LY294002對(duì)過(guò)敏性鼻炎-哮喘綜合征大鼠氧自由基、TRPV1神經(jīng)元敏感性及TSLP表達(dá)的影響*

李麗 許翀 柴若楠

(1.中國(guó)人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院過(guò)敏反應(yīng)科,遼寧 沈陽(yáng) 110016;2.錦州醫(yī)科大學(xué)過(guò)敏反應(yīng)科,遼寧 錦州 121001)

過(guò)敏性鼻炎-哮喘綜合征( Combined allergic rhinitis and asthma syndrome,CARAS) 是一種變態(tài)反應(yīng)性疾病,近年來(lái)發(fā)病率逐年增加[1]。磷酸酰肌醇-3激酶(P13K)被證實(shí)參與CARAS的產(chǎn)生及發(fā)展[2],因此抑制PI3K對(duì)CARAS大鼠的治療至關(guān)重要。瞬時(shí)感受器電位離子通道蛋白1(Transient Receptor Potential Vanilloid type 1,TRPV1)主要定位在神經(jīng)纖維中,可受多種因素激活,其中神經(jīng)炎性介質(zhì)也可直接或者間接激活TRPV1。目前證實(shí)TRPV1參與咳嗽、疼痛、炎癥、腫瘤等的產(chǎn)生及發(fā)展[3-6]。目前已有多項(xiàng)研究證實(shí)TRPV1在過(guò)敏性鼻炎中為高表達(dá)[7-8],但具體作用機(jī)制暫未完全掌握。另外在CARAS中炎性反應(yīng)被認(rèn)為是其產(chǎn)生及發(fā)展的重要因素之一。胸腺基質(zhì)淋巴生成素(Thymicstromal lympho poietin,TSLP)是炎性反應(yīng)的啟動(dòng)因素。相關(guān)炎性因子刺激上皮細(xì)胞分泌TSLP,通過(guò)促進(jìn)樹(shù)突細(xì)胞成熟誘導(dǎo)炎性因子的釋放,最終導(dǎo)致淋巴細(xì)胞受到炎性因子浸潤(rùn),加重哮喘炎性反應(yīng)[9]。氧化應(yīng)激是CARAS的病理機(jī)制之一,會(huì)造成DNA損傷,可激活核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear transcription factor-κB,NF-κB)等,活化炎性因子,加重氣道炎性反應(yīng)[10]。但目前關(guān)于TRPV1、TSLP在CARAS中作用的相關(guān)研究鮮少,具體機(jī)制尚不明確。因此,本文旨在研究PI3K抑制劑LY294002對(duì)過(guò)敏性鼻炎-哮喘綜合征大鼠氧自由基、TRPV1神經(jīng)元敏感性及TSLP表達(dá)的影響,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD健康大鼠40只,購(gòu)自蘇州市顧秀實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備公司[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(蘇)-2019-0124],體質(zhì)量在200～300 g之間,鼠齡在6-8周,適應(yīng)飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本次實(shí)驗(yàn)已通過(guò)我院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(批號(hào):20190204)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 BCA試劑盒(上海酶聯(lián)生物公司),TSLP試劑盒(廈門(mén)侖昌碩生物科技有限公司),TSLP、NF-кB、IкB、TRPV1一抗(南京森貝伽生物公司),蘇木精染色液(廈門(mén)海標(biāo)科技有限公司),辣根過(guò)氧化物酶二抗(上海李記生物科技有限公司),SOD、MDA試劑盒(上海銘博生物科技有限公司),枸櫞酸鹽緩沖液(北京諾博萊德科技公司),凝膠成像儀(上海賀琛能源科技有限公司,型號(hào):GelSMART),酶標(biāo)儀(青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司,型號(hào):JC-1087A)。

1.3 LY294002混懸液配置 取2 mg LY294002粉末溶解于200 μL的二甲基亞礬(DMSO)中,0.9% NaCl溶液定容至6 mL,震蕩混勻。

1.4 模型建立 根據(jù)文獻(xiàn)[11]運(yùn)用卵蛋白致敏和鼻部滴注攻擊法建立過(guò)敏性鼻炎-哮喘大鼠模型:將卵白蛋白于大鼠腹腔注射2周后在連續(xù)鼻部滴注1周,建模。從初次致敏第7 d開(kāi)始運(yùn)用卵白蛋白滴鼻,10 μL/1次/d,共7 d。后隔日給予1 g/L卵白蛋白滴鼻,持續(xù)對(duì)鼻粘膜進(jìn)行刺激。每隔7 d觀察一次鼻部滴蛋白液30 min內(nèi)搔鼻次數(shù)和噴嚏次數(shù)。記錄大鼠鼻分泌物量、噴嚏次數(shù)及鼻癢程度。方法如下:①鼻涕流至前鼻孔為1分;超過(guò)前鼻孔為2分;涕流滿(mǎn)面為3分。②噴嚏4個(gè)以?xún)?nèi)為1分;5～10個(gè)為2分;10個(gè)以上為3分。③鼻癢輕度抓鼻為1分;頻繁抓為2分;不停抓為3分?？偡殖^(guò)5分為動(dòng)物造模成功。30只大鼠全部建模成功,均未發(fā)生死亡。

