一，可導致多器官損傷，糖尿病心臟病變則是糖尿病患者死亡的主要原因[2-3]。而糖尿病心肌病是多種病因?qū)е碌囊环N疾病，其發(fā)病機制復雜，且在糖尿病心臟病變中，具有較高的發(fā)病率和嚴重的不良預后，備受人們關注[4]。目前臨床上還未有針對該病的治療及預防的藥物，故尋求新的治療技術和方法迫在眉睫。

近年來，隨著中醫(yī)藥的發(fā)展，中藥及其單體成分在糖尿病心肌病的治療中發(fā)揮了重要作用，特別是中藥及活性成分新靶點的發(fā)現(xiàn)很有可能成為治療糖尿病引起心肌病變的重要靶標。黃芩是唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi 干燥根，具有瀉火燥濕、解毒寧心等功效，據(jù)2021 年版《糖尿病心肌病病癥結合診療指南》強烈推薦其用于治療中度糖尿病心肌病及熱毒熾盛引起的心律失常[5-6]。黃芩中含有黃芩素、黃芩新素、黃芩苷、漢黃芩素、漢黃芩苷等黃酮類化合物，具有降低血糖、抗炎、抗氧化和抑制細胞凋亡等作用[7-11]。黃芩有效成分被廣泛應用于糖尿病及其并發(fā)癥的防治中，能有效改善糖尿病并發(fā)的心肌缺血和抑制心肌纖維化[12]。因此，黃芩有效成分在糖尿病心肌病防治方面有著廣闊的空間，需要進一步開發(fā)和探索。

網(wǎng)絡藥理學是從整體角度預測藥物與疾病之間的相互作用，揭示藥物成分、靶點、疾病之間復雜的生物網(wǎng)絡關系[13]，分子對接則通過受體蛋白與配體藥物分子之間的相互作用來分析、預測其結合模式和親合力的一種理論模擬方法[14]。本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法和分子對接技術，挖掘黃芩活性成分及治療糖尿病心肌病的主要靶點、相關通路，闡明黃芩治療糖尿病心肌病潛在的作用機制，為黃芩治療糖尿病心肌病提供細胞分子層面的參考。

1 材料與方法

1.1 黃芩潛在活性成分及作用靶點的篩選

借助中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP，https://tcmsp-e.com）以“黃芩”為關鍵詞檢索黃芩中的化學成分及對應靶點，并以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 篩選該藥的活性成分，并獲取各成分相應的靶點[15]。對于無法獲得的靶點則通過SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch）數(shù)據(jù)庫對其進行補充。

1.2 疾病靶點的篩選

通過人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫OMIM（http://www.omim.org/）、疾病相關聯(lián)數(shù)據(jù)庫GeneCards（https://www.genecards.org/）以“diabetic cardiomyopathy”為關鍵詞，進行人類基因檢索。合并2 個數(shù)據(jù)庫糖尿病心肌病疾病靶點，剔除重復靶點后，得到糖尿病心肌病疾病靶點。

1.3 靶標蛋白基因名的確定及活性成分-靶點網(wǎng)絡圖的構建

在蛋白數(shù)據(jù)庫 UniProt（https://www.uniprot.org/）中下載人類全基因名稱與黃芩成分對應靶點進行匹配，得到相應靶點標準化的基因名稱。與SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫檢索到的靶點進行綜合，去重得到成分靶點。將成分靶點與疾病靶點輸入 Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）在線平臺，得到交集靶點，即黃芩抗糖尿病心肌病的作用靶點。將黃芩活性成分及交集靶點對應導入Cytoscape 3.9.0 軟件（http://www.cytoscape.org/）構建“活性成分-靶點”網(wǎng)絡圖。

1.4 構建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡

將1.3 項下得到的交集靶點導入String（https://cn.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫中，選擇“Multiple proteins”，設置物種為“Homo sapiens”，選擇最小交互打分值為0.4 隱藏離散蛋白，導出PPI 網(wǎng)絡分析“TSV”格式文件。將該文件導入Cytoscape 3.9.0軟件中，并借助軟件分析工具對網(wǎng)絡進行拓撲參數(shù)分析，根據(jù)degree 值調(diào)節(jié)節(jié)點大小和顏色深淺，繪制PPI 網(wǎng)絡關系圖，并篩選degree 值靠前的靶點為核心靶點。

1.5 基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）信號通路分析

將1.3 項下的交集靶點導入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）數(shù)據(jù)庫，通過輸入靶基因名稱列表并限定物種為人，進行GO 富集分析及KEGG 代謝通路富集分析，其中GO 分析包括生物學過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF），并用微生信在線工具（http://www.bioinformatics.com.cn/）將其結果可視化。最后利用Cytoscape 3.9.0軟件構建其“活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡圖。

