CGA抑制ERS減緩高FAs引起的犢牛肝細(xì)胞脂沉積

尹鈺鋒,李 銘,張 偉,何雨欣,楊 威,王桂華,余麗蕓,張冰冰*,徐 闖*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動物科技學(xué)院,黑龍江 大慶 163319;2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,黑龍江 大慶 163319)

圍產(chǎn)期奶牛在懷孕后期至泌乳前期由于干物質(zhì)攝入不足,泌乳需求增加,導(dǎo)致能量負(fù)平衡,大量非酯化脂肪酸通過血液循環(huán)進(jìn)入肝臟。經(jīng)過不完全氧化和再酯化后,在脂酰輔酶A合成酶的作用下形成大量的游離脂肪酸(fatty acid,FAs),大部分的FAs作為能量燃料都被徹底氧化滿足肝細(xì)胞的供能,以滿足其能量需要。而過量的會生成酮體使血酮含量升高,且會酯化為合成脂肪的組成成分,從而造成脂沉積。根據(jù)非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的“二次打擊”學(xué)說,脂沉積是由血液和肝臟中NEFA升高以及氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙引起的[1]。在非反芻動物中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)和氧化應(yīng)激與脂肪肝高度相關(guān),包括胰島素抵抗、脂毒性、炎癥和脂肪變性?；钚匝?ROS)的產(chǎn)生與二次打擊在NAFLD的形成過程中起關(guān)鍵作用。本研究團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn),高FAs引起ERS導(dǎo)致犢牛肝細(xì)胞形成脂沉積。

綠原酸(CGA)主要存在于中藥金銀花、山楂、杜仲、菊花和咖啡中。研究表明,CGA作為清除自由基的物質(zhì),具有抗氧化和抗炎作用,也可能影響代謝紊亂時的糖脂代謝。然而,CGA對奶牛脂肪肝的保護(hù)機(jī)制尚未得到充分的研究。因此,本研究為了探明CGA抑制ERS減緩高FAs引起的犢牛肝細(xì)胞脂沉積,從奶牛脂肪肝背景出發(fā),探討CGA緩解由高FAs引起ERS從而導(dǎo)致犢牛肝細(xì)胞脂沉積的機(jī)制,深入研究CGA能否對脂肪肝的形成起到保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物自黑龍江省大慶市的奶牛養(yǎng)殖場選取1日齡健康荷斯坦奶牛4頭(42.5～45 kg,禁食)。

1.2 藥品和試劑配制二甲基亞砜(DMSO)、地塞米松、RPMI-1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司;雙抗、Ⅳ型膠原酶(Sigma)、BSA、青鏈霉素均購自康為世紀(jì)生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Fast Start Universal SYBR Green Master(ROX)、胎牛血清、DEPC水、HRP標(biāo)記二抗、顯影發(fā)光液均購自碧云天生物技術(shù)有限公司;TRIzol、FAss均購自Sigma公司;激活轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)、ER類似激酶(pancreatic elf-2 kinase pancreatic ER kinase,PERK)、肌醇依賴酶1(inositol requiring enzyme1,IRE1)、C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)、78 kDa葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP78)、FAS、SREBP、ACC1、Orai1、β-actin抗體購自CST公司;彩虹Marker、二硫蘇糖醇(DTT)、十二烷基硫酸鈉(SDS)均購自索萊寶生物技術(shù)有限公司。灌流液A:140 mmol/L NaCl,6.7 mmol/L KCl,10 mmol/L HEPES,2.5 mmol/L 葡萄糖,0.5 mmol/L EDTA,pH7.4;灌流液B:140 mmol/L NaCl,6.7 mmol/L KCl,30 mmol/L HEPES,2.5 mmol/L 葡萄糖,5 mmol/L CaCl2,pH7.4;灌流液C:在灌流液B中添加50 g/L Ⅳ型膠原酶,使含0.2 g/L膠原酶。

1.3 主要儀器超凈工作臺,北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,德國Binder公司;熒光定量PCR擴(kuò)增儀,美國Bio Rad公司;低溫高速離心機(jī),美國Sigma公司。

1.4 犢牛肝細(xì)胞分離培養(yǎng)靜脈注射肝素納(1 500 IU/kg),頸靜脈注射硫戊巴比妥鈉麻醉,打開腹腔,用手術(shù)刀取出犢牛肝臟尾狀突(caudate process) 移至超凈工作臺中,用37℃預(yù)熱的灌流液A將表面沖洗干凈,露出血管,灌注37℃預(yù)熱的灌流液A,然后灌注37℃預(yù)熱的灌流液B,最后灌入37℃預(yù)熱的灌流液C。加入50 mL預(yù)冷的含0.2% BSA的基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化,剔除血管、脂肪和結(jié)締組織,剪碎肝組織,分別過100目(150 μm)、200目(75 μm)及500目(30 μm)細(xì)胞篩,所得肝細(xì)胞懸液用基礎(chǔ)培養(yǎng)液清洗2次(4℃、50 r/min離心2 min),用貼壁培養(yǎng)液重懸,臺盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞活率,血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)。細(xì)胞計數(shù)后,用貼壁培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液密度調(diào)整為5×105個/mL,在6孔板中接種2 mL,于37℃、5% CO2和飽和濕度的條件下培養(yǎng),4 h后換液,每孔換成3 mL生長培養(yǎng)基(1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基含10%胎牛血清及1%雙抗),以后每24 h換液1次。