1.5 分組及干預(yù) 40只大鼠隨機(jī)分為健康組、模型組、治療組、對(duì)照組,每組各10只。除正常組大鼠外,其余大鼠建立過(guò)敏性鼻炎-哮喘綜合征模型。治療組:大鼠靜脈注射LY294002(0.5 mg/kg),1次/周,共8周。對(duì)照組:大鼠給予布地奈德氣霧劑(魯南貝特制藥有限公司)經(jīng)鼻吸入治療,2次/d,1～2吸/次,共8周。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水,模型組與正常組注射等量生理鹽水。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 ELISA檢測(cè)TSLP表達(dá) 治療8周后,取5 mg左右肺組織,離心5 min,1500 r/min,取上清。運(yùn)用ELISA檢測(cè)TSLP表達(dá),實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.6.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TSLP在肺組織中蛋白含量 治療8周后,取各組大鼠5 mg肺組織石蠟切片,脫蠟、脫水后PBS清洗,將肺組織切片浸染于3%過(guò)氧化氫溶液,約10 min;0.01 mol/L PBS沖洗3次,加熱至沸騰后自然冷卻,PBS沖洗,封閉0.5 h,一抗滴加TSLP抗體(1∶100稀釋),4 ℃孵育過(guò)夜;PBS(0.01 mol/L)沖洗3次,1次/5 min,在室溫下滴加稀釋度為1∶200的生物素化山羊抗兔IgG,孵育0.5 h,PBS(0.01 mol/L)沖洗3次,1次/5 min,室溫SABC試劑浸染1 h;PBS(0.01 mol/L)沖洗2次,1次/5 min,DAB顯色,蒸餾水終止,乙醇脫水,二甲苯浸染10 min(2次),中性樹(shù)膠封片,顯微鏡下觀察,用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖片分析。

1.6.3 檢測(cè)各組大鼠氧自由基相關(guān)指標(biāo)表達(dá) 治療8周后,取各組大鼠5 mg肺組織剪碎,裂解液裂解,勻漿機(jī)勻漿制成10%懸液,離心5 min,1250 r/min,后取血清。格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD,TBA法檢測(cè)MDA。

1.6.4 HE 染色觀察小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化 治療8周后,取各組大鼠10 mg肺組織,4%多聚甲醛溶液中固定,-70 ℃冰箱中凍存。將石蠟切片置于60 ℃的保溫箱中1 h,經(jīng)二甲苯及70%～100%等濃度的酒精反復(fù)脫蠟5次至水,蒸餾水清洗,蘇木素染色10 min,蒸餾水沖洗,待切片褪色適中后,蒸餾水漂洗1 h,伊紅復(fù)染后用90%和100%乙醇脫水2次,1 min/次,將切片徹底脫水,再侵入二甲苯溶液中10 min進(jìn)行透明,把樹(shù)膠滴在肺組織切片上,蓋玻片封固,200 倍光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織的病理變化。

1.6.5 免疫熒光檢測(cè)TRPV1表達(dá) 治療8周后,取各組大鼠10 mg肺組織石賭切片脫蠟,乙醇脫水后PBS沖洗,封閉1 h,PBS(0.01 mol/L)沖洗2次,1次/5 min,然后按照1∶100稀釋比例加入TRPV1一抗抗體,4 ℃孵育過(guò)夜,倒去TRPV1抗體,0.01 mol/L PBS沖洗2次,1次/5 min,加入熒光標(biāo)記二抗,室溫孵育1h,PBS蟲(chóng)死,DAPI染色,室溫孵育染色5 min,PBS沖洗,加入抗熒光泮滅封片液,蓋玻片封片后共聚焦顯微鏡下觀察。TRPV1綠色熒光,細(xì)胞核DAPI為藍(lán)色熒光;用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖片分析。