1.6 分子對接

選取Cytoscape 3.9.0 軟件分析結果degree 值前10 位的黃芩有效成分與潛在作用靶點，在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索下載小分子“mol2”格式文件和在PDB（https://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫下載大分子分辨率高的3D 結構，并保存分析“pdb”格式文件，導入PyMOL 2.4.1 軟件對蛋白配體移除水分子、小分子配體，再將其導入AutoDockTools 1.5.7 軟件對大分子蛋白進行加氫、計算電荷并設置為原子類型。最后選中所有活性位點，通過AutoDock Tools 1.5.7 設置對接盒子進行分子對接，最后采用PyMOL 2.4.1軟件對結合位點進行可視化處理。

2 結果

2.1 黃芩活性成分及靶點的篩選

利用檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫以OB≥30%和DL≥0.18 進行篩選，共得到36 個活性成分，見表1。通過TCMSP 和SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫共收集到2 828 成分靶點進行綜合，剔除重復及無標準靶點后得到513 個黃芩活性成分相關的靶點。

表1 黃芩活性成分Table 1 Active ingredients of Scutellaria baicalensis

2.2 糖尿病心肌病潛在靶點預測

以“diabetic cardiomyopathy”為關鍵詞，通過GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫分別檢索糖尿病心肌病的相關靶點，并采用微生信在線繪圖，分別獲得474、1 131 個疾病靶點。去除92 個重復靶點，合并去重得到1 513 個潛在靶點。

2.3 黃芩活性成分-靶點網(wǎng)絡的構建

將篩選出的活性成分與該成分對應的靶點導入Cytoscape 3.9.0 軟件中，分析得到活性成分-靶點網(wǎng)絡，見圖1。該網(wǎng)絡包含171 節(jié)點，2 180 條邊，其中形狀越大表示其degree值越高，相互作用越強。表明該成分所對應的靶點越多、靶點與成分之間的相互作用越強、成分越核心，體現(xiàn)了黃芩多成分、多靶點的特點。

圖1 活性成分-靶點網(wǎng)絡Fig.1 Active component-target network

2.4 關鍵作用靶點篩選與靶點PPI 網(wǎng)絡構建

利用Venny 2.1.0 繪制黃芩活性成分靶點與糖尿病心肌病靶點的交集，得到151 個共同靶點，見圖2。并將共同靶點導入String 在線網(wǎng)絡平臺，設置置信度＞0.4，進行分析，下載TSV 格式文件，導入Cytoscape 3.9.0，得到PPI 網(wǎng)絡圖，見圖3，該圖包括151 個節(jié)點，2 300 條邊，其中節(jié)點越大，顏色越深，代表其degree 值越大，連線越粗代表蛋白間的相互作用越強。根據(jù)degree 值、中介系數(shù)中心性、接近度中心性得到蛋白激酶B1（Akt1）、腫瘤壞死因子（TNF）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）等10 個靶點為核心靶點，見表2。

圖2 活性成分-糖尿病心肌病靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagram of active component-diabetic cardiomyopathy targets

圖3 PPI 網(wǎng)絡圖Fig.3 PPI network

表2 核心靶點信息Table 2 Information of key targets

2.5 GO 功能及KEGG 通路富集分析

運用DAVID 在線數(shù)據(jù)庫，對共同靶點進行GO功能富集分析，得到775 條BP 條目、86 條CC 條目和167 條MF 條目，根據(jù)分析將各類GO 功能富集按P值進行排序，取排名前10 位的條目進行作圖，見圖4。其柱狀圖越高，則靶點在該通路上所富集的靶標蛋白越多，說明這條通路更重要。

圖4 GO 富集分析Fig.4 GO enrichment analysis

結果可見，BP 主要涉及對絲裂原活化蛋白激酶級聯(lián)正調(diào)節(jié)、基因表達的正向調(diào)控、藥物反應、絲裂原活化蛋白激酶活性的正向調(diào)節(jié)等；CC 主要集中受體復合物、質(zhì)膜、膜筏、高分子配合物及胞外區(qū)等；MF 主要體現(xiàn)酶結合位點、相同蛋白的結合、RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄因子活性及蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等。