1.5 CGA對高FAs介導(dǎo)ERS的影響將細(xì)胞分為CON組、FAs組、CGA組、CGA+FAs組,共4組。將細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中,空白對照組每孔加入2 mL BSA培養(yǎng)24 h;FAs組培養(yǎng)于2 mL BSA中,12 h后加入FAs刺激12 h;CGA組培養(yǎng)于含2% BSA的DMEM培養(yǎng)基中加入CGA刺激12 h;CGA+FAs組加入CGA刺激12 h后,加FAs培養(yǎng)于含2% BSA的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h,進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.6 CGA緩解由ERS導(dǎo)致的犢牛肝細(xì)胞脂沉積毒胡蘿卜素(thapsigargin,TG)是一種非競爭性、細(xì)胞膜滲透性的SERCAs介導(dǎo)的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑,可有效地誘導(dǎo)ERS,在試驗中可作為有效的ERS激活劑。將細(xì)胞分為CON組、TG組、CGA組、CGA+TG組,共4組。將細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中,空白對照組每孔加入2 mL BSA培養(yǎng)24 h;TG組培養(yǎng)與2 mL BSA中,12 h后加入TG刺激12 h;CGA組培養(yǎng)于含2% BSA的DMEM培養(yǎng)基中加入CGA刺激12 h;CGA+TG組加入CGA刺激12 h后,加TG培養(yǎng)于含2% BSA的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h,進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.7 Western blot檢測ERS與脂合成相關(guān)蛋白水平收樣獲取待測細(xì)胞,細(xì)胞沉淀加入適量蛋白裂解液振蕩離心后于-80℃凍融,收集總蛋白并通過SDS-PAGE分離,隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,并在室溫下用5%脫脂乳/Tris緩沖鹽水/吐溫-20(TBST)封閉1 h。將膜與多克隆兔抗PERK抗體(1∶1 000,溶于含5% BSA的TBST中)兔抗IRE1(1∶1 000溶于5% BSA的TBST溶液)、兔抗ATF6(1∶1 000溶于5% BSA的TBST溶液)、小鼠抗GRP78(1∶250溶于5% BSA的TBST溶液)、小鼠抗CHOP(1∶1 000溶于5% BSA的TBST溶液)、兔抗FAS(1∶1 000溶于5% BSA的TBST溶液)、鼠抗SREBP(1∶500溶于5% BSA的TBST溶液)、兔抗ACC1(1∶1 000溶于5% BSA的TBST溶液)、在4℃下孵育過夜。用HRP標(biāo)記的羊抗兔/小鼠二抗(3∶5 000)室溫孵育1 h后,用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(beyotime)顯示條帶。采用Image J軟件進(jìn)行光密度分析。對蛋白表達(dá)進(jìn)行定量,并以β-actin抗體(3∶5 000,細(xì)胞信號)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.8 脂滴染色將細(xì)胞按所需細(xì)胞數(shù)均勻鋪在小皿中并置于6孔板內(nèi),培養(yǎng)時分別加FAs與TG兩種刺激,然后添加CGA收樣制備待測細(xì)胞。細(xì)胞爬片用PBS沖洗3遍。2.4%預(yù)冷的多聚甲醛固定20 min,PBS沖洗3遍。3% Triton X-100通透10 min,PBS沖洗3遍。與二抗相同宿主的血清(一般是BSA)封閉30 min,PBS沖洗3遍。一抗4℃濕盒過夜(一般在6孔板周圍加PBS即可),也可37℃孵育2 h,但前者好一些,PBS沖洗3遍。二抗37℃、2 h(避光),PBS沖洗3遍。DAPI染核(3～5 min 即可),PBS沖洗3遍,用濾紙吸去多余水分,上機(jī)檢測。

2 結(jié)果

2.1 CGA對高FAs誘導(dǎo)犢牛肝細(xì)胞脂合成的影響結(jié)果如圖1所示,添加FAs組的蛋白表達(dá)量及脂滴分布狀態(tài)均高于CTRL組,添加CGA+FAs組的脂合成相關(guān)引物的蛋白表達(dá)量以及脂滴分布狀態(tài)均較FAs組呈下降趨勢(P<0.01)。結(jié)果表明,FAs可以增加犢牛干細(xì)胞的脂合成,而CGA對高FAs促進(jìn)犢牛肝細(xì)胞脂合成的過程有顯著的抑制作用。