1.6.6 免疫印跡檢測(cè)NF-кB、IкB蛋白表達(dá) 10 mg肺組織剪碎后研磨,裂解液裂解后勻漿機(jī)勻漿,離心5 min,1500 r/min,取上清。BCA法測(cè)定總蛋白,調(diào)整蛋白濃度后電泳儀電泳,后將蛋白樣品轉(zhuǎn)至PVDF膜上,脫脂奶粉封閉1 h,加入NF-кB、IкB一抗4 ℃孵育過(guò)夜, PBS清洗后,加入羊抗兔二抗室溫孵育 2 h,PBS清洗,ECL法顯色,凝膠成像儀觀察,以 Image J 分析各組蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清及肺組織中TSLP表達(dá) 與健康組相比,模型組大鼠血清中TSLP及肺組織蛋白含量的表達(dá)升高(P<0.05),與模型組相比,治療組與對(duì)照組大鼠血清中TSLP及肺組織蛋白含量的表達(dá)降低(P<0.05),治療組與對(duì)照組大鼠血清及肺組織中TSLP表達(dá)對(duì)比無(wú)差異(P>0.05),見(jiàn)表1、圖1。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組中TSLP蛋白含量(200×)

2.2 各組大鼠氧自由基相關(guān)指標(biāo)表達(dá) 與健康組相比,模型組大鼠肺組織中氧自由基相關(guān)指標(biāo)SOD表達(dá)降低、MSA表達(dá)升高(P<0.05);與模型組相比,治療組與對(duì)照組SOD表達(dá)升高、MDA表達(dá)降低(P<0.05);SOD、MDA在治療組與對(duì)照組中的表達(dá)無(wú)差異(P>0.05),見(jiàn)表2、圖2。

表2 各組大鼠SOD、MDA表達(dá)對(duì)比

圖2 各組大鼠SOD、MDA表達(dá)對(duì)比

2.3 各組大鼠肺組織病理形態(tài) 與健康組相比,模型組大鼠肺組織中支氣管及管壁產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞,支氣管黏膜水腫、增厚,管腔狹窄,黏液分泌增多;與模型組比較,治療組與對(duì)照組肺組織病理明顯有所改善,見(jiàn)圖3。

圖3 HE染色觀察各組大鼠肺組織病理形態(tài)(200×)

2.4 各組大鼠肺組織TRPV1表達(dá) 與健康組相比,模型組大鼠肺組織中TRPV1蛋白含量明顯增加(P<0.05),與模型組相比,治療組與對(duì)照組TRPV1蛋白含量明顯降低(P<0.05),見(jiàn)圖4A、B。

圖4 各組大鼠肺組織TRPV1表達(dá)

2.5 各組大鼠肺組織NF-кB、IкB蛋白表達(dá) 與健康組相比,模型組大鼠肺組織中NF-кB蛋白表達(dá)升高、IкB蛋白表達(dá)降低(P<0.05);與模型組相比,治療組與對(duì)照組NF-кB表達(dá)降低、IкB表達(dá)升高(P<0.05);NF-кB、IкB在治療組與對(duì)照組中的表達(dá)無(wú)差異(P>0.05),見(jiàn)表3、圖5。

表3 各組大鼠NF-кB、IкB蛋白表達(dá)對(duì)比

圖5 免疫印跡檢測(cè)各組大鼠NF-кB、IкB蛋白表達(dá)對(duì)比

3 討論

CARAS會(huì)使氣道通氣阻力增加,其在發(fā)病過(guò)程中會(huì)釋放大量炎性介質(zhì),此時(shí)機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基。氧自由基會(huì)造成機(jī)體細(xì)胞及組織等損傷,增加自由基的產(chǎn)生,從而導(dǎo)致SOD等拮抗物消耗增加,引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)使得MDA增加,形成惡性循環(huán)損傷氣道,從而加重炎性反應(yīng),致使氣道炎癥發(fā)生[12]。因此,清除過(guò)多的氧自由基和氧化反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)CARAS的治療至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn),活性氧能夠激活PI3K/AKT信號(hào)通路,促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子,如NF-кB的激活[13]。NF-кB激活后誘導(dǎo)白介素-4等促炎細(xì)胞因子的表達(dá),導(dǎo)致氣道纖維化,平滑肌細(xì)胞增殖等進(jìn)一步加重哮喘。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與健康大鼠相比,模型大鼠體內(nèi)SOD表達(dá)降低、MDA升高,在經(jīng)過(guò)PI3K抑制劑LY294002干預(yù)后SOD表達(dá)升高、MDA降低,且為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性,本文運(yùn)用治療過(guò)敏性鼻炎-哮喘綜合征較為成熟的藥物布地奈德進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)治療組與對(duì)照組SOD、MDA表達(dá)對(duì)比無(wú)意義,提示LY294002具有維持氧自由基生成與清除的動(dòng)態(tài)平衡,可能是治療CARAS的作用機(jī)制。