KEGG 通路分析得到169 條信號通路，以P值大小為篩選標準，取排名前30 位的信號通路，運用微生信在線繪制氣泡圖，見圖5?？梢娫摶蛑饕婕鞍┌Y（基因數(shù)48）、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化（基因數(shù)34）、癌癥中的蛋白多糖（基因數(shù)29）、晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體（AGE-RAGE，基因數(shù)28）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/Akt（基因數(shù)31）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK，基因數(shù)28）等相關通路。其中有10 條與糖尿病心肌細胞損傷有關。圖中橫坐標代表基因比率，縱坐標代表通路；氣泡越大表示在該通路上富集的基因數(shù)量越多，顏色越深表示P值越小、富集的顯著性越高。將篩選出的主要成分、作用靶點、信號通路與疾病，導入Cytoscape 3.9.0，得到“活性成分-交集靶點-信號通路-疾病”網(wǎng)絡路，見圖6，圖中共有162 節(jié)點、1 326 條邊，由圖可知，黃芩治療糖尿病心肌病是通過該藥中的36 個活性成分作用30 條主要通路和94 個靶點基因的結果。

圖5 KEGG 通路富集分析（前30 位）Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis（top 30）

圖6 黃芩成分-靶點-通路-疾病相互作用網(wǎng)絡圖Fig.6 Compounds-targets-pathways network of Scutellaria baicalensis

2.6 分子對接

選擇degree 值前10 位的黃芩活性成分（表3）與degree 值排名前4 位的作用靶點，即Akt1、TNF、GAPDH、白細胞介素-6（IL-6）。利用AutoDock 1.5.7軟件進行分子對接并打分，見圖7。一般認為，若結合能在-5.0 kcal/mol（1 cal＝4.4 J）以下時，說明此成分與對接靶點蛋白結合性較好，若結合能在-7.0 kcal/mol 以下時，則表明對接的兩則具有強烈的結合活性[16]，是與疾病靶點結合較好的活性成分。結果顯示，40 組配體化合物-受體蛋白對接結合能均小于-5.0 kcal/mol，其中小于-8.0 kcal/mol 的有19 組，約占48%，表明本研究中所預測的活性成分可與關鍵靶點蛋白穩(wěn)定結合并發(fā)揮治療糖尿病心肌病的作用。將上述對接結果用PyMOL 2.4.1軟件對其進行可視化分析，見圖8。如圖所示，活性成分黃芩素與關鍵靶點Akt1、TNF、GAPDH、IL-6 等的結合能均小于-8 kcal/mol，表明結合能力較強、結合構象較穩(wěn)定。

圖7 黃芩核心成分與核心靶點結合能熱圖Fig.7 Thermal map of binding energy between core components and core targets of Scutellaria baicalensis

圖8 黃芩素分子對接圖Fig.8 Molecular docking diagram of baicalein

表3 黃芩10 種核心成分網(wǎng)絡節(jié)點特征參數(shù)Table 3 Characteristic parameters of network nodes of 10 core components of Scutellaria baicalensis

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法對黃芩活性成分、作用靶點、相關信號通路及其抗糖尿病心肌病作用機制等進行探討，并對其活性成分與相關核心靶點進行分子對接。根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18 及符合類藥性五原則篩選，共篩選出36 種活性化合物和151 個潛在黃芩治療糖尿病心肌病的疾病靶點。通過“活性成分-靶點”網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)：漢黃芩素（wogonin）、黃芩素（baicalein）、表小檗堿（epiberberine）、黃芩新素（skullcapflavone II）等化合物可能在黃芩治療糖尿病心肌病中發(fā)揮著關鍵作用。其中漢黃芩素和黃芩素，分別對應48、44 個靶基因。有研究表明，黃酮類化合物漢黃芩素和黃芩素均具有降血糖的作用[17]。漢黃芩素可以抑制葡萄糖吸收、肝臟中糖的生成及調(diào)節(jié)糖代謝過程中限速酶的表達等途徑，降低血糖，并改善氧化應激和炎癥反應，從而抑制高血糖導致的損傷[18-19]。黃芩素能抑制NF-κB 信號通路和游離脂肪酸釋放，減少炎癥因子的產(chǎn)生和釋放，調(diào)節(jié)糖代謝，增強胰島素敏感性信號激活，改善胰島素抵抗狀態(tài)，對高脂導致肝細胞損傷起到保護作用[20]。

