檢測新生兒溶血標(biāo)本NSE校正公式的建立*

常珊碧 張保榮 沈潔 蔣曼麗 王躍幫

(宿遷市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科,江蘇 宿遷 223800)

新生兒缺氧缺血性腦病(Hypoxic ischemic encephalopathy,HIE)是指圍生期各種原因?qū)е碌哪X組織部分或完全缺氧、腦血流供應(yīng)降低導(dǎo)致的新生兒大腦損傷。研究顯示,盡管圍生期診療技術(shù)明顯提高,HIE仍是全球新生兒發(fā)病和死亡的重要原因之一[1-2]。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE)是HIE的敏感標(biāo)志物,是一種酸性蛋白酶,也是糖酵解作用的關(guān)鍵胞內(nèi)酶,炎癥損傷細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞由于增值周期加快,糖酵解作用增強(qiáng),導(dǎo)致NSE大量釋放入血液,使血清中此酶含量增高[3-6]。NSE特異性存在于神經(jīng)元、神經(jīng)組織來源的腫瘤組織以及神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中[7-8],血清中NSE的濃度對(duì)新生兒缺氧缺血性腦病、嗜鉻細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤以及小細(xì)胞肺和急性淋巴細(xì)胞白血病等疾病的鑒別診斷、療效評(píng)估和預(yù)后等方面具有重要意義[9-11]。在血小板和紅細(xì)胞中有γ亞基的NSE同工酶,因此當(dāng)標(biāo)本溶血時(shí),NSE同工酶釋放到胞外與血清NSE出現(xiàn)部分交叉免疫反應(yīng),使檢測結(jié)果偏高,影響報(bào)告的真實(shí)性和可靠性[12-13]。臨床上新生兒采血極其困難,血清標(biāo)本經(jīng)常有不同程度的溶血,故本研究通過建立新生兒溶血校正公式,以探討其診斷新生兒疾病的可行性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2021年1—5月本院新生兒科出生的新生兒血清樣本50例,其中男性28例、女性22例,時(shí)間<24 h。同時(shí)回顧性分析2021年1—5月出生的237例新生兒黃疸指數(shù)(Icterus)以及溶血指數(shù)(Haemolysis),患兒家屬均同意并簽署同意書,本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑 佑科752N紫外可見分光光度計(jì)購自上海佑科儀器儀表有限公司;ROCHE E602全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及NSE配套原裝試劑(批號(hào):52370301)購自瑞士羅氏公司;Sysmex XN-9000全自動(dòng)血液分析儀及配套試劑、SLS溶血?jiǎng)?批號(hào):A1004)購自日本Sysmex公司,T5D低溫水平離心機(jī)購自上海盧湘儀公司;氰化高鐵血紅蛋白(cyanmethemoglobin , HiCN)標(biāo)準(zhǔn)液和文齊氏液均購自上海信帆生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 采用佑科752N紫外可見分光光度計(jì)分別測定 50、100、150、200、250 g/L Hb標(biāo)準(zhǔn)液在540 nm處的吸光度值(用A表示),以吸光度為橫坐標(biāo),Hb濃度為縱坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將5份新鮮的全血樣本加到干燥潔凈的試管內(nèi),輕輕搖勻后,用Eppendorf微量移液器吸取20 μL混合全血加到含有5 mL文齊氏液的試管中中,輕輕搖勻,5 min后測定OD值,通過標(biāo)準(zhǔn)可得到血紅蛋白濃度。用0.9%生理鹽水將混合全血分別稀釋成Hb濃度為的20、10、5、2.5、1.25、0.625 g/L的樣本。分別吸取100 μL上述樣本加入到含有2.5 mL文齊氏液的試管中并搖勻,5 min測定540 nm處的吸光度值(A),以吸光度值為橫坐標(biāo), Hb濃度為縱坐標(biāo),繪制血清Hb標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 血清NSE結(jié)果檢測 選取當(dāng)日檢測的新生兒全血新鮮樣本,3500 rpm離心10 min ,分離血清,用移液器吸取下層紅細(xì)胞300 μL于冷凍管內(nèi),將冷凍管在-80 ℃冰箱內(nèi),放置20 min,取出室溫平衡30 min至完全溶解,重復(fù)上述步驟5次。選取當(dāng)日檢測的含有分離膠的血樣,用Eppendorf移液器吸取血清200 μL加入到干凈的試管內(nèi),加入5 μL上述紅細(xì)胞,充分混勻后3500 rpm離心10 min,分離血清,用于檢測NSE濃度。

1.3.3 血清Hb濃度測定 用Eppendorf移液器分別吸取上述血清100 μL和文齊氏液2.5 mL至一潔凈的試管內(nèi),輕輕搖勻,5 min 內(nèi)測定540 nm處的吸光度(A)值,根據(jù)血清 Hb標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出Hb濃度。

1.3.4 NSE檢測方法的相關(guān)性 按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)的文件EP9-A2要求,對(duì)采用HiCN法和XN-9000全自動(dòng)血液分析儀(儀器法)建立的校正公式,評(píng)價(jià)兩者之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 一般結(jié)果 <24 h出生的新生兒血清TB濃度為(137.00±56.84) μmol/L,25.3%(60/237)血液樣本均存在不同程度的溶血,溶血程度+/++/+++/++++分別占6.75/8.02/8.44/2.11%,其中血清中Hb>2 g/L占 9.28% (22/237)。

2.2 Hb標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 全血樣本Hb濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Hb全=328.73×A540nm+1.67(r2=0.996),血清樣本Hb濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Hb血清=35.56×A540nm+0.14 (r2=0.998)。見圖1。