2.2 CGA對高FAs誘導(dǎo)犢牛肝細(xì)胞ERS的影響結(jié)果如圖2所示,添加FAs組的ERS相關(guān)基因的蛋白表達(dá)量均高于CTRL組,添加CGA+FAs組的ERS相關(guān)基因的蛋白表達(dá)量較FAs組呈下降趨勢(P<0.05)。結(jié)果表明,FAs可以增加犢牛干細(xì)胞的ERS,而CGA對高FAs促進(jìn)犢牛肝細(xì)胞ERS的過程有顯著的抑制作用。

2.3 CGA對TG誘導(dǎo)犢牛肝細(xì)胞脂合成水平的影響結(jié)果如圖3所示,添加TG組的蛋白表達(dá)量及脂滴分布狀態(tài)均高于CTRL組,添加CGA+TG組的脂合成相關(guān)引物的蛋白表達(dá)量以及脂滴分布狀態(tài)均較TG組呈下降趨勢(P<0.05)。結(jié)果表明,TG可以增加犢牛干細(xì)胞的脂合成,而CGA對高TG促進(jìn)犢牛肝細(xì)胞脂合成的過程有顯著的抑制作用。因此CGA可以緩解TG刺激下由ERS導(dǎo)致的犢牛肝細(xì)胞脂合成升高。

*．與對照組相比差異顯著(P<0.05);**,##．與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。下同

圖2 CGA對高FAs誘導(dǎo)犢牛肝細(xì)胞ERS的影響

2.4 CGA對TG誘導(dǎo)犢牛肝細(xì)胞ERS水平的影響結(jié)果如圖4所示,添加TG組的ERS相關(guān)基因的蛋白表達(dá)量均高于CTRL組,添加CGA+TG組的ERS相關(guān)基因的蛋白表達(dá)量較TG組呈下降趨勢(P<0.05)。結(jié)果表明,TG可以增加犢牛干細(xì)胞的ERS,而CGA對TG促進(jìn)犢牛肝細(xì)胞ERS的過程有顯著的抑制作用。

圖4 CGA對TG誘導(dǎo)犢牛肝細(xì)胞ERS水平的影響

3 討論

肝臟是奶牛體內(nèi)最大的一個合成工廠,每時每刻都進(jìn)行著多種多樣的、復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)。因此肝臟承擔(dān)的任務(wù)非常繁重,其承擔(dān)著脂肪的合成和釋放、脂肪酸分解﹑酮體生成與氧化、膽固醇與磷脂的合成、脂蛋白合成和運(yùn)輸?shù)萚2]。奶牛體內(nèi)血脂的各種成分是相對恒定的,其比例靠肝細(xì)胞調(diào)節(jié);當(dāng)脂肪代謝紊亂時,可使脂肪堆積于肝臟內(nèi)形成脂肪肝。目前對于奶牛脂肪肝疾病的治療辦法甚少,中藥提取物對于改善奶牛脂肪肝可能具有卓越的療效。

本研究采用犢牛肝細(xì)胞作為研究對象,探討CGA緩解由高FAs引起ERS從而導(dǎo)致犢牛肝細(xì)胞脂沉積的機(jī)制,深入研究CGA能否對脂肪肝的形成起到保護(hù)作用。試驗數(shù)據(jù)表明CGA可以有效緩解由FAs介導(dǎo)的脂合成升高,當(dāng)添加ERS激活劑TG刺激后,研究發(fā)現(xiàn)ERS指標(biāo)的蛋白表達(dá)量以及脂滴分布均有升高,并且CGA可以緩解由TG介導(dǎo)的ERS,因此CGA緩解犢牛肝細(xì)胞脂沉積是通過調(diào)控ERS途徑完成的。