TRPV1可對(duì)多種有害刺激做出反應(yīng)[14]。TRPV1可增加咳嗽的敏感性,與咳嗽反應(yīng)強(qiáng)度呈正相關(guān)。當(dāng)呼吸道受到感染后前列腺素E2合成增加并與其受體結(jié)合,通過(guò)相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo),活化TRPV1通道。氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)刺激TRPV1的主要因素。被活性氧消化還原的谷胱甘肽可增加蛋白激酶C的活化,活化的該指標(biāo)可磷酸化TRPV1,TRPV1活化后導(dǎo)致神經(jīng)末梢釋放神介質(zhì)如SP增加,SP增加會(huì)刺激氣道引起咳嗽[15]。丁惠娟等[16]研究提示,在坐骨神經(jīng)慢性結(jié)扎損傷模型中,PI3K/Akt通過(guò)上調(diào)TRPV1的表達(dá),參與CCI致神經(jīng)病理性疼痛的形成。Liu等[17]在對(duì)腦損傷大鼠的實(shí)驗(yàn)研究中提出,通過(guò)刺激通過(guò)TRPV1表達(dá)后可激活PI3K/Akt信號(hào)通路,從而誘導(dǎo)腦損傷,抑制TRPV1表達(dá)后,PI3K/Akt激活受到抑制,有助于緩解腦損傷嚴(yán)重情況。上述研究均提示,PI3K/Akt通路與TRPV1可相互調(diào)節(jié),具有一定的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與健康大鼠相比,模型大鼠TRPVV1表達(dá)顯著增加,在經(jīng)過(guò)給予PI3K抑制劑LY294002后,TRPV1表達(dá)顯著下降,提示LY294002可抑制TRPV1表達(dá),從而降低過(guò)敏性鼻炎-哮喘綜合征大鼠氣道神經(jīng)源性炎癥,最終達(dá)到治療該病的效果。

過(guò)敏性炎癥中多種因素均可刺激TSLP表達(dá),其中NF-кB通路是調(diào)控TSLP表達(dá)的重要機(jī)制[18]。研究提示,TNF-α通過(guò)刺激NF-кB通路,從而誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞分泌TSLP;IкB升高或NF-кB信號(hào)抑制劑干預(yù),則減少上皮細(xì)胞表達(dá)TSLP[19]。另有研究證實(shí),人基因啟動(dòng)子位點(diǎn)含有NF-кB的結(jié)合位點(diǎn)是TSLP蛋白表達(dá)所必需的[20]。此外,NF-кB通路通過(guò)調(diào)控相關(guān)促炎因子等的表達(dá)促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞中TSLP的表達(dá),最終引起呼吸道炎癥產(chǎn)生。在敲除TSLP和過(guò)表達(dá)TSLP的動(dòng)物模型上,過(guò)表達(dá)TSLP肺組織炎性反應(yīng)增加并伴有氣道高反應(yīng)產(chǎn)生,而在TSLP敲除小鼠肺組織中沒(méi)有產(chǎn)生明顯的過(guò)敏性哮喘相關(guān)癥狀。以上結(jié)論均提示,NF-кB通路可刺激TSLP表達(dá)升高,從而引起肺組織炎癥產(chǎn)生,誘發(fā)氣道高反應(yīng)性產(chǎn)生。研究還發(fā)現(xiàn),P13K是多種信號(hào)通路的關(guān)鍵分子,影響炎性細(xì)胞的募集、激活及凋亡等[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與健康大鼠相比,模型組TSLP、NF-кB升高,IкB降低,在經(jīng)過(guò)PI3K抑制劑LY294002干預(yù)后,TSLP、NF-кB降低,IкB升高。劉雙等[22]研究提示,AKT通過(guò)刺激IкB磷酸化,從而激活NF-кB使其磷酸化,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用,從而調(diào)控炎癥因子的合成和釋放。結(jié)合上述結(jié)論,本研究認(rèn)為,LY294002通過(guò)抑制PI3K水平,降低了NF-кB的活性,并抑制IкB的降解,從而抑制了TSLP的表達(dá),防止氣道高反應(yīng)性的產(chǎn)生,阻滯疾病惡性發(fā)展。

4 結(jié)論

綜上所述,通過(guò)抑制TRPV1、TSLP、MDA并促進(jìn)SOD表達(dá),降低了CARAS大鼠氣道神經(jīng)源性炎癥、防止氣道高反應(yīng)性的產(chǎn)生并改善了氧化應(yīng)激損傷及病理水平,從而發(fā)揮治療作用。