圖1 血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 Hb與NSE的相關(guān)性 分別檢測50份新生兒樣本,測定其血清中NSE濃度,添加反復(fù)凍融紅細(xì)胞后,離心分離血清后繼續(xù)檢測其濃度,通過計(jì)算兩者血清NSE濃度變化與Hb濃度變化的比值,得出的NSE/Hb為(35.62±2.17) μg/g即血紅蛋白每增加1 g/L,NSE增加(35.62±2.17)ng/mL。以NSE血清為Y軸, Hb為X軸, NSE血清結(jié)果與Hb變化高度相關(guān),其回歸方程分別為YΔNSE=32.90×Hb全血濃度+1.58(r2=0.991,P<0.001),YΔNSE=30.97×HbHICN+1.11(r2=0.981,P<0.001),見圖2。且兩者方法 NSE之間高度相關(guān) (r2=0.933,P<0.01)。見圖3。

圖2 血清NSE與血紅蛋白濃度變化相關(guān)性

圖3 血紅蛋白儀器法和HICN法 NSE相關(guān)性

2.4 兩種校正公式與溶血前血清NSE比較 采用單因素方差分析對(duì)溶血前與矯正后3組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.136 ,P=0.873),見表1。50份樣本加入反復(fù)凍融的紅細(xì)胞后,NSE檢測結(jié)果(71.65±21.77)ng/mL,全部超過臨床參考區(qū)間,NSE校正=NSE溶血-ΔNSE,經(jīng)上述兩種公式校正后,超過臨床參考區(qū)間的樣本分別為8份(16%)和7份(14%)。

表1 NSE校正公式相關(guān)性分析

2.5 校正公式的建立 根據(jù)ΔHb血清與ΔNSE的相關(guān)性,得出校正公式分別為:NSE校正=NSE測定-32.90×Hb全血濃度-1.58;NSE校正=ΔNSE測定-30.97×HbHICN-1.11。

3 討論

NSE在新生兒缺氧缺血性腦病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤及小細(xì)胞肺癌等疾病中均有表達(dá),在小細(xì)胞肺癌診斷和鑒別診斷中應(yīng)用廣泛,具有較高敏感性和特異性[14-18]。同時(shí)NSE對(duì)腦細(xì)胞及血管損傷程度判斷有重要臨床價(jià)值,是腦損傷的特異性標(biāo)志物[19-20]。溶血性標(biāo)本中的血紅蛋白(Hb)濃度各不相同,血紅蛋白濃度越高對(duì)NSE的檢測結(jié)果影響越大,樣本在室溫放置時(shí)間的過久以及儲(chǔ)存溫度變化會(huì)導(dǎo)致樣本溶血從而使血清中NSE水平增高[21],王強(qiáng)等[22]研究發(fā)現(xiàn)血清中血紅蛋白每增加1 g/L,NSE檢測結(jié)果平均增加(23.70±3.62)ng/mL。

本實(shí)驗(yàn)通過血清中加入不同濃度的Hb全血樣本,模擬溶血環(huán)境,通過檢測溶血后的NSE濃度,以評(píng)價(jià)不同濃度的Hb對(duì)NSE結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示正常血清NSE濃度為(8.21±2.47)ng/mL,隨著溶血程度的增加,血清中Hb濃度也逐漸增高,導(dǎo)致血清中NSE的濃度也越來越高,ΔNSE值也越來越大。當(dāng)標(biāo)本發(fā)生輕微時(shí)Hb濃度為0.625 g/L,NSE的結(jié)果可增加16.54 ng/mL。當(dāng)標(biāo)本嚴(yán)重溶血時(shí),如Hb濃度為10 g/L,NSE值增加的量高達(dá)325.49 ng/mL,明顯高于溶血前。經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析,每克Hb含NSE的量呈正態(tài)分布(P=0.2634),每釋放1 g/L濃度的血紅蛋白,NSE濃度增加35.62±2.17(ng/mL),這與Mastroianni等[23]的研究結(jié)果一致。ΔNSE與ΔHb的直線回歸方程顯示, NSE與 Hb呈良好相關(guān)性(r2=0.998,r2=0.996,且P<0.001)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,新生兒血清NSE檢測結(jié)果在未校正的情況下,大約有80%的新生兒結(jié)果可能被誤判,誤導(dǎo)新生兒治療。50份新生兒血清經(jīng)兩種方法校正后,超過正常參考區(qū)間的樣本比例分別 16% 和14%,兩者與溶血前檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.136,P=0.873),儀器法和HICN法高度相關(guān)(r2=0.933,P<0.001),本實(shí)驗(yàn)得出的兩種NSE校正公式相關(guān)程度較高,但儀器法應(yīng)用更加簡單方便。由于本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用人工方法模擬溶血環(huán)境,得出的結(jié)果與血清中實(shí)際結(jié)果可能不一致。因此,對(duì)于新生兒樣本,無論應(yīng)用哪一種校正公式,均需要在報(bào)告中標(biāo)注提示臨床醫(yī)生,此結(jié)果僅作為參考,不是實(shí)測結(jié)果。

4 結(jié)論

新生兒樣本NSE檢測應(yīng)當(dāng)避免溶血,由于新生兒血管纖細(xì),采血技術(shù)要求較高,容易導(dǎo)致新生兒樣本溶血,因此應(yīng)用NSE校正公式能夠幫助臨床輔助診斷相關(guān)疾病,具有一定臨床價(jià)值。