CGA主要存在于中藥金銀花、山楂、杜仲、菊花和咖啡中,具有廣泛的生物活性,現(xiàn)代科學(xué)對CGA生物活性的研究已深入到食品、保健、醫(yī)藥和日用化工等多個領(lǐng)域。研究表明,CGA及其衍生物具有比抗壞血酸、咖啡酸和維生素E更強(qiáng)的自由基清除效果,可有效清除羥基自由基和超氧陰離子自由基,還可抑制低密度脂蛋白的氧化。CGA除了具有清除自由基的作用外,還具有抗氧化和抗炎作用,并可能影響代謝紊亂中的脂糖代謝。CGA是一種有效的酚型抗氧化劑,其抗氧化能力要強(qiáng)于咖啡酸、對羥苯酸、阿魏酸、丁香酸、丁基羥基茴香醚(BHA)和生育酚。CGA之所以有抗氧化作用,是因為其含有一定量的R-OH基,能形成具有抗氧化作用的氫自由基,以消除羥基自由基和超氧陰離子等自由基的活性,從而保護(hù)組織免受氧化作用的損害。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)功能的正常發(fā)揮是細(xì)胞存活的必要條件,蛋白質(zhì)大多數(shù)都是通過ER在正常的生理變化和對環(huán)境的適應(yīng)表現(xiàn)兩方面來調(diào)節(jié)表達(dá)量的變化。ER膜上存在著3種ER跨膜受體感應(yīng)蛋白分別是IRE1、RNA激活蛋白激酶的PERK和ATF6[3]。IRE1α具有蛋白激酶活性和位點特異性內(nèi)切核糖核酸酶(RNase)活性[4]。PERK還具有蛋白激酶活性并起到磷酸化真核翻譯起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α,eIF2α)的α亞基的作用[5]。ATF6是屬于cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)和ATF家族轉(zhuǎn)錄因子的堿性亮氨酸拉鏈(basic region/leucine zipper motif,bZIP)-結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子[6]。在靜息細(xì)胞中,ERS受體與ER分子伴侶GRP78/Bip結(jié)合處于未激活狀態(tài)。當(dāng)未折疊蛋白(unfolded protein,UP)大量蓄積時,GRP78/Bip與ER膜上的受體分離并開始與非正常蛋白質(zhì)結(jié)合。未折疊的蛋白反應(yīng)(UPR)是在ER膜受體蛋白與GRP78/Bip解離后發(fā)生專屬激活通路。ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要由C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)介導(dǎo),但是CHOP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制仍然不清楚。然而,已經(jīng)顯示CHOP誘導(dǎo)促進(jìn)應(yīng)激細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成和氧化應(yīng)激的許多促凋亡因子(如TRB3、BIM和GA化并與磷酸化的IRE1、PERK及從ER膜上的ATF6被特異蛋白酶催化成有活性的ATF6觸發(fā)形DD34)的表達(dá)[7]。

ERS能加劇肝細(xì)胞脂質(zhì)的合成。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP-1c)是ER上合成的關(guān)鍵脂合成轉(zhuǎn)錄因子,受其調(diào)控的靶基因包括乙酰輔酶A羧化酶α(ACACA)、脂肪酸合酶(FASN)和二酯酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT)等,這些酶直接參與脂質(zhì)的合成,是脂合成的限速酶,在肝細(xì)胞脂代謝穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[8]。不論是正常的生理變化還是對環(huán)境的適應(yīng)表現(xiàn),蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化大都是通過ER的調(diào)節(jié)來實現(xiàn)的[9]。在缺氧、藥物作用、自由基侵入等刺激下,ER的正常功能被打亂,大量蛋白質(zhì)被錯誤的折疊,導(dǎo)致大量UP堆積在ER中,促使ER啟動應(yīng)急機(jī)制來緩解未折疊蛋白產(chǎn)生的壓力,其他外部刺激的改變可能會誘導(dǎo)ERS反應(yīng),這種應(yīng)激反應(yīng)通過管腔內(nèi)UPR表現(xiàn)出來以恢復(fù)穩(wěn)態(tài)[10]。UPR具有3個分支:RNA激活蛋白激酶的PERK分支、IRE1α分支和ATF6分支[11]。PERK、IRE1和ATF6的豐度以及UPR的幾個下游基因的mRNA,如GRP78,均是ERS的指標(biāo)[12],而CHOP是一種凋亡的轉(zhuǎn)錄因子在沒有刺激的情況下以低水平表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞暴露于應(yīng)激源時,CHOP的豐度被上調(diào)。因此,本試驗?zāi)康氖鞘褂脿倥５脑渭?xì)胞(易于分離和培養(yǎng)),并用高濃度FAs進(jìn)行刺激,檢測ERS相關(guān)指標(biāo)。顯然,隨著ERS標(biāo)志分子PERK、IRE1、ATF6、GRP78和CHOP的上調(diào)表明,FAs可以誘導(dǎo)犢牛肝細(xì)胞的ER應(yīng)激。

本研究結(jié)果表明,CGA對緩解犢牛肝細(xì)胞脂沉積有顯著作用,為中草藥輔料的研究開發(fā)提供了試驗依據(jù),也為治療奶牛脂肪肝疾病藥物的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。而ERS的發(fā)生與奶牛肝細(xì)胞脂質(zhì)損傷的關(guān)系密不可分,故試驗中添加ERS激活劑TG,通過CGA對ERS的緩解來進(jìn)一步驗證其對脂肪肝的治療機(jī)制。綜上所述,CGA抑制ERS減緩高FAs引起的犢牛肝細(xì)胞脂沉積。