本研究共獲得黃芩活性成分作用靶點與糖尿病心肌病疾病靶點的交集靶點151 個，這151 個靶點可能是黃芩抗糖尿病心肌病的潛在靶點。PPI 網(wǎng)絡及分子對接結果發(fā)現(xiàn)，黃芩抗糖尿病心肌病的核心靶點有Akt1、TNF、GAPDH、IL-6 等，主要參與細胞的增殖、凋亡、炎癥、分化等BP，可能是黃芩抗糖尿病心肌病主要靶點。Akt1 與葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4 信號傳遞密切相關，可通過控制葡萄糖的攝取發(fā)揮調(diào)控血糖的作用[21]。TNF 可通過促進胰島素受體底物1（ISR-1）的絲氨酸磷酸化來降低胰島素所涉及信號的傳導，進而誘導胰島素抵抗的產(chǎn)生[22]。TNF-α 是TNF 通路中最關鍵的效應分子，TNF-α 可通過調(diào)控位于脂肪以及肌肉細胞的胰島素受體，減少葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的合成[23]。GAPDH 是一種非常豐富的糖酵解酶，它是介導凋亡細胞死亡的主要細胞內(nèi)信使。研究表明，氧化GAPDH 將S-谷胱甘肽基化轉(zhuǎn)移到核蛋白Sirtuin-1 上，導致細胞凋亡[24]。IL-6 在病程早期可通過促進胰島素產(chǎn)生，導致高胰島素血癥；晚期則可通過抑制細胞表面葡萄糖轉(zhuǎn)運體4（GLUT-4）活性及誘導細胞轉(zhuǎn)導信號抑制因子（SOCS-3）蛋白表達增多，干擾胰島素信號傳導通路，從而促進糖尿病的發(fā)生和發(fā)展[25]。有研究表明，黃芩素能減少高糖誘導 HK-2 細胞中活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）含量及TNF-αmRNA 和p-Akt、TNF-α 蛋白等的表達，對腎小管上皮細胞起到保護作用[26]。黃芩素還可以通過抑制IL-6、TNF-α、IL-1β 等炎癥因子表達，改善肥胖小鼠體脂及胰島素抵抗的作用，調(diào)節(jié)異常糖脂代謝[27]。因此，以上靶點可能在黃芩及其活性成分治療糖尿病心肌病中發(fā)揮同等重要的作用。

隨后，本研究對黃芩抗糖尿病心肌病病變作用靶點進行GO 富集和KEGG 富集分析。結果表明，其BP 主要涉及MAPK 級聯(lián)正調(diào)節(jié)、基因表達的正向調(diào)控、藥物應答、絲裂原活化蛋白激酶活性的正向調(diào)節(jié)、PI3K 信號的陽性調(diào)控反應等；CC 主要集中受體復合物、細胞膜、膜筏等；MF 主要體現(xiàn)酶結合位點、相同蛋白的結合及配RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結合轉(zhuǎn)錄因子結合等。KEGG 富集通路表明，黃芩抗糖尿病心肌病信號通路涉及AGERAGE 信號通路、內(nèi)分泌抵抗、低氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路、TNF 信號通路等。其中排名最前的AGE-RAGE 信號通路在糖尿病及其并發(fā)癥聯(lián)系十分密切，主要與細胞膜上的受體結合，能激活Janus 激酶-信號轉(zhuǎn)導子與轉(zhuǎn)錄激活子（JaK-STAT）、PI3K-Akt、MAPK 等信號通路，并促進炎性反應和氧化應激的發(fā)生[28]。炎癥在糖尿病心肌病的發(fā)病中起著至關重要的作用，糖尿病患者體內(nèi)的炎癥因子（TNF-α、IL-1、IL-6）和細胞因子及趨化因子的升高，促進炎癥聯(lián)級的發(fā)生，加重了胰島素的抵抗作用，導致糖尿病患者代謝紊亂[29]，使心細胞肥大、線粒體功能障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激增加、成纖維細胞增殖和膠原的生成[23]，最終導致心肌細胞凋亡，左心室收縮、舒張功能障礙。TNF-α 是TNF 通路中最關鍵的效應分子，參與誘發(fā)炎癥反應、細胞凋亡及免疫調(diào)節(jié)等過程[23,25,27]。近年研究表明，HIF-1α 及其下游的其他靶分子如內(nèi)皮型一氧化氮合酶、基質(zhì)細胞衍生因子-1 等，均可促進血管內(nèi)皮細胞數(shù)量增多，調(diào)節(jié)糖尿病患者血管生成，參與VEGF 的調(diào)控紊亂共同導致糖尿病心肌I/R 時側(cè)支循環(huán)血管生成障礙[30-31]。因此，結合分子對接和KEGG 代謝通路富集分析結果發(fā)現(xiàn)，黃芩活性成分可能通過參與調(diào)控葡萄糖的獲取、減少炎癥因子分泌、改善胰島素信號通絡，發(fā)揮抗糖尿病心肌病作用。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡藥理學與分子對接相結合的方法來探討黃芩抗糖尿病心肌病的活性成分、靶點及其作用機制，證明了黃芩通過多靶點、多成分和多途徑的相互作用治療糖尿病心肌病